胶原蛋白提取

学院：生物科学与工程学院专业：生物工程姓名：李秀莉学号：120302214外文出处：FoodChemistry190(2023)186-193附件：1.外文资料翻译译文；2.外文原文。指导教师评语：该同学外语水平好，翻译流畅，专业知识及汉语水平较好，翻译用心。希望今后能更多阅读英文文献。签名：周晓辉2023年4月28日附件1：外文资料翻译译文响应面优化蛋壳膜中胃蛋白酶溶性胶原蛋白提取工艺关键词：蛋壳膜、响应面优化法、胃蛋白酶溶性胶原蛋白摘要：本文利用响应面优化法（RSM）确定了自变量对蛋壳膜中胃蛋白酶溶性胶原蛋白（PSC）提取产率的影响。采用中心复合设计（CCD）的实验设计和结果分析方法，选取最有可能的条件范围进行了优化实验：NaOH浓度（X1：0.4-1.2mol/L）,碱处理时间（X2：6-30h），酶浓度（X3：15-75U/mg）以及水解时间（X4：12-60h）。实验数据用适当的统计学方法通过多元线性回归分析得到一个二阶多项式方程，分析表明最佳提取条件为：NaOH浓度为0.76mol/L，碱处理时间为18h，酶浓度为50U/mg，水解时间为43.42h。在最佳提取条件下的提取率实验值是30.049%，这与预测值30.054%高度一致。1.前言胶原蛋白是脊椎动物的主要结构蛋白，大约占一个动物总蛋白的30%（Muyonga,Cole,&Duodo,2004)。胶原蛋白的分子结构由三个多肽α-链扭曲在一起形成的一个三股螺旋体。在所有胶原蛋白的“胶原域”都发现了(Gly-X-Y)n重复。X和Y的位置往往分别被脯氨酸和羟脯氨酸占用（Gelse,Poschl,&Aigener,2003）。目前，至少已有27中胶原蛋白类型已确定，其氨基酸序列、分子结构和功能明显不同（Canty&Kadler,2005;Cheng,Hsu,Chang,Lin,&Sakata,2023）。胶原蛋白已被广泛用作医药、化妆品、生物医学和食品行业的材料（Chengetal.,2023）。一般来说，工业应用的胶原蛋白的主要来源是牛与猪的皮肤和骨头。然而，阮病毒疾病的爆发，如海绵脑病（BSE），传染性海绵脑病（TSE）和口蹄疫（FMD），以及禽流感，导致一些消费者对从这些动物体提取的胶原蛋白和胶原蛋白产品的担忧。此外，以猪为原料提取胶原蛋白不能被犹太人和穆斯林接收（Liu,Liang,Regenstein,&Zhou,2023;Regenstein&Zhou,2007）。因此，全球对胶原蛋白的代替原料的需求增加了，如水生动物。但是，关于胶原蛋白提取的其他来源的信息是有限的。蛋壳作为副产品大约占了一个鸡蛋总重量（60g）的10%（Nys,Bain,&Immerseel,2023）。据估计每年在伊朗蛋制品工业都产生100000吨的蛋壳。蛋壳膜存在于白色液体和固体蛋壳内表面之间。胶原蛋白占蛋壳膜总蛋白含量的10%（MacNeil,2006）。在蛋壳膜中已经确定含有Ⅰ型、Ⅴ型和Ⅹ型胶原蛋白（Ariasetal.,1992）。经生化、细胞毒性与基因毒性检测，在自身免疫性风险和消费的过敏反应中蛋壳膜胶原蛋白是安全的（Ruff,Endres,Clewell,Szabo,&Schauss,2023）。因此，蛋壳膜加工的副产品，是胶原蛋白的重要来源，有可能取代哺乳动物来源。通过优化提取工艺获得高收益的蛋壳膜胶原蛋白是很重要的。乙酸和蛋白酶浓度、反应时间、PH值包括NaOH浓度、碱处理时间和提取温度都是影响胶原蛋白提取率以及提取的胶原蛋白功能性质的重要变量。响应面法（RSM）可以用来进行提取方法的优化。RSM是一种集数学和统计技术于一身并广泛应用于食品行业评估预测独立变量和相关变量之间关系的方法（Box&Wilson,1951）。RSM的主要优势是在需要评估多个变量及其交互作用时减少实验的数量，因此RSM比其他方法更省时省力（Wu,Cui,Tang,&Gu,2007）。关于从水生动物中提取胶原蛋白优化的研究早有报道（Wang,Yang,Du,Yang,&Liu,2023;Woo,Yua,Cho,Lee,&Kim,2023）。这些研究表明，RSM在提取胶原蛋白的最佳条件的研究上是有效的。至今还没有关于蛋壳膜胶原蛋白提取优化的报道。