植物昆虫和哺乳动物中存在的小RNA分子长度为18-26个核苷酸nt课件

生物芯片检测细胞中microRNA的表达MicroRNAExpressioninCellsDetectedbyOligonucleotideMicroarray07生技1生物芯片检测细胞中microRNA的表达MicroRNA1

microRNA(miRNA)是一类在线虫、植物、昆虫和哺乳动物中存在的小RNA分子,长度为18-26个核苷酸(nt)的小非编码RNA，类似于siRNA的分子

。

miRNA通过调节基因表达,参与调控细胞的众多生物学功能,如生物发育、脂肪代谢,及细胞的分化、增殖和凋亡等。它们通过与靶mRNA的3'非翻译区(3'-UTR)互补,将mRNA剪切或是抑制其翻译。

人类基因组中已发现300多种miRNA,而且预测实际数目会更多,它们可能会对人类基因组中近30%的基因发挥调控作用。但关于miRNA的表达模式、生物学功能、作用机制等,目前的认识还不很清楚。在此,我们设计并制备了miRNA表达谱的寡核苷酸芯片,利用其快速、平行、高通量的检测特点,分析了6种不同细胞系中206个miRNA的表达水平特点,为miRNA的进一步研究奠定了基础。

microRNA(miRNA)是一类在线虫、植21材料和方法1.1材料

实验所用6种人类肿瘤细胞系均为本实验室保存,分别HeLa(人宫颈癌上皮细胞)、K562(人慢性髓细胞性白血病细胞)、ES-2(人卵巢透明细胞癌)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)和A549细胞(人肺腺癌细胞)。所有细胞系均在5%CO2条件下,用含有10%胎牛血清的适合培养基培养。1.2miRNA芯片的制备

所用的210个寡核苷酸探针为mirVanaTMmiRNAProbeSet试剂盒(Ambion),其中206个与已知的人类和小鼠miRNA序列互补,4个为阳性对照。3×SSC点样缓冲液溶解探针至50μmol/L,用SpotArrayTM24基因芯片点样仪(PerkinElmer)印制于SuperChipTMⅠ(PerkinElmer)玻片表面,制成miRNA寡核苷酸芯片。每次杂交前进行水合、干燥等点样后处理。1材料和方法1.1材料31.3miRNA的准备、标记与杂交

依mirVanaTMmiRNAIsolationKit(Ambion)说明书提取肿瘤细胞的富集miRNA。用UniversalMicroplateSpectrophotometer(Bio-tek)紫外分析仪测定miRNA浓度和纯度,8mol/L尿素变性的15%聚丙烯酰胺凝胶检测质量。依mirVanaTMmiRNALabelingKit(Ambion)说明书对富集miRNA进行荧光标记,方法简单描述如下:先在miRNA末端添加20-50个经过氨基修饰的核苷酸尾,然后与带有N-羟基琥珀酰亚胺酯类(Nhydroxysuccinimidylester,NHS-ester)的荧光染料Cy3(AmershamBiosciences)反应。标记后的样本与3×miRNAHybridizationBuffer(Ambion)混合并将其均匀铺于miRNA寡核苷酸芯片表面,小心加盖玻片封片,置于密封湿润的杂交仓中,42℃杂交16h。最后进行杂交后清洗。1.3miRNA的准备、标记与杂交41.4芯片图像的采集与数据处理采用ScanArrayTMExpress1.0(PerkinElmer)扫描仪进行扫描,扫描强度为100%,光电倍增管增益为80%,扫描精度为10μm。扫描所得图ScanArray3.0(PerkinElmer)软件进行处理,得到杂交信号和与之相应背景的平均强度值,从杂交信号值中减去背景值得到校正信号强度值。6种细胞检测所得数据经阳性对照均衡后比较。判断表达存在差异的标准是:①相互比较的miRNA信号荧光强度值相差至少大于1000;②若其中有信号强度值小于100,则同一种miRNA在不同细胞的荧光值差异需大于500。数据经总体归一化和对数转化后,Cluster3.0(StanfordUniversity)进行聚类分析。

