植物生物反应器课件

1植物反应器概述植物生物反应器定义优点：（1）蛋白翻译后正确修饰、加工，（2）生产成本低，（3）生产工艺简单，（4）存储、使用简单方便，（5）使用安全。

1植物反应器概述植物生物反应器定义1角质细胞生长因子概述

（1）角质细胞生长因子(keratinocytegrowthfactor,KGF)是1989年由Rubin等首先从人胚胎肺成纤维细胞的生长培养液中分离出来的。是成纤维细胞生长因子家族的成员之一。（2）KGF基因编码一有194个氨基酸的蛋白质。基因含有三个外显子和两个内含子。（3）KGF是由间充质来源的细胞产生的，通过旁分泌途径特异地作用于上皮细胞。（4）KGF具有很强的促上皮细胞分裂的功能。角质细胞生长因子概述（1）角质细胞生长因子(keratin2角质细胞生长因子的生物学功能KGF在生长发育中器官的分化、形成中起重要作用

1、肺表皮细胞的生长、分化和成型及肺的分支形成中起着重要的作用。2、动物的精囊发生。损伤修复功能及减少化疗的损伤1、皮肤损伤修复，2、肠胃损伤的修复，3、减少放化疗的伤害。角质细胞生长因子的生物学功能KGF在生长发育中器官的分化、形3以胡萝卜、水稻为植物反应器表达KGF的意义首先，具有植物反应器的优点胡萝卜（1）营养丰富（2）营养保健品食用含KGF的胡萝卜可以辅助治疗肠胃疾病，药敷则可加快皮肤伤口的愈合。因此在胡萝卜中表达高活性的KGF将具有重要的商业价值。以胡萝卜、水稻为植物反应器表达KGF的意义首先，具有植物反应4水稻(1)美容保健品(2)“米疗”在水稻中表达人KGF，这无疑给水稻这位美容新秀更添一“亮点”，即使用萃取的水稻精华及水稻中表达的人KGF可以在对皮肤进行保养的同时加快伤口、疤痕的修复，角质细胞更新。水稻5技术流程

角质细胞生长因子的核苷酸序列的获得植物水稻、胡萝卜表达体系的建立筛选培养基上抗性苗的获得农杆菌介导的转化检测植物表达载体的构建共培养，筛选出抗性愈伤GUS检测PCR检测SouthernbottingRT-PCR检测Westernbotting技术流程角质细胞生长因子的核苷酸序列的获得植物水稻、胡萝6

角质细胞生长因子的核苷酸序列的获得

重叠延伸PCR方法获得角质细胞生长因子编码序列1）重叠延伸PCR介绍

2）外显子2、3的获得外显子2：2号引物：5’-GAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCA-3’3号引物：5’-TGCATTCTTTCTTTGCATAGAGTTT-3’外显子3：4号引物5’-CTATGCAAAGAAAGAATGCAATGAA-3’3’(3)引物5’-GAATTCTTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3’

用人肺组织块提取的DNA为模板，PCR获得相应的外显子序列。角质细胞生长因子的核苷酸序列的获得

重叠延7外显子1的获得1号引物5’-GATTTCCATGATATTGTAATTATTCTTCA-3’Ⅰ5’-GGCGGATCCTCTAGAATGTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATGTGAA-3’

Ⅱ5’-TCCATGTAATCATAACTTCTTGTGTGTCGCTCAGGGCTGGAACAGTTCACATTTGTAGC-3’

Ⅲ5’-ATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAAGAGTGAGAAGACTCTTCTGTCGAACACAGTGG-3’

Ⅳ5’-GGGTCCCTTTTACTTTGCCTCTTTTATCGATCCTCAGGTACCACTGTGTTCGACAG-3’

Ⅴ5’-CAAAGTAAAAGGGACCCAAGAGATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGAC-3’

