互花米草生物质形成及其工业化利用研究

Formation,propertiesandindustrialutilizationofSpartinaalterniflorabiomassDissertationSubmittedtoNanjingUniversityofTechnologyinpartialfulfillmentofforthedegreeDoctorof Prof.kaiProf.JishuangChenSeptember20131979年引种到我国以来，在防风护沙、保滩护堤等方面发挥了积极的作用，同时也给沿海生态系统带来了一定的影响，2003年国家环保将其列入首批苇的3~5倍。30多年来，该植物在我国的总面积已达到了近50000纤维生物质资源有效利用为目标，对互花米草秸秆组织特性进行理化分析，开本主要研究结果如下利用Solexa高通量系统对互花米草叶片总RNA的miRNA进序为3529847条，占数据总量的47.7%。通过生物信息学分析，共获得475miRNA169为包含成员最多的，有31个成员，miRNA156有29个成员，miRNA166中有23个成员，miRNA167中有20个成员，为进一步鉴定高通量获得miRNAs的调控靶及其功能，本研13631689UniqueRawReads1183460条，cDNAReads1111463CoverdcDNAs11752条。通过生物信miR7729和miR7782）和31个新的（PC型）miRNA靶。通过对miRNA靶GO富集分析，发现miRNA靶主要在细胞代谢、细胞分化和生物合成等靶主要参与光合作用、磷酸戊糖途径、果糖/甘露糖代谢、光合生物固碳、乙醛酸/二羧酸代谢、氧化磷酸化、糖酵解/糖异生、柠檬酸循环（TCA循环）和本研究同时利用Cy5杂交技术检测互花米草在盐土与非盐土种植条812317miRNA量的21%。这些显著差异表达的miRNAs分布于53个miRNA中，主要包括miR529，miR535，miR156，miR164，miR167，miR168，miR171，miR395和miR474等，其中miR529为检测到成员最多的，拥有7个成员。通过靶注释分析，发现far-miR1134，osa-miR2919和vvi-miR167c的靶主水抽出物、1%NaOH抽出物、苯-醇抽出物、克拉森木素、综纤维素、戌聚糖含1.06mm，长宽92.00，壁腔比0.36，平均长度较短，接近于杨木，纤维宽度较大，大于芦苇80%以上（40目纤维束，工艺简洁实用，环保无污染，达到了新型秸秆纤维材料的工艺标准，的新型纤维材料可作利用抄纸工艺将该纤维束与造纸污泥混合使用纤维污泥板，板材密度达976.40kg·m3，硬挺度134.50mN.m0.79~0.82Mpa，符合作将该纤维束与三聚胺-玉米淀粉复合，在平板硫化机成型机T250较发现竹粉餐碗的刚性较强，在567.10N时外部出现明显的裂纹，而互花米草固体提取物和变形极限检测结果均符合FDA对于该产品的质量要求。将该纤维束与化学纸浆复合，经纸浆模塑成套工艺技术，大宗工业25000吨纤维包装材料生产线，已将该科技成果实现。本新地我沿植互米为究象在录水统析互米的达控重点和现该物盐快速生长及纤维生物质合成等生物学特性相关的miNs究以互花米草秸秆生物质为研究对象，对其理化性能及纤维特性进行了系统分互花米草microRNA 生物质基础工业包装材Spartinaalterniflora(S.alterniflora)isaperennialherbaceousgrassthathasbeenintroducedintoChinasince1979,primarilyinanefforttoprotectcoastalsandbeachareasfromerosion.Ithasaccordinglyplayedapositiveroleinthisaspect,butalsohashadacertaindetrimentalimpactoncoastalecosystems,suchthatin2003itwasamongthefirstplantsincludedintheofficiallistofinvasivealienspeciesinChina.S.alternifloraisatypicalhalophyte,havingdevelopedastrongsaltstresstolerancethatallowslong-termadaptationoftheplanttohighsaltcontentcoastalhabitats.Inaddition,thecharacteristicprolificreproductionandefficientphotosyntheticmechanismofS.alterniflora,withafastandefficientbiomasssynthesis,haveresultedintheproductionofaconsiderableamountofbiomassmaterialfromthisspecies,itssynthesisofbiomassperunitareais3~5timesofreed.Overapproximaythepast30years,suchinvasiveplantsinChinahavereachedatotalareaofoccupationnearly50000hm2,withtotalmassproductionofapproximayonemilliontons,thetotalbiomassofJiangsuprovincereachedmorethanhalfofthetotalqualityinChina.Thus,thecomprehensivedevelopmentandutilizationofsuchanamountofbiomassforenergyandotherapplicationshasconsiderablepotential.BasedonS.alterniflorasalttoleranceandsubmergenceandfastandbiomasssynthesiscapabilitiesandabundantbiomasscharacteristics,thisthesisisfirstlyconcernedwiththestudyoftheregulationofthemicroRNAbiologyofS.alterniflora,inordertoyzeteexpressionmechanismsandregulationatthetranscriptionalgrouplevel.TheresultinginformationongeneticresourcesandefficientplantbiomasssynthesismechanismwillprovideatheoreticalfoundationforthecomprehensivemanagementandeffectiveuseofS.alterniflorabasedontheavailablescientificevidence.Secondly,thisthesisisconcernedwitheffectiveutilizationofS.alterniflorabiomass,throughanin-depthysisofthebiomassstructuralcharacteristicsofS.alterniflora.ThisysisisfollowedbythedevelopmentofcleanpultechnologyofS.alterniflorabiomassandsubsequentindustrializationtoprovideaneffectiveuseofS.alterniflorabiomasspulpandstrawbiomassinlarge-scaleindustrialutilization,andtoproviderelevantdataonthecorrespondingapplication.ThemainresultsofthispaperareasS.alternifloraleaftissuesweresequencedafterusingtheSolexahigh-throughputsequencingsystems.Atotalof7,392,528smallRNAreadswereobtained,withthenumberofmapdata(mappablereads)of3,529,847,representing47.7%ofthetotalsequencing.BasedongenomemapandthemiRBaseresultsandhairpinprediction,andstatisticalysisusingbioinformatics,atotalof475pre-miRNAsand432miRNAs,bothknownandnovel,wereidentified.Fromthetotalof331maturemiRNAsannotatedinmiRBaseforS.alterniflora(Sal-miRNA),248uniqueSalmiRNAsweredetectedinthelibraries,representingall110knownSal-miRNAfamilies.Overall,thelargestfamilyrepresentedwasmiR169,with31membersrepresentingmiR169variantsfoundindifferentspecies.OftheremainingmiRNAfamilies,miR156(29members),miR166(23members),miR167(20members),andmiR1120/395(19members),otherscontainedbetween1to13members.BasedontheobtainedS.alternifloramiRNAssequenceddatabase,degradationsequencingwasusedtofurtherunderstandthefunctionofmiRNAgenes.Obtainingtherawreadsis13,631,689,ofwhichuniquerawreadssequenceis1183,460,cDNAmappedreadssequenceis1,111,463,ofwhichcoverdcDNAssequencestotalis11,752.Afterremovingredundantdegradationsequencing,wefound30conservedmiRNAs(miR156,miR159,miR160,miR161,miR162,miR163,miR164,miR167,miR393,miR396,miR398,miR774,miR812,miR1440,miR1851,miR1857,miR1863,miR2097,miR2118,miR5077,miR5155,miR5368,miR5380,miR5501,miR5521,miR6173,miR6256,miR6483,miR7729andmiR7782)and31new(PCtype)S.alternifloramiRNAgenes.GOenrientofmiRNAgenesindicatedthatthefunctionsofmiRNAgenesaremainlyincellmetabolism,celldifferentiationandbiosyntheticprocesses.TheresultsoftheKEGGpathwayshowthatpathwaysofmiR156d,miR160c,miR396