定量分析样品前处理与测定方课件

第四章药物定量分析与分析方法的验证【目的要求】1.掌握药典中常见的一些含卤素与含金属的有机药物的前处理方法与其性质的关系；掌握氧瓶燃烧法的预处理方法、原理、方法以及在药物分析中的应用；2.掌握分析方法效能指标的内容，分析方法效能指标的确证过程以及不同分析方法对效能指标的要求；3.了解定量分析方法的特点。【教学内容】1.

定量分析样品的前处理方法：不经有机破坏的分析方法；经有机破坏的分析方法。2.

定量分析方法的特点：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性与范围、重现性以及耐用性。3.

药品质量标准分析方法验证。第一节定量分析样品的前处理方法一、概述

1、为什么要对定量分析的样品进行前处理？含卤素有机药物R-X（F，Cl,Br,I）金属有机药物R-O-Me（有机酸或酚的金属盐；结合不牢固）

金属有机药物有机金属药物R-Me（结合牢固）

2、常用的处理方法不经有机破坏的分析方法药物分析中常用的分析方法经有机破坏的分析方法（2）烯丙型卤和苄卤活泼（3）卤代烷型介于两者之间2.分子中所含卤原子的个数分子中所含卤原子的个数越多，活泼性越强，特别是同一碳上含多个卤原子或一个苯环上含多个卤原子时，活泼性增强更加明显3.卤素的种类I＞Br＞Cl＞F常见的含卤素有机药物防腐剂防腐剂广谱驱虫药诺氟沙星

杀菌剂

醋酸氟轻松

抗炎药碘他拉酸X线诊断用阳性造影剂

碘番酸X线造影剂

含金属有机药物的分析

含金属的有机药物：金属原子不与碳原子直接相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物。如酒石酸锑钾、葡萄糖酸锑钠、富马酸亚铁。

有机金属药物：金属原子直接与碳原子以共价键相连，结合比较牢固。如卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利。（三）经氧化还原后测定法1.碱性还原后测定例如：泛影酸的含量测定2.酸性还原后测定例如：碘番酸的含量测定Zn还原后银量法

三、经有机破坏的分析方法

湿法破坏

药物分析中常用的有机破坏的方法有干法破坏HNO3-HClO4法氧瓶燃烧法(一)湿法破坏HNO3-H2SO4法H2SO4-硫酸盐法HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2；H2SO4-KMnO4

(二)干法破坏加Na2CO3或MgO以助灰化；温度控制在420℃氟水氯水-NaOH溶液溴水-NaOH溶液-二氧化硫饱和溶液碘水-NaOH溶液-二氧化硫饱和溶液硫浓过氧化氢溶液与水的混合液磷水-硝酸溶液硒硝酸溶液(1→30)测定氟化物用石英燃烧瓶

一、容量分析法

（一）容量分析法的特点

1、操作简单、快速；2、比较准确（RSD＜0.2%）；3、仪器普通易得。4、含量较高试样(原料药含量测定)（二）容量分析法的计算问题

1.滴定度（T）的概念指每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物的质量(mg)2.滴定度的计算

aA+bB—cC+dD

T=M×b/a×B

3.百分含量的计算

（1）直接滴定法D%=V×F×T/W×100%

F=实际标定的浓度/规定的浓度

（2）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）D%=（VO–VB)×F×T/W×100%例

非那西丁含量测定：精密称取本品0.3630g加稀盐酸回流1小时后，放冷，用亚硝酸钠液（0.1010mol/L）滴定，用去20.00m1。每1ml亚硝酸钠液（0.1mol/L）相当于17.92mg的C10H13O2N。计算非那西丁的含量为（E）A.95.55%B.96.55%C.97.55%D.98.55%E.99.72%例：维生素C注射液（规格2ml：0.1g）的含量测定：精密量取本品2ml，加水15ml与丙酮2ml，摇匀，放置5分钟，加稀醋酸4ml与淀粉指示液1ml，用碘滴定液（0.1003mol/L）滴定，至溶液显兰色并持续30秒钟不褪，消耗10.56ml。每1ml碘滴定液（0.1mol/L）相当于8.806mg的C6H8O6。计算维生素C注射液的标示量%。例：取司可巴比妥钠胶囊（标示量为0.1g）20粒，除去胶囊后测得内容物总重为3.0780g，称取0.1536g，按药典规定用溴量法测定。加入溴滴定液（0.05mol/L）25ml，剩余的溴滴定液用硫代硫酸钠滴定液（0.1025mol/L）滴定到终点时，用去17.94ml。空白试验用去硫代硫酸钠滴定液25.00ml。按每1ml溴滴定液（0.05mol/L）相当13.01mg的司可巴比妥钠，计算该胶囊中按标示量表示的百分含量。

二、光谱分析法

（一）紫外-可见分光光度法（200nm～760nm)灵敏度高，可达10-4g/ml～10-7g/ml1.特点准确度高，SRD（%）为2%～5%仪器价格低廉，操作简单，易普及应用范围广。