因此，本工作的目的就是用RSM对蛋壳膜中酶溶性胶原蛋白（PSC）提取条件的优化。本研究调查的是关键处理变量（NaOH浓度、碱处理时间、酶浓度和水解时间）对PSC提取率的影响，并确定从蛋壳膜中提取PSC的最佳条件。2.材料与方法2.1.材料和化学试剂未加工的蛋壳膜来源于商业。仔细的手动去除外膜并用蒸馏水洗净。酶活为750U/mg的胃蛋白酶是从SigmaAldrichCo.（St.Louis,US）购买的。NaCl、乙酸、NaOH和三（羟甲基）氨基甲烷是从Merck(Darmstadt,Germany)购买的。本研究中所使用的所有试剂均为分析级。2.2.蛋壳膜中酶溶性胶原蛋白的提取PSC是从蛋壳膜中用Kittiphattanabawon,Benjiakul,Visessanguan,Nagai,andTanaka(2005)andLiuetal.(2023)提出的方法并稍加改进之后提取出来的。准确称取5g的新鲜蛋壳膜。蛋壳膜用10倍质量体积比（V/W）的碱性溶液（0.2-1.2mol/LNaOH）搅拌处理6-36h，每2h更换一次碱液，除去杂蛋白。然后弃上清，碱处理过的样品用蒸馏水清洗直至PH成中性。提取PSC时，将预处理的蛋壳膜浸泡在0.5mol/L的乙酸与胃蛋白酶（15-90U/mg）抽提液中搅拌处理12-72h。胃蛋白酶的量以酶活计。混合物用两层纱布过滤以除去未溶解的碎片。该溶液用0.05mol/L的Tris(PH=7.0)以及终浓度2mol/L的NaCl盐析。在30000g的离心力下5℃左右离心40min得到沉淀；然后用10倍质量体积比的0.5mol/L的醋酸溶解沉淀。最终的溶液用分子量12KDa的透析膜在4℃的冷水中透析12h，每4h换一次透析液。然后将溶液用冻干机冷冻干燥（ALPHA2-4;Christ,Harz,Germany）。从这个角度讲提取物为胃蛋白酶溶性胶原蛋白（PSC）。PSC的得率是在蛋壳膜清洗后的重量基础上的百分比。PSC的得率计算式如下：（1）2.3.实验设计与统计分析首先，通过改变单一因素影响PSC的总收率来确定提取的初步范围变量：NaOH浓度、碱处理时间、酶浓度和水解时间。然后，用RSM对提取参数进行优化。为确定独立变量对反应的交互影响，做四因素五水平的中心复合设计（CCD）。自变量的范围以及水平已由Table1给出。自变量及其水平的选择以初步实验的结果为基础。提取率为因变量。对于统计计算，变量进行编码之后根据方程：（2）是变量的编码值；是变量的实际值；是在中心水平的实际值；是阶跃变量。如表2所示，实验设计的CCD的30个实验点是随机组成的（16个因子点、8个轴向点和6个中心点）。设计中心的六次重复（处理时间25-30h）是被用来估计纯误差的平方和的。以CCD数据进行多元线性回归分析符合下列二次多项式：（3）代表因变量（胶原蛋白产量，%）；是一个常数；、和是回归系数；和是自变量水平。实验数据经线性回归可得到响应面图和等高线图的回归模型。这些响应面和等高线图能够直观的反应每一个实验因素水平与反应之间的关系，并确定最优条件（Lu,Engelmann,Lila,&Erdman,2023）。Design-Expert8.1.3(trialversion,State-EaseInc.,Minneapolis,USA)是一款用于计算二次多项式模型和优化的系数的软件。当P值小于0.05时认为具有统计学意义。每个数据都要测定三次取平均值。3.结果与讨论3.1.单因素实验结果3.1.1.NaOH浓度对胶原蛋白提取率的影响NaOH浓度对PSC提取率的影响如Fig.1a所示。提取时其他条件一定：酶浓度45U/mg、水解时间36h、碱处理时间18h，而以NaOH浓度（0.2，0.4，0.6，0.8，1和1.2mol/L）为变量进行。随着NaOH浓度的增加，提取率迅速增加，在0.7-0.8mol/L时达到高峰。然后提取率显著下降（在0.8mol/l以上），可能是由于结构的破坏和PSC的分解。因此，本文取0.8mol/L的NaOH浓度进行下一步实验。3.1.2.碱处理时间对胶原蛋白提取率的影响碱处理时间对PSC的提取率的影响如Fig.1b所示。