candmiR6173genesincludephotosynthesis-antennaprotein,pentosephosphatepathway,fructoseandmannosemetabolism,sequestrationphotosyntheticorganisms,glyoxylicacidandadicarboxylicacidmetabolic,oxidativephosphorylation,glycolysis/gluconeogenesis,citricacidcycle(TCAcycle),andpyruvatemetabolism.TheysisofmiRNACy5labeledmonochromechipdetectedS.alternifloramiRNAinsalineandnon-salinesoil.Therewere286miRNAsdetected,with23miRNAfamiliesof81miRNAdifferentiallyexpressedsignificantly,ofwhichthereare17inrice,accountingfordifferencesinexpressionof21%ofthetotalamountofmiRNA.DifferentiallyexpressedsignificantlymiRNAsweredistributedin53miRNAfamilies,includingmiR529,miR535,miR156,miR164,miR167,miR168,miR171,miR395andmiR474.ItwasfoundthatmiR529istheumrepresentedfamilywithsevenfamilymembers.GeneannotationsshowedthattherearethreemiRNAgenes,namely,far-miR1134,osa-miR2919andvvi-miR167c,functioningthroughregulatedgenestoadjusttocellsignaltransduction,stressresponse,carbohydratemetabolismandbiosyntheticTakingS.alterniflorastrawbiomassasthebasisforthestudy,thepossibleindustrialutilizationandapplicationofthestrawbiomasswasdeterminedfromthechemicalcompositionofthefibersandthefibrousmaterialbasis.PhysicalandchemicalpropertiesofS.alterniflorastrawfibersfromtestresultsshowedash,hotwaterextract,1%NaOHextract,benzene-alcoholextract,klassenlignin,holocellulose,andglycanscontentswere8.73%,10.97%,37.95%,4.22%,24.62%,69.60%,and23.75%respectively.Amongtheseresults,theashandsaltcontentsarerelativelyhigh,andarebelievedtoberelatedtothesaltwaterbeachgrowthenvironment.TheS.alternifloraklasonlignincontentishigherthanthatofwheatstraw,royalgrass,orpoplar,andslightlylowerthanthatofreeds.AveragefiberlengthofS.alterniflorais1.06mm,aspectratio92.00,cellwallratio0.36.Theaveragefiberlengthisshorterthanthatofmanyotherfibermaterials,closetothatofpoplar.TheaverageS.alterniflorafiberwidthislargerthanthatofreedsandPennisetumandothermaterials.TheseresultssuggestthatS.alterniflorastrawfibermaybepreparedforpulundercertainconditions.AccordingtothephysicalandchemicalcharacteristicsofS.alterniflorastrawbiomass,acleanpulpproductionlinewasestablished.Usingawetpreparationsystemwithacertainamountofadditives,thestrawfibersweresprayedtoundergoswellingandsoftening,with panyingtensionreduction,andpreparedfor