1.4芯片图像的采集与数据处理51.5RT-PCR验证miRNA分别取6种细胞总RNA各5μg,用与miR-17-5p、miR-21前体互补的特异性引物和逆转录酶SuperscriptⅢ(Invitrogen)进行逆转录反应,分别取1μL逆转录产物进行PCR反应中的miRNA序列设计特异性引物,有关参数见表1。用15%非变性聚丙烯酰胺凝胶验证扩增产物大小;用LabWorks4.0ImageAcquisitionandAnalysis软件进行定量及数据处理。取PCR产物连入pGEM-T-easy载体(Promega),送交测序,测序结果与提供的miRNA序列一致。1.5RT-PCR验证miRNA6植物昆虫和哺乳动物中存在的小RNA分子长度为18-26个核苷酸nt课件72结果2.1miRNA的抽提和纯化6种细胞系富集miRNA的D260nm/D280nm值均为1.8～2.1,符合miRNA芯片的检测要求。2.2芯片杂交结果标记、纯化后的miRNA与芯片杂交,用扫描仪在543nm通道处对芯片进行扫描,得到图像,用Scanarray3.0软件分析miRNA在6种细胞中的表达水平。经比较发现,91个miRNA在6种细胞间没有明显差异,115个miRNA存在差异。miR-21在6种细胞中校正信号强度/背景强度均大于2倍,表达水平均较高;miR-17-5p和miR-20a在6种细胞中的表达情况相似,在ES-2细胞中校正信号强度/背景强度大于10倍,表达较高;miR-126与miR-128a和miR-151,miR-145与miR-297-1在HeLa和MCF-7细胞中的表达水平类似。见表2。2结果2.1miRNA的抽提和纯化8植物昆虫和哺乳动物中存在的小RNA分子长度为18-26个核苷酸nt课件92.3数据聚类分析将扫描得到的杂交后图像用ScanArray3.0软件进行处理,所得数据经归一化和对数转换后,用Cluster3.0进行聚类分析。结果,MCF-7和HeLa细胞miRNA的表达谱聚为一类。2.4RT-PCR检测用特异性引物对miR-17-5p、miR-21前体进行扩增,同时以U6作为内参。各细胞中miRNA前体的表达水平经内参校正后,发现miR-17-5p前体在K562细胞中的表达水平最高,在ES-2细胞中的表达量次之;miR-21在6种肿瘤细胞中的表达水平均较高,与芯片检测结果基本一致(图1)。2.3数据聚类分析10图一图一113讨论

microRNA是一类在线虫、植物、昆虫和哺乳动物中存在的小RNA分子,它们通过与靶mRNA的3'非翻译区(3'-UTR)互补,将mRNA剪切或是抑制其翻译。已很明确,miRNA在调控基因表达过程中发挥非常重要的作用,而理解miRNA在生物体内如何发挥作用的关键是要知道miRNA的表达模式。但是因为miRNA的长度非常短(只有18-26nt),检测miRNA的方法受到很大的限制。我们利用生物芯片的高通量、高敏感性的特点,为在组织和细胞中检测多种miRNA提供了理想的手段。

3讨论microRNA是一类在线虫、植物、昆12

实验中用荧光标记的miRNA直接与miRNA检测芯片杂交,检测发现6种细胞系有各自不同的miRNA表达谱。实验检测到miR-21在6种肿瘤细胞中的表达水平均较高,这与文献报道的miR-21在70%的肺癌和70%的结直肠癌患者中表达上调一致[6]。Iorio等[7]也发现,miR-21在乳腺癌中表达明显上调,而且在一定程度上可以显示肿瘤的恶性程度。miRNA集簇存在是其一个显著特征,我们检测到miR-17-5p与miR-20a的表达水平类似,而也有文献报道miR-17-5p与miR-20a及其他4种miRNA成集簇存在于人类第13号染色体上[8]。O'Donnell等[9]通过染色质免疫沉淀实验,发现c-Myc可直接与miR-17-5p集簇位点结合,激活其表达,提示这一miRNA的表达可能和肿瘤的发生存在某种关联。MCF-7和HeLa分别来源于人类乳腺和宫颈,它们发育起源类似,共同起源于胚胎内胚层。我们检测到MCF-7和HeLa细胞miRNA的表达谱聚为一类。提示在哺乳动物体内特殊的miRNA有可能参与维持胚胎早期发生过程中的多潜能细胞状态[10],在器官和组织的发育、形成中发挥重要调控作用。实验中用荧光标记的miRNA直接与miRNA13总RNA中miRNA所占的比例极少(约为0.01%)[11],为了验证芯片检测结果是否可以反映miRNA在总RNA中的量,我们用RT-PCR的方法对芯片检测结果进行了验证。实验结果表明微阵列和PCR方法检测的miRNA的表达基本一致,但也有些差异。用RT-PCR方法检测到K562细胞中miR-17-5p的高表达,而在微阵列中却显示其在K562细胞中表达水平较低。这可能是由于:①K562细胞中的前体miRNA和成熟miRNA表达量都非常高,虽然标记反应没有对pre-miRNA进行荧光标记,但在杂交过程中大量的pre-miRNA仍可能和相对较少的成熟miRNA竞争,影响了荧光标记的成熟miRNA与探针的结合,掩盖了K562中miR-17-5p信号;②或是实验过程中的系统误差,这种情况在普通的生物芯片技术中也存在。因此,除了要在芯片实验过程中尽量减少人为干扰,进一步改进实验技术减少系统误差外,在对某一miRNA进行深入研究之前,用其他方法确定基因芯片结果是有必要的。本实验方法具有快速、平行、高通量的特点。通过监控细胞miRNA的表达,可以帮助我们更好地了解这类小核酸分子的功能及作用机制。miRNA表达的比较性研究将可能发现新的诊断性标志分子或治疗性靶分子。总RNA中miRNA所占的比例极少(14谢谢观看！谢谢观看！15生物芯片检测细胞中microRNA的表达MicroRNAExpressioninCellsDetectedbyOligonucleotideMicroarray07生技1生物芯片检测细胞中microRNA的表达MicroRNA16