图1、外显子1核苷酸获得图示

外显子1的获得图18KGF全长的获得图图2KGF序列获得图示

KGF全长的9KGF三段外显子及全长的凝胶电泳图图3、PCR产物凝胶电泳图MDNAmarkerDL20001外显子1,2外显子2,3外显子34阴性对照

图4、KGF核苷酸凝胶电泳图M、DNAmarkerDL2000,1、KGF片段外显子1为193bp的核苷酸片断，外显子2为104bp的核苷酸片断，外显子3为192bp的核苷酸片断，总长为500bp左右。经凝胶电泳后，与预期的大小一致。KGF三段外显子及全长的凝胶电泳图图3、PCR产物凝胶电泳图10获得序列的测序结果BamHIXbalIEcoRIGGATCCTCTAGAGATTGAATTCTTAAGTTATTGCCATAGGAAGAAAGTGGGCCGTTTTTTGTTCTTTCTTCGTTTTCTTCCCTTTGACAGGAAGCCCCTTTTGATTTAAGGCCACGAACATTTCCCCTCCGCTGTGTGTCCATTTAGCTGATGCATAGGTGTTGTAATGGTTTTCCAGAATCAGTTCTTTGAAGTTGCAATCTTCATTGCATTCTTTCTTTGCATAGAGTTTCCCTTCTTTGTTCATGGCAAGATAGTATTCACTTTCCACCCCTTTGATTGCCACAATTCCAACTGCCACAGTCCTGATTTCCATGATATTGTAATTATTCTTCATCTCTTGGGTCCCTTTTACTTTGCCTCTTTTATCGATCCTCAGGTACCACTGTGTTCGACAGAAGAGTCTTCTCACTCTTATATCCCCTCCTTCCATGTAATCATAACTTCTTGTGTGTCGCTCAGGGCTGGAACAGTTCACATTTGTAGCCATTTGCTCTGGAGTCATGTCATTGCAAGCCATTCTAGAGGATCCXbalIBamHI获得序列的测序结果BamHIXbalI11测序得到的序列提交genbank比对，核苷酸的同源性达96.0％。将翻译后的蛋白序列提交genbank比对，蛋白质同源性达98.8％。核苷酸比对结果：

测序得到的序列提交genbank比对，核苷酸的同源性达12蛋白比对结果：

将所获得的KGF核苷酸编码序列与Genbank中已有的KGF核苷酸序列比对，核苷酸序列同源性达96.0%（其中外显子1为100%同源，差异都位于外显子2和外显子3中）。由于外显子1根据genbank序列设计，因而外显子1与genbank上的数据100%同源,同时这也说明了在本实验延伸PCR的过程并不存在碱基的突变，或碱基突变的频率比较低。而外显子2、外显子3与genbank的差异推测为人种间的差异。氨基酸序列比对，同源性达98.8%。成熟肽的第122-132个氨基酸之间是KGF的受体特异性结合位点，在此位点无氨基酸位点突变。蛋白比对结果显示第36、40、43位点存在差异，但研究发现成熟肽的前19个氨基酸丢失并不会影响成熟肽的活性，因此这些位点的差异不会影响蛋白的活性、功能。

蛋白比对结果：将所获得的KGF核苷酸编码序列与G13

植物表达载体的构建中间载体pBPFΩ7-KGF的构建pBPFΩ7中含有CaMV35s启动子及NOS终止子，将KGF编码序列插入CAMV35s启动子与NOS终止子之间（命名CAMV35s-KGF-NOS），将使人KGF基因能在植物中表达。

载体pBI1301-KGF的构建

将中间载体pBPFΩ7-KGF经PstⅠ酶切后，回收CAMV35s-KGF-NOS片段。同时，将载体pBI1301用PstⅠ酶切、去磷酸化后回收。将两回收片段连接，转化大肠杆菌

质粒构建如下图植物表达载体的构建中间载体pB14植物生物反应器课件15植物生物反应器课件16植物生物反应器课件17

质粒构建鉴定结果图5质粒pMD18-T-KGF阳性克隆酶切鉴定图MDNAmarkerDL20001pMD18-T-KGF/BamHI酶切图6质粒pBI1301-KGFPCR鉴定凝胶电泳图1pBI1301-KGFPCR鉴定结果MDNAmarkerDL2000