碱处理时间分别被设定为6，12，18，24，30和36h；其他实验条件固定如下：NaOH浓度为0.8mol/L，酶浓度45U/mg，水解时间36h。从Fig.1b中可以看出在6~18h内产量随碱处理时间增加而增加，紧接着随碱处理时间的增加而减少。因此，18h时获得PSC的最大提取率。3.1.3.酶浓度对胶原蛋白提取率的影响为了研究酶浓度对PSC提取率的影响，提取使用不同的酶浓度进行：15，30，45，60，75和90U/mg。其他三个提取参数固定：NaOH浓度0.8mol/L，水解时间36h，碱处理时间18h（Fig.1c）。当酶浓度从15到45U/mg增加时PSC的提取率从22.5%显著增加到30.9%，然后当酶浓度超过45U/mg后提取率智慧稍微增加。在酶浓度为45U/mg时PSC提取率依然很高，但是增加没弄都会导致工业提取工艺成本提高（Ye&Jiang，2023）。所以，45-60U/mg被认为是PSC提取的最佳条件。3.1.4.水解时间对胶原蛋白提取率的影响水解时间对胶原蛋白提取率的影响可能是当胃蛋白酶打开专门的蛋壳膜胶原蛋白肽区时时间有利于PSC暴露于抽提介质。这一作用可以溶解胶原蛋白，并使其从材料中扩散出来。Fig.2d显示水解时间对PSC提取率的影响。其他提取参数设定如下：NaOH浓度0.8mol/L，酶浓度45U/mg，碱处理时间为18h。在水解时间从12增加到48h时，提取率的方差相对快速而且PSC产量高达29.6%；提取过程将在这个水平进行。因此，36-48h的范围被认为是提取的最佳水解时间。基质中的质量传递速率是决定提取率的关键因素。换句话说，胶原蛋白从蛋壳膜基质中到大量抽提介质中的释放率是与时间有关的。因此，预计PSC的产率将继续随着时间的延长而升高。这就解释了水解时间从36到48h对胶原蛋白产量的正效应。换句话说，PSC饱和溶剂导致了酶活性的降低进而导致了水解时间48h以后提取率的降低。根据单因子实验，NaOH浓度选0.4-1.2mol/L,碱处理时间选6-30h，酶浓度选15-75U/mg，水解时间选12-60h进行RSM实验。3.2.胶原蛋白提取参数的优化3.2.1.模型拟合四个独立变量的范围和中心点的值都是基于单因子实验结果的。在当前的符合设计中有四个过程变量（，NaOH浓度；，碱处理时间；，酶浓度；，水解时间）总共30个运行命令，如Table2所示。此外，实验结果证明，胶原蛋白的提取率从14.8%到30.1%不等。胶原蛋白最高产量（30.1%）的实验条件是：NaOH浓度0.8mol/L，碱处理时间18h，酶浓度75U/mg，水解时间36h。通过对实验数据进行多元回归分析，响应产量和测试变量呈相关性，表示为二阶多项式方程：（4）其中是酸溶性胶原蛋白的产量，而，，和分别是变量NaOH浓度、碱处理时间、酶浓度和水解时间的编码。所选择的二次预测模型的提取率（）的拟合统计显示在Table4。对二次回归模型进行方差分析（ANOVA）得决定系数（）表明，只有0.38%不能用模型来解释。然而，一个较大的值并不总是意味着回归模型是好的。调整后的确定系数（Adj）也证实该模型是非常好的，这表明胶原蛋白产量的实验值与预测值高度契合。误差分析的结果表明，缺乏适合性检验（0.5821）是不重要的，95%的可信度完全可以证实模型的有效性。同时，一个相对低的变异系数（）代表一个非常高的精度高度可靠的实验值（Songetal.，2023）。因此，该模型的P值（）非常低（<0.00001），表明该模型是有意义的。足够高精度的S/N（信噪比），大于4代表模型足够的识别力（Myers,Montgomery,&Anderson-Cook,2023）。66.832的实验比表示一个足够的信号。所有这些统计参数都表明模型的可靠性。Table3显示了方程（4）的回归系数。对于该模型中的每一项，一个小的P值（P<0.05）和一个大的F值意味着对提取率的影响更为显著（Quanhong&Caili,2005）。该表显示有一个非常小的P值（P<0.05），表明线性系数（,,和）、二次系数（,,和）和交互系数（,,和）是显著的。另一项系数对提取率无显著影响（P>0.05）。3.2.2.