2.朗伯-比耳定律

A=ECL

当溶液浓度为1%(g/ml)，溶液厚度为1㎝时的吸收度C:每100ml溶液中所含被测物质的重量(按干燥品或无水物计算，g)4.对溶剂的要求:

220～240nm241～250nm251～300nm300nm以上

溶剂+吸收池A

＜0.41＜0.20＜0.10＜0.05

5.测定方法

要求供试品溶液的A应在0.3～0.7对照品比较法：Cx=(Ax/Ar)Cr;含量%=Cx×D/W×100%常用方法吸收系数法：含量%=(E1%1cm

)x/(E1%1cm

)r×100%计算分光光度法：VA的三点校正法例：用异烟肼比色法测定复方己酸孕酮注射液的含量。当己酸孕酮对照品的浓度为50g/ml，按中国药典规定显色后在380nm波长处测得吸收度为0.160。取标示量为250mg/ml(己酸孕酮)的供试品2ml配成100ml溶液，再稀释100倍后，按对照品显色法同样显色，测得吸收度为0.154。求供试品中己酸孕酮的含量为标示量的多少？

例．对乙酰氨基酚的含量测定方法为：取本品约40mg，精密称定，置250ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液50ml溶解后，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液10m1，加水至刻度，摇匀，照分光光度法，在257nm的波长处测定吸收度，按C8H9NO2的吸收系数()为715计算，即得。若样品称样量为m(g)，测得的吸收度为A，则含量百分率的计算式为：例．中国药典（1990年版）规定维生素B12注射液规格为0.1mg／m1，含量测定如下：精密量取本品7.5m1，置25ml量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，混匀，置lcm石英池中，以蒸馏水为空白，在361±1nm波长处吸收度为0.593，按为207计算维生素B12按标示量计算的百分含量为（C）A.90％B.92.5％C.95.5％D.97.5％E.99.5％

（二）荧光分光光度法灵敏度高，可达10-10g/ml～10-12g/ml在低浓度进行测定，防止F与C不成正比及自熄灭作用1.特点用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减灵敏度高，但干扰因素多。制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性。用样品量少，操作简单，方法快速，应用范围较广。

三、色谱分析法

按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱方法分类按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；GC，HPLC。

（一）HPLC法

1.对HPLC仪器一般要求色谱柱、流动相按品种项下要求。色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)22.系统性试验分离度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5拖尾因子：T=W0.05h/2d1应在0.9～1.05

内标法加校正因子测定供试品中主成分含量3.测定方法标准曲线法外标法测定供试品中主成分含量外标一点法应用示例：

RP-HPLC法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法

（二）GC法

1.对GC仪器一般要求载气为氮气；色谱柱为填充或毛细管柱色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)22.系统性试验分离度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5拖尾因子：T=W0.05h/2d1应在0.9～1.05内标法加校正因子测定供试品中主成分含量

3.测定方法标准曲线法外标法测定供试品中主成分含量外标一点法应用示例：

Ch.P(2000)收载的月桂卓酮、维生素E及其片剂、注射剂、甲酚皂溶液等均采用GC法中的内标法加校正因子测定含量。

一、准确度是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示（一）含量测定方法的准确度

1.原料药可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确度的另一方法测定的结果进行比较。

2.制剂要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。

具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3,共9个数据来评价回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC发时，一般回收率可达98%～102%；容量法可达99.7%～100.3%

第三节药品分析方法验证（二）数据要求

回收率%=（测定平均值—空白值）/加入量×100%

要求制备高、中、低三浓度的样品，各测定3次。应报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。

二、精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果之间的接近程度。（一）精密度表示方法1.偏差(deviation,d)

d=测得值-平均值=Xi-X

2.标准偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/2

3.相对标准差(relativestandarddeviation,RSD)也称变异系数(coefficientofvariation,CV)RSD=标准偏差/平均值×100%=S/X×100%（二）重复性、中间精密度及重现性

1.重复性在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度.2.中间精密度在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。3.重现性在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。（三）数据要求应报告S或SD、RSD和可信限。用统计学的可信性分析(t或f）。三、专属性

是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。（一）鉴别反应应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应。（二）含量测定和杂质测定

色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。

四、检测限（limitofdetection,LOD)是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。（一）常用的方法1.非仪器分析目视法用已知浓度被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

2.仪器分析方法

UV法：LOD=f.3S空=C样/A样×3S空Flu法：LOD=f.3S空=C样/(F样-F空)×3S空

GC和HPLC法：

LOD=S/N=2或3

（二）数据要求

应附测试图，说明测试过程和检测限结果。

五、定量限（limitofquantitation,LOQ)是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ.常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行测定。六、线性

是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

UV法：首先制备一个标准系列，浓度点n=5;A=0.3～.0.7建立回归方程C=aA+b;r＞0.9999。

HPLC法：制备一个标准系列，浓度点n=5～7;以C对h或A或与内标物的峰面积之比，建立回归方程r＞0.9999。

七、范围

是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。

原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的80%-～120%。

制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的70%-～130%。

溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的±20%。八、耐用性是指在测定条件下有效的变动时，测定结果不受影响的承受程度。典型的变动因素有：被溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。

HPLC法变动因素有：流动相组成与pH，色