图7质粒pBI1301-KGF阳性克隆酶切鉴定图1pBI1301-KGF/EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切MDNAmarkerDL2000+15000质粒构建鉴18图5、6、7的鉴定图都可以看到500bp左右的KGF目的条带。同时图7中有一1500bp左右的条带，为CAMV35s片段。图7的酶切结果与预期结果相同，说明CAMV35s-KGF-NOS已经连接于pBI1301。将质粒pBI1301-KGF转化农杆菌EHA105，获得植物侵染菌株。图5、6、7的鉴定图都可以看到500bp左右的KGF目的条19植物水稻、胡萝卜表达体系的建立

1、日本晴培养基：1）诱导培养基MB（MS的大量元素、铁盐、肌醇加B5的微量元素、维生素）+2,4-D2mg/L；2）继代培养基MB+2,4-D2mg/L；3）共培养培养基MS+2,4-D4mg/L+AS；4）筛选培养基NB（N6的大量元素、铁盐、肌醇加B5的微量元素、维生素）+2,4-D2mg/L+Cb500mg/L+Hyg100mg/L；5）预分化培养基NB+ABA2mg/L+6-BA3mg/L+NAA1mg/L+Cb250mg/L+Hyg25mg/L；6）分化培养基NB+6-BA3mg/L+NAA1mg/L+Sorbitol13g/L+Cb250mg/L+Hyg25mg/L2、胡萝卜培养基1）诱导愈伤（继代）培养基MS+2,4-D0.1mg/L2）共培养基MS+2,4-D0.1mg/L+As50mmol/3)筛选培养基MS+2,4-D0.1mg/L+Hyg40mg/L+Cb300mg/L4)诱导胚状体培养基MS+2,4-D0.001mg/L+Hyg20mg/L+Cb100mg/L5)分化培养基MS+Hyg40mg/L+Cb100mg/6)生根壮苗培养基1/2MS+NAA0.2mg/L植物水稻、胡萝卜表达体系的建立

1、日本晴培养基：20水稻及胡萝卜愈伤的诱导AB图8水稻及胡萝卜胚性愈伤A、水稻胚性愈伤:

水稻幼胚在诱导培养基诱导4天后长出约1cm芽,芽的基部出现颗粒状的愈伤组织。将芽从基部掐出,将剩余的颗粒状的愈伤接种至新愈伤诱导培养基中,2周后,愈伤长至直径0.5～1.0cm,呈现淡黄色,半松散状颗粒,可用作遗传转化

B、胡萝卜胚性愈伤:

将胡萝卜韧皮部切块、消毒后接种于愈伤诱导培养基中，二周后在红色的韧皮部组织块上长出淡绿色的愈伤组织块。将愈伤组织块掐下接种于新的愈伤诱导培养基中培养二周后即可用作遗传转化

水稻及胡萝卜愈伤的诱导AB图8水稻及胡萝卜胚性愈伤21

农杆菌介导的遗传转化

1）农杆菌的培养吸取－20℃保存的甘油菌于15mLLB（含Kan50μg/mL）液体培养基中，28℃振荡32h，吸取150μL农杆菌液涂LB（含Kan50μg/mL）平板，28℃培养2-3d。2）农杆菌感染愈伤组织块将培养了2-3天的农杆菌用共培养液体培养基悬浮，将愈伤组织浸泡在菌液中，并在菌液中加入AS至浓度为100μM。于摇床中缓慢摇动15min。3）农杆菌与愈伤组织块共培养将愈伤组织块从菌液中取出，置于无菌滤纸上吸干，而后移入共培养基中，在培养基表面铺一张无菌滤纸。4）抗性愈伤组织的筛选共培养2-3d后，再把愈伤组织块移到筛选培养基上，2周继代一次，继代2次。5）预分化（水稻）挑选直径1-2mm生长良好、结构致密的抗性愈伤组织转移入预分化培养基中，25℃，12h光照培养，预分化时间一般为2周。6）分化及再生培养将预分化后的抗性愈伤组织转移至分化培养基上进行分化培养，待再生出小苗，转移至水中培养两周后，移栽到土里。