microRNA(miRNA)是一类在线虫、植物、昆虫和哺乳动物中存在的小RNA分子,长度为18-26个核苷酸(nt)的小非编码RNA，类似于siRNA的分子

。

miRNA通过调节基因表达,参与调控细胞的众多生物学功能,如生物发育、脂肪代谢,及细胞的分化、增殖和凋亡等。它们通过与靶mRNA的3'非翻译区(3'-UTR)互补,将mRNA剪切或是抑制其翻译。

人类基因组中已发现300多种miRNA,而且预测实际数目会更多,它们可能会对人类基因组中近30%的基因发挥调控作用。但关于miRNA的表达模式、生物学功能、作用机制等,目前的认识还不很清楚。在此,我们设计并制备了miRNA表达谱的寡核苷酸芯片,利用其快速、平行、高通量的检测特点,分析了6种不同细胞系中206个miRNA的表达水平特点,为miRNA的进一步研究奠定了基础。

microRNA(miRNA)是一类在线虫、植171材料和方法1.1材料

实验所用6种人类肿瘤细胞系均为本实验室保存,分别HeLa(人宫颈癌上皮细胞)、K562(人慢性髓细胞性白血病细胞)、ES-2(人卵巢透明细胞癌)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)和A549细胞(人肺腺癌细胞)。所有细胞系均在5%CO2条件下,用含有10%胎牛血清的适合培养基培养。1.2miRNA芯片的制备

所用的210个寡核苷酸探针为mirVanaTMmiRNAProbeSet试剂盒(Ambion),其中206个与已知的人类和小鼠miRNA序列互补,4个为阳性对照。3×SSC点样缓冲液溶解探针至50μmol/L,用SpotArrayTM24基因芯片点样仪(PerkinElmer)印制于SuperChipTMⅠ(PerkinElmer)玻片表面,制成miRNA寡核苷酸芯片。每次杂交前进行水合、干燥等点样后处理。1材料和方法1.1材料181.3miRNA的准备、标记与杂交

依mirVanaTMmiRNAIsolationKit(Ambion)说明书提取肿瘤细胞的富集miRNA。用UniversalMicroplateSpectrophotometer(Bio-tek)紫外分析仪测定miRNA浓度和纯度,8mol/L尿素变性的15%聚丙烯酰胺凝胶检测质量。依mirVanaTMmiRNALabelingKit(Ambion)说明书对富集miRNA进行荧光标记,方法简单描述如下:先在miRNA末端添加20-50个经过氨基修饰的核苷酸尾,然后与带有N-羟基琥珀酰亚胺酯类(Nhydroxysuccinimidylester,NHS-ester)的荧光染料Cy3(AmershamBiosciences)反应。标记后的样本与3×miRNAHybridizationBuffer(Ambion)混合并将其均匀铺于miRNA寡核苷酸芯片表面,小心加盖玻片封片,置于密封湿润的杂交仓中,42℃杂交16h。最后进行杂交后清洗。1.3miRNA的准备、标记与杂交191.4芯片图像的采集与数据处理采用ScanArrayTMExpress1.0(PerkinElmer)扫描仪进行扫描,扫描强度为100%,光电倍增管增益为80%,扫描精度为10μm。扫描所得图ScanArray3.0(PerkinElmer)软件进行处理,得到杂交信号和与之相应背景的平均强度值,从杂交信号值中减去背景值得到校正信号强度值。6种细胞检测所得数据经阳性对照均衡后比较。判断表达存在差异的标准是:①相互比较的miRNA信号荧光强度值相差至少大于1000;②若其中有信号强度值小于100,则同一种miRNA在不同细胞的荧光值差异需大于500。数据经总体归一化和对数转化后,Cluster3.0(StanfordUniversity)进行聚类分析。