胶原蛋白提取条件大优化响应面法是用来说明NaOH浓度、碱处理时间、酶浓度和水解时间对反应的影响的。回归模型可以预测四个参数对产量的影响。四个实验变量之间的交互作用和反应与每个变量实验水平之间的关系可用三围响应面和二维等高线图说明（Liu,Mei,Wang,Shao,&Tao,2023）。一个圆形的等高线图表明相应的变量之间的交互作用是可以忽略不计的，而椭圆形的等高线图则恰恰相反（Muralidhar,Chirumamil,Marchant,&Nigam,2001）。在碱性介质中（NaOH）毁容劫匪胶原蛋白，而且酶的作用会大打折扣（Satoetal.,2003）。Fig.2aweiNaOH浓度和碱处理时间对产量综合影响的三维响应面和等高线图。这些图中显示的是使其他变量保持在他们的中值（实验范围的中间值）时两个影响因素的响应值。弯曲的响应面和椭圆形的等高线图表示两个影响因素之间存在较强的交互作用。当NaOH浓度在0.7和0.8mol/L之间，碱处理时间在12和18h之间时得到胶原蛋白的高收益。随着NaOH浓度（0.8-1.2mol/L）和碱处理时间（18-36h）的继续增加提取率下降。这表明NaOH浓度（）和碱处理时间（）对提取率的交互影响很显著，这一结果与Table4相吻合。NaOH浓度（）和酶浓度（）对提取率的交互影响显示在Fig.2b。响应面实验的最大预测值被包含在等高线图中最小的椭圆里。等高线图中最小的椭圆环表明独立变量之间有一个显著的交互影响（Muralidharetal.,2001）。如图所示，提取率随着胃蛋白酶浓度一直增加到50U/mg而增加，之后在高浓度时略有增加。PSC的产量随着NaOH浓度一直增加到0.8mol/L而增加。交互效果是通过NaOH浓度和酶浓度的同时作用观察到的。Fig.2c显示的是在固定酶浓度和碱处理时间（0水平）而NaOH浓度（）和水解时间（）不同的条件下得到的三位响应面和等高线图。Fig.2c表明，当NaOH浓度和水解时间处于阈值水平式，即分别为0.7-0.8mol/L和36-48h时，PSC的提取率可以达到最大。碱处理时间（）和酶浓度（）对胶原蛋白产量（）的影响如Fig.2d所示。如图所示，提取率随酶浓度从15到60U/mg增加而迅速增加，但超过60U/mg后提取率随着酶浓度的增加而缓慢增加。PSC提取率随着碱处理时间从12到18h增加而增加，之后岁碱处理时间增加而下降。Fig.2e显示了酶浓度（）和NaOH浓度（）分别固定在45U/mg和0.8mol/L前提下碱处理时间（）和水解时间（）的交互作用。PSC提取率随水解时间从从12到48h增加而上升，但之后不再随水解时间进一步增加而上升；它还还随碱处理时间从6到18h增加而上升，之后随之从18到30h增加而下降。Fig.2f为不同酶浓度和水解时间而固定NaOH浓度（0.8mol/L）和碱处理时间（18h）的条件下得到的三维响应面和等高线图。当酶浓度在50-75U/mg的范围内时PSC产量逐渐增加，并且在水解时间48h时达到最大，之后将不再进一步变化。应该指出的是：酶溶发生在较高的酶水平（75U/mg以上）和较长的水解时间（48h以上）时并不总能达到一个理想的响应值，这可能表明高分子量的肽片段不能通过盐析得到。我们的结果与Wang,Yang,Wang,andDua(2023)报道的通过增加胃蛋白酶量来提高草鱼中胶原蛋白产率的结果相符。结果表明：用0.5mol/L乙酸提取蛋壳膜中的胶原蛋白分子并没有完全溶解（数据未显示）。该现象最有可能被胶原蛋白分子在胶原链肽区域极易共价交联或分子间交联从而导致胶原分子在乙酸溶液中的低溶解度这一事实解释（Ahmad&Benjakul,2023;Jongjareonrak,Benjakul,Visessanguan,Nagai,&Tanaka,2005;Zangetal.,2007）。胃蛋白酶处理能够在不损害胶原蛋白三螺旋结构完整性的前提下专门得打通蛋壳膜中胶原蛋白的非螺旋端肽。因此，部分裂解的胶原蛋白的产量会增加（Huang,Shiau,&Chen,2023;Nalinanon,Benjakul,Visessanguan,&Kishimura,2007）。分析表明,在四个独立