农杆菌介导的遗传转化

22抗性愈伤的筛选

水稻：经过1周的筛选培养，愈伤褐化。而后，再经过4-5天，褐化的组织上长出淡乳白色，略透明，生长相对旺盛的抗性愈伤。胡萝卜：经过大约为2周的筛选，愈伤褐化。而后，再经过1周，褐化的组织上长出淡绿色，略透亮，生长相对旺盛的抗性愈伤。

抗性愈伤的筛选

水稻：经过1周的筛选培养，愈伤褐化。而后，再23

筛选培养基上抗性苗的产生

A、水稻抗性苗：抗性愈伤在筛选培养基中长大至直径为5mm时移至预分化培养基中，一周后可以看到愈伤上有绿点产生。抗性愈伤于预分化培养基培养2周后移至分化培养基中，在分化培养基中二周后，每个愈伤长出1～4棵小苗

B、胡萝卜抗性苗：抗性愈伤转至新的筛选培养基中继续培养，待抗性愈伤长大至直径为5mm时移至分化培养基中。抗性愈伤于分化培养基中光照培养后，愈伤变为绿色，一周后有深绿色的芽点长出。再经过二周后长大成苗

AB筛选培养基上抗性苗的产生A、水稻抗性苗：抗性24AB图10GUS基因在水稻转化体中瞬时表达A、为共培养后的GUS检测图B、未转化的阴性对照AB图10GUS基因在水稻转化体中瞬时表达25AB图11GUS基因在胡萝卜转化体中瞬时表达A、为共培养后的GUS检测图B、未转化的阴性对照

在转化共培养后（3d）检测GUS基因的表达，愈伤组织染色后呈现蓝色（图10、图11），而未转化的愈伤组织无蓝色出现，表明外源基因片断在植物的愈伤组织细胞中得到瞬时表达。AB图11GUS基因在胡萝卜转化体中瞬时表达在267、2GUS基因在抗性植株中的表达检测

ABCD图12GUS基因在水稻及胡萝卜再生植株中稳定表达A、GUS基因在水稻再生植株叶片中稳定表达B、GUS基因在水稻再生植株根中稳定表达C、GUS基因在胡萝卜再生根中稳定表达D、GUS基因在胡萝卜再生植株叶片中稳定表达再生植株中叶片经组织化学染色后可见蓝色,说明GUS基因在植株中稳定表达

7、2GUS基因在抗性植株中的表达检测ABCD图12G27PCR检测

AB图13部分水稻及胡萝卜再生植株的PCR检测结果A1:未转化的再生植株;2~10:转化的再生植株编号KA1~KA9;11:空白对照;12:阳性对照;B1：未转化的再生植株;2～9:转化再生植株编号HK1～HK8;10:阳性对照;11:DNAMaker2000

取转化的水稻及胡萝卜植株叶片提取总DNA，以总DNA为模板进行PCR扩增，未转化的植株DNA为阴性对照模板,结果如图13转化的水稻植株KA3、KA4、KA5、KA6、KA8PCR检测出现500bp左右的目的带，阴性对照没有出现相应的带。转化的胡萝卜植株HK1、HK3、HK7PCR检测出现500bp左右目的带，阴性对照没有出现相应的带。说明KGF核苷酸序列经转化整合到水稻及胡萝卜的染色体组中。PCR检测AB图13部分水稻及胡萝卜再生植株的PCR检测28斑点杂交检测AB图14部分水稻再生植株的斑点杂交检测结果A水稻1～7:转化再生植株编号KA1、KA3、KA4、KA5、KA6、KA8、KA118：未转化的再生植株9：阳性对照（质粒pMD18-T-KGF）B胡萝卜1：阳性对照（质粒pMD18-T-KGF）2～4:转化再生植株编号HK1、HK3、HK75：未转化的再生植株