1.4芯片图像的采集与数据处理201.5RT-PCR验证miRNA分别取6种细胞总RNA各5μg,用与miR-17-5p、miR-21前体互补的特异性引物和逆转录酶SuperscriptⅢ(Invitrogen)进行逆转录反应,分别取1μL逆转录产物进行PCR反应中的miRNA序列设计特异性引物,有关参数见表1。用15%非变性聚丙烯酰胺凝胶验证扩增产物大小;用LabWorks4.0ImageAcquisitionandAnalysis软件进行定量及数据处理。取PCR产物连入pGEM-T-easy载体(Promega),送交测序,测序结果与提供的miRNA序列一致。1.5RT-PCR验证miRNA21植物昆虫和哺乳动物中存在的小RNA分子长度为18-26个核苷酸nt课件222结果2.1miRNA的抽提和纯化6种细胞系富集miRNA的D260nm/D280nm值均为1.8～2.1,符合miRNA芯片的检测要求。2.2芯片杂交结果标记、纯化后的miRNA与芯片杂交,用扫描仪在543nm通道处对芯片进行扫描,得到图像,用Scanarray3.0软件分析miRNA在6种细胞中的表达水平。经比较发现,91个miRNA在6种细胞间没有明显差异,115个miRNA存在差异。miR-21在6种细胞中校正信号强度/背景强度均大于2倍,表达水平均较高;miR-17-5p和miR-20a在6种细胞中的表达情况相似,在ES-2细胞中校正信号强度/背景强度大于10倍,表达较高;miR-126与miR-128a和miR-151,miR-145与miR-297-1在HeLa和MCF-7细胞中的表达水平类似。见表2。2结果2.1miRNA的抽提和纯化23植物昆虫和哺乳动物中存在的小RNA分子长度为18-26个核苷酸nt课件242.3数据聚类分析将扫描得到的杂交后图像用ScanArray3.0软件进行处理,所得数据经归一化和对数转换后,用Cluster3.0进行聚类分析。结果,MCF-7和HeLa细胞miRNA的表达谱聚为一类。2.4RT-PCR检测用特异性引物对miR-17-5p、miR-21前体进行扩增,同时以U6作为内参。各细胞中miRNA前体的表达水平经内参校正后,发现miR-17-5p前体在K562细胞中的表达水平最高,在ES-2细胞中的表达量次之;miR-21在6种肿瘤细胞中的表达水平均较高,与芯片检测结果基本一致(图1)。2.3数据聚类分析25图一图一263讨论

microRNA是一类在线虫、植物、昆虫和哺乳动物中存在的小RNA分子,它们通过与靶mRNA的3'非翻译区(3'-UTR)互补,将mRNA剪切或是抑制其翻译。已很明确,miRNA在调控基因表达过程中发挥非常重要的作用,而理解miRNA在生物体内如何发挥作用的关键是要知道miRNA的表达模式。但是因为miRNA的长度非常短(只有18-26nt),检测miRNA的方法受到很大的限制。我们利用生物芯片的高通量、高敏感性的特点,为在组织和细胞中检测多种miRNA提供了理想的手段。

3讨论microRNA是一类在线虫、植物、昆27

实验中用荧光标记的miRNA直接与miRNA检测芯片杂交,检测发现6种细胞系有各自不同的miRNA表达谱。实验检测到miR-21在6种肿瘤细胞中的表达水平均较高,这与文献报道的miR-21在70%的肺癌和70%的结直肠癌患者中表达上调一致[6]。Iorio等[7]也发现,miR-21在乳腺癌中表达明显上调,而且在一定程度上可以显示肿瘤的恶性程度。miRNA集簇存在是其一个显著特征,我们检测到miR-17-5p与miR-20a的表达水平类似,而也有文献报道miR-17-5p与miR-20a及其他4种miRNA成集簇存在于