取转基因植株的叶片提取总DNA，进行斑点杂交。结果显示部分再生植株的DNA与地高辛标记的探针结合，在底片的显影中呈现黑色斑点（图14)，进一步证实了PCR检测结果的可靠性。

斑点杂交检测AB图14部分水稻再生植株的斑点杂交检测结果29反转录PCR检测AB图15部分水稻及胡萝卜再生植株的RT-PCR检测结果A水稻1:阴性对照(未转化植株cDNA为模板)2～5:转化再生植株编号KA3、KA4、KA5、KA6cDNA为模板6:DNAmakerDL2000B胡萝卜1:阴性对照(未转化植株cDNA为模板)2～5:转化再生植株编号HK1、HK3、HK5、HK7cDNA为模板6:DNAmakerDL2000提取再生植株的总RNA，经反转录反应合成cDNA，cDNA作为反应模板，扩增出长度约为500bp的清晰条带，而阴性对照（未转化植株）没有相应的扩增条带（图15）。说明目的基因已在转化植株中正常转录。

反转录PCR检测AB图15部分水稻及胡萝卜再生植株的RT-30Westernblotting检测结果

图16水稻再生植株的westernbotting检测结果1:再生植株KA3;2:再生植株KA4;3再生植株KA5;4:再生植株KA6;5:未转化植株小结

综合以上对部分的水稻再生植株的southernblotting、RT-PCR及westernbotting检测的结果，可以看到水稻植株KA4及植株KA6表达了转基因蛋白人角质细胞生长因子。胡萝卜植株HK1、HK5、HK7中人KGF基因得以转录。

Westernblotting检测结果图16水稻再生31谢谢！谢谢！32植物生物反应器课件33

1植物反应器概述植物生物反应器定义优点：（1）蛋白翻译后正确修饰、加工，（2）生产成本低，（3）生产工艺简单，（4）存储、使用简单方便，（5）使用安全。

1植物反应器概述植物生物反应器定义34角质细胞生长因子概述

（1）角质细胞生长因子(keratinocytegrowthfactor,KGF)是1989年由Rubin等首先从人胚胎肺成纤维细胞的生长培养液中分离出来的。是成纤维细胞生长因子家族的成员之一。（2）KGF基因编码一有194个氨基酸的蛋白质。基因含有三个外显子和两个内含子。（3）KGF是由间充质来源的细胞产生的，通过旁分泌途径特异地作用于上皮细胞。（4）KGF具有很强的促上皮细胞分裂的功能。角质细胞生长因子概述（1）角质细胞生长因子(keratin35角质细胞生长因子的生物学功能KGF在生长发育中器官的分化、形成中起重要作用

1、肺表皮细胞的生长、分化和成型及肺的分支形成中起着重要的作用。2、动物的精囊发生。损伤修复功能及减少化疗的损伤1、皮肤损伤修复，2、肠胃损伤的修复，3、减少放化疗的伤害。角质细胞生长因子的生物学功能KGF在生长发育中器官的分化、形36以胡萝卜、水稻为植物反应器表达KGF的意义首先，具有植物反应器的优点胡萝卜（1）营养丰富（2）营养保健品食用含KGF的胡萝卜可以辅助治疗肠胃疾病，药敷则可加快皮肤伤口的愈合。因此在胡萝卜中表达高活性的KGF将具有重要的商业价值。以胡萝卜、水稻为植物反应器表达KGF的意义首先，具有植物反应37水稻(1)美容保健品(2)“米疗”在水稻中表达人KGF，这无疑给水稻这位美容新秀更添一“亮点”，即使用萃取的水稻精华及水稻中表达的人KGF可以在对皮肤进行保养的同时加快伤口、疤痕的修复，角质细胞更新。水稻38技术流程

角质细胞生长因子的核苷酸序列的获得植物水稻、胡萝卜表达体系的建立筛选培养基上抗性苗的获得农杆菌介导的转化检测植物表达载体的构建共培养，筛选出抗性愈伤GUS检测PCR检测SouthernbottingRT-PCR检测Westernbotting技术流程角质细胞生长因子的核苷酸序列的获得植物水稻、胡萝39

角质细胞生长因子的核苷酸序列的获得

重叠延伸PCR方法获得角质细胞生长因子编码序列1）重叠延伸PCR介绍

2）外显子2、3的获得外显子2：2号引物：5’-GAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCA-3’3号引物：5’-TGCATTCTTTCTTTGCATAGAGTTT-3’外显子3：4号引物5’-CTATGCAAAGAAAGAATGCAATGAA-3’3’(3)引物5’-GAATTCTTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3’

用人肺组织块提取的DNA为模板，PCR获得相应的外显子序列。角质细胞生长因子的核苷酸序列的获得

重叠延40外显子1的获得1号引物5’-GATTTCCATGATATTGTAATTATTCTTCA-3’Ⅰ5’-GGCGGATCCTCTAGAATGTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATGTGAA-3’

Ⅱ5’-TCCATGTAATCATAACTTCTTGTGTGTCGCTCAGGGCTGGAACAGTTCACATTTGTAGC-3’

Ⅲ5’-ATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAAGAGTGAGAAGACTCTTCTGTCGAACACAGTGG-3’

Ⅳ5’-GGGTCCCTTTTACTTTGCCTCTTTTATCGATCCTCAGGTACCACTGTGTTCGACAG-3’

Ⅴ5’-CAAAGTAAAAGGGACCCAAGAGATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGAC-3’

图1、外显子1核苷酸获得图示

外显子1的获得图141KGF全长的获得图图2KGF序列获得图示

KGF全长的42KGF三段外显子及全长的凝胶电泳图图3、PCR产物凝胶电泳图MDNAmarkerDL20001外显子1,2外显子2,3外显子34阴性对照

图4、KGF核苷酸凝胶电泳图M、DNAmarkerDL2000,1、KGF片段外显子1为193bp的核苷酸片断，外显子2为104bp的核苷酸片断，外显子3为192bp的核苷酸片断，总长为500bp左右。经凝胶电泳后，与预期的大小一致。KGF三段外显子及全长的凝胶电泳图图3、PCR产物凝胶电泳图43获得序列的测序结果BamHIXbalIEcoRIGGATCCTCTAGAGATTGAATTCTTAAGTTATTGCCATAGGAAGAAAGTGGGCCGTTTTTTGTTCTTTCTTCGTTTTCTTCCCTTTGACAGGAAGCCCCTTTTGATTTAAGGCCACGAACATTTCCCCTCCGCTGTGTGTCCATTTAGCTGATGCATAGGTGTTGTAATGGTTTTCCAGAATCAGTTCTTTGAAGTTGCAATCTTCATTGCATTCTTTCTTTGCATAGAGTTTCCCTTCTTTGTTCATGGCAAGATAGTATTCACTTTCCACCCCTTTGATTGCCACAATTCCAACTGCCACAGTCCTGATTTCCATGATATTGTAATTATTCTTCATCTCTTGGGTCCCTTTTACTTTGCCTCTTTTATCGATCCTCAGGTACCACTGTGTTCGACAGAAGAGTCTTCTCACTCTTATATCCCCTCCTTCCATGTAATCATAACTTCTTGTGTGTCGCTCAGGGCTGGAACAGTTCACATTTGTAGCCATTTGCTCTGGAGTCATGTCATTGCAAGCCATTCTAGAGGATCCXbalIBamHI获得序列的测序结果BamHIXbalI44测序得到的序列提交genbank比对，核苷酸的同源性达96.0％。将翻译后的蛋白序列提交genbank比对，蛋白质同源性达98.8％。核苷酸比对结果：

测序得到的序列提交genbank比对，核苷酸的同源性达45蛋白比对结果：

将所获得的KGF核苷酸编码序列与Genbank中已有的KGF核苷酸序列比对，核苷酸序列同源性达96.0%（其中外显子1为100%同源，差异都位于外显子2和外显子3中）。由于外显子1根据genbank序列设计，因而外显子1与genbank上的数据100%同源,同时这也说明了在本实验延伸PCR的过程并不存在碱基的突变，或碱基突变的频率比较低。而外显子2、外显子3与genbank的差异推测为人种间的差异。氨基酸序列比对，同源性达98.8%。成熟肽的第122-132个氨基酸之间是KGF的受体特异性结合位点，在此位点无氨基酸位点突变。蛋白比对结果显示第36、40、43位点存在差异，但研究发现成熟肽的前19个氨基酸丢失并不会影响成熟肽的活性，因此这些位点的差异不会影响蛋白的活性、功能。

蛋白比对结果：将所获得的KGF核苷酸编码序列与G46

植物表达载体的构建中间载体pBPFΩ7-KGF的构建pBPFΩ7中含有CaMV35s启动子及NOS终止子，将KGF编码序列插入CAMV35s启动子与NOS终止子之间（命名CAMV35s-KGF-NOS），将使人KGF基因能在植物中表达。

载体pBI1301-KGF的构建

将中间载体pBPFΩ7-KGF经PstⅠ酶切后，回收CAMV35s-KGF-NOS片段。同时，将载体pBI1301用PstⅠ酶切、去磷酸化后回收。将两回收片段连接，转化大肠杆菌

质粒构建如下图植物表达载体的构建中间载体pB47植物生物反应器课件48植物生物反应器课件49植物生物反应器课件50

质粒构建鉴定结果图5质粒pMD18-T-KGF阳性克隆酶切鉴定图MDNAmarkerDL20001pMD18-T-KGF/BamHI酶切图6质粒pBI1301-KGFPCR鉴定凝胶电泳图1pBI1301-KGFPCR鉴定结果MDNAmarkerDL2000

图7质粒pBI1301-KGF阳性克隆酶切鉴定图1pBI1301-KGF/EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切MDNAmarkerDL2000+15000质粒构建鉴51图5、6、7的鉴定图都可以看到500bp左右的KGF目的条带。同时图7中有一1500bp左右的条带，为CAMV35s片段。图7的酶切结果与预期结果相同，说明CAMV35s-KGF-NOS已经连接于pBI1301。将质粒pBI1301-KGF转化农杆菌EHA105，获得植物侵染菌株。图5、6、7的鉴定图都可以看到500bp左右的KGF目的条52植物水稻、胡萝卜表达体系的建立

1、日本晴培养基：1）诱导培养基MB（MS的大量元素、铁盐、肌醇加B5的微量元素、维生素）+2,4-D2mg/L；2）继代培养基MB+2,4-D2mg/L；3）共培养培养基MS+2,4-D4mg/L+AS；4）筛选培养基NB（N6的大量元素、铁盐、肌醇加B5的微量元素、维生素）+2,4-D2mg/L+Cb500mg/L+Hyg100mg/L；5）预分化培养基NB+ABA2mg/L+6-BA3mg/L+NAA1mg/L+Cb250mg/L+Hyg25mg/L；6）分化培养基NB+6-BA3mg/L+NAA1mg/L+Sorbitol13g/L+Cb250mg/L+Hyg25mg/L2、胡萝卜培养基1）诱导愈伤（继代）培养基MS+2,4-D0.1mg/L2）共培养基MS+2,4-D0.1mg/L+As50mmol/3)筛选培养基MS+2,4-D0.1mg/L+Hyg40mg/L+Cb300mg/L4)诱导胚状体培养基MS+2,4-D0.001mg/L+Hyg20mg/L+Cb100mg/L5)分化培养基MS+Hyg40mg/L+Cb100mg/6)生根壮苗培养基1/2MS+NAA0.2mg/L植物水稻、胡萝卜表达体系的建立

1、日本晴培养基：53水稻及胡萝卜愈伤的诱导AB图8水稻及胡萝卜胚性愈伤A、水稻胚性愈伤:

水稻幼胚在诱导培养基诱导4天后长出约1cm芽,芽的基部出现颗粒状的愈伤组织。将芽从基部掐出,将剩余的颗粒状的愈伤接种至新愈伤诱导培养基中,2周后,愈伤长至直径0.5～1.0cm,呈现淡黄色,半松散状颗粒,可用作遗传转化

B、胡萝卜胚性愈伤:

将胡萝卜韧皮部切块、消毒后接种于愈伤诱导培养基中，二周后在红色的韧皮部组织块上长出淡绿色的愈伤组织块。将愈伤组织块掐下接种于新的愈伤诱导培养基中培养二周后即可用作遗传转化

水稻及胡萝卜愈伤的诱导AB图8水稻及胡萝卜胚性愈伤54

农杆菌介导的遗传转化

1）农杆菌的培养吸取－20℃保存的甘油菌于15mLLB（含Kan50μg/mL）液体培养基中，28℃振荡32h，吸取150μL农杆菌液涂LB（含Kan50μg/mL）平板，28℃培养2-3d。2）农杆菌感染愈伤组织块将培养了2-3天的农杆菌用共培养液体培养基悬浮，将愈伤组织浸泡在菌液中，并在菌液中加入AS至浓度为100μM。于摇床中缓慢摇动15min。3）农杆菌与愈伤组织块共培养将愈伤组织块从菌液中取出，置于无菌滤纸上吸干，而后移入共培养基中，在培养基表面铺一张无菌滤纸。4）抗性愈伤组织的筛选共培养2-3d后，再把愈伤组织块移到筛选培养基上，2周继代一次，继代2次。5）预分化（水稻）挑选直径1-2mm生长良好、结构致密的抗性愈伤组织转移入预分化培养基中，25℃，12h光照培养，预分化时间一般为2周。6）分化及再生培养将预分化后的抗性愈伤组织转移至分化培养基上进行分化培养，待再生出小苗，转移至水中培养两周后，移栽到土里。

农杆菌介导的遗传转化

55抗性愈伤的筛选

水稻：经过1周的筛选培养，愈伤褐化。而后，再经过4-5天，褐化的组织上长出淡乳白色，略透明，生长相对旺盛的抗性愈伤。胡萝卜：经过大约为2周的筛选，愈伤褐化。而后，再经过1周，褐化的组织上长出淡绿色，略透亮，生长相对旺盛的抗性愈伤。

抗性愈伤的筛选

水稻：经过1周的筛选培养，愈伤褐化。而后，再56

筛选培养基上抗性苗的产生

A、水稻抗性苗：抗性愈伤在筛选培养基中长大至直径为5mm时移至预分化培养基中，一周后可以看到愈伤上有绿点产生。抗性愈伤于预分化培养基培养2周后移至分化培养基中，在分化培养基中二周后，每个愈伤长出1～4棵小苗

B、胡萝卜抗性苗：抗性愈伤转至新的筛选培养基中继续培养，待抗性愈伤长大至直径为5mm时移至分化培养基中。抗性愈伤于分化培养基中光照培养后，愈伤变为绿色，一周后有深绿色的芽点长出。再经过二周后长大成苗

AB筛选培养基上抗性苗的产生A、水稻抗性苗：抗性57AB图10GUS基因在水稻转化体中瞬时表达A、为共培养后的GUS检测图B、未转化的阴性对照AB图10GUS基因在水稻转化体中瞬时表达58AB图11GUS基因在胡萝卜转化体中瞬时表达A、为共培养后的GUS检测图B、未转化的阴性对照

在转化共培养后（3d）检测GUS基因的表达，愈伤组织染色后呈现蓝色（图10、图11），而未转化的愈伤组织无蓝色出现，表明外源基因片断在植物的愈伤组织细胞中得到瞬时表达。AB图11GUS基因在胡萝卜转化体中瞬时表达在597、2GUS基因在抗性植株中的表达检测

ABCD图12GUS基因在水稻及胡萝卜再生植株