andintroductiontothepulmachine.Fiberpulp(fromS.alterniflorastrawbundles)waspreparedthroughasimpleandpracticalprocessthatisalsoenergysavingandenvironmentallyprotecting(minimizingpollution).Thisprocessiscapableofproducingtonsofstrawproductionwithayieldof80%(40meshfiberpulp)whichcanbeusedtoproducevariousstrawfibermaterials,includingnovelfiber-basedbulkindustrialpackagingmaterials.AccordingtothepreparationofnewfibrousmaterialsfromS.alterniflorastalks,thispaperinvestigatestheuseofinnovativematerials,andbothwetanddryprocessing,tomakenewindustrialproducts:Weusefiberbundlesandrecycledcopypapersludgefiberstopreparesheetswithdensityof976.40kg/m3,stiffnessof134.50mN.m,andaburstof0.79~0.82Mpa,whichcanbeusedaspackagingmaterials,orprotectiveindustriallinersforshiporcontainment,orasbarriersforcoastalbeachsalt,orimpermeableandsemi-permeablemembraneseparatorsforvariousapplications.Fiberbundlescombinedwithmelamine-maizestarchcompoundadditivesinahydraulicvulcanizingpressmoldingmachineT250,toproducedishesand'green'eatingbowlswithflatplatemoldsandbowlmoldplates.Compressionstrengthtestsdeterminedthatbamboopowder-basedbowlshadstrongrigidity,withexternalobviouscracksoutsideatappliedcompressionstrengthof567.10N.However,S.alterniflorafiber-basedbowlshadgoodflexibility,tocompressiontestingprocess,anddidnotshowsignificantexternalcracking.DeformationlimitdetectionandsolidextractresultsmettheFDArequirementsfortheproductqualitystandards.Compositefiberbundlesandchemicalpulps,basedonS.alterniflorafibersasoneofthecomponents,wereusedtopreparevariousmoldedindustrialpackagingproducts,suchasfruittrays.TheresultsshowthatS.alterniflorafiber/wastepaperpulpmixtureswithcomposition30%wt.,effectivelyenhancethepuleffect,andalsoimprovedthestrengthofthefruittrays.Comparisonofthevariousbufferingperformancesfoundthatadding40%S.alterniflorafiberbundlestothecompositionofthefruittraysenhancedtheperformancecomparedtoadding30%S.alterniflora,whieetsthequalityrequirementsoffruittraypackagingmaterials.Thisstudyprovidesbothatheoreticalandtechnicalbasisforthebulkindustrialoffibrousmaterials.Overthepasttwoyears,thistheoreticalresearchandpracticalapplicationshelpedacompanytoestablishaproductionlineforfiberpackagingmaterialswithannualoutputof5,000tons,realizingtheindustrializationofthescientificandtechnologicalachievementspresentedinthisthesis.Insummary,thisthesisisfirstlyconcernedwithinnovativeresearchonS.alterniflorabiomass,ysisoftheexpressionofitsgenesandregulationinthetranscriptomelevelsystem.Theresearchanddiscoveryofthehighplantsalttoleranceandbiomasssynthesisofthisinvasiveplantspeciesandotherbiologicalcharacteristics,associatedwithitsmiRNAs,provideabiosyntheticbasisforexploitinguseoftheplantmoleculargeneticresourcesofS.alterniflora.Simultaneously,theS.alternifloraplantstrawbiomasswasinvestigatedfortheeffectiverealizationofindustrializationaccordingtoitsphysicochemicalpropertiesandfibercharacteristics.TheeconomicalandefficientutilizationofS.alterniflorabiomassasrealizedinthisthesisshowsitispossibletofindnewandeffectivewaystoachievelarge-scaleindustrializationofstrawbiomassutilizationthroughastudyoftherelevanttheoryandpractice.Spartinaalterniflora,MicroRNA,Biosynthesis,Materialbase,Industrialpackagingmaterials.......................................................................................................I 插 表 符号及缩写词 第一章综 互花米草的研究现 互花米草的和分 互花米草的生物学特 植物抗逆稳态生长的研究进 渗透平衡与离子稳态的建 光合作用与抗氧化系统的调 植物内源激素及转录调控的信号通 植物抗逆生长相关miRNA的研究进 植物miRNA研究技术与方 互花米草生物质资源研究概 互花米草高耐受性生长及其生物质合 互花米草生物质的综合利用概 秸秆生物质及其综合利用现 秸秆生物质及其物质组 秸秆生物质综合利用进 秸秆生物质综合利用概 纤维生物质工业化利用进 本课题研究目的与意 第二章米草属种属鉴定与亲缘关系分 前 米草属植物的ITS序列分 实验材料与方 结果与讨 互花米草的进化及亲缘关系分 实验材料与方 结果与讨 本章小 第三章互花米草纤维生物质合成的miRNA调控初步研 前 互花米草miRNA高通量及分 实验材料与方 结果与讨 小 互花米草miRNA降解组及靶注 实验材料与方 结果与讨 小 互花米草miRNA差异表达分 实验材料与方 结果与讨 荧光定量PCR鉴 小 本章小 第四章互花米草生物质资源化利用的纤维特性分 前 互花米草的生物学特征观 实验材料与方 结果与讨 小 互花米草秸秆的组织特 实验材料与方 结果与讨 小 互花米草纤维的化学组成及纤维形态观 实验材料与方 结果与讨 小 互花米草秸秆清洁制浆的工艺技 实验材料与方 结果与讨 小 本章小 第五章互花米草生物质资源化利用工艺的初步研 前 互花米草纤维束与造纸污泥湿法污泥纤维 实验材料与方 结果与讨 小 互花米草纤维束与玉米淀粉复合环保餐 实验材料与方 结果与讨 小 互花米草纤维束与化学纸浆复配制作纸浆模塑水果托 实验材料与方 结果与讨 小 本章小 第六章全文总结与展 全文总 本的创新 本研究成果的应 展 参考文 成 致 插图1-1米草属系统发育关 图1-2互花米草植物在的分 图1-3互花米草的盐 图1-4植物纤维的结构 图1-5细胞壁木质次生壁结构示意 图1-6纤维素分子链结构 图1-7木聚糖结构示意 图1-82010年各种农作物秸秆在总资源量中的占 图1-92010年我国秸秆综合利用率情 图1-102010年我国造纸原料结构分布 图1-11传统化学制浆工艺流程 图1-12常规纸浆模塑生产流程（团队制作 图2-1内转录间隔区 图2-2ITS克隆序列在NCBI数据库中的比对结 图2-3ITS序列的进化树分 图2-4互花米草及其它物种亲缘关系 图2-5植物界叶植物miRBase数据 图3-1盐土种植（S）与非盐土种植(N)下互花米草叶片内总RNA的提取结 图3-2互花米草cDNA文库构建示意图（团队制作 图3-3互花米草叶片microRNA高通量结 图3-4各类型非编码RNA在Rfam数据库中的分布 图3-5互花米草miRNA所得序列长度分 图3-6miRNA的第一核苷酸偏向 图3-7互花米草保守miRNA在其它物种中的分 图3-8降解组文库构 图3-9识别miRNA靶降解组数据的示意图步骤（团队制作 图3-10分析鉴定miRNA靶的降解组数据流程图（团队制作 图3-11GO细胞成分，GO分子功能和GO生物学过程的GO分类注 图3-12降解组证实的miRNA靶切割位点（t- 图3-13miRNA与靶的网络通路 图3-14互花米草（盐碱土与普通土）检测的结果信号 图3-15互花米草检测到的不同miRNA差异表 图3-16检测到的miRNA在其他物种中的分 图3-17互花米草中miRNA的成 图3-18miRNA与靶的网络通路 图3-19检测与高通量获得miRNA的数量统 图3-20荧光定量PCR结 图4-1互花米草在滩涂的生长情况（10月上旬，11月中旬 图4-2互花米草根部环境（10月上旬 图4-3互花米草的花序（10月中旬 图4-4大丰港滩涂生境..................................................................图4-5互花米草叶片表皮SEM...........................................................图4-6互花米草叶片横切面SEM.......................................................图4-7互花米草茎秆表皮SEM...........................................................图4-8互花米草茎秆横切面SEM.......................................................图4-9光学显微镜下互花米草纤维各类细胞图（400×, 图4-10新型生物质纸浆加工流程 图4-11互花米草秸秆原料的收集与堆 图4-12互花米草秸秆切断除尘与磋磨分丝成浆料（纤维和纤维束 图4-13互花米草纤维及纤维束分级示意图（20，40，60目 图5-1污泥纤维板生产流 图5-23种污泥纤维板产品示意 图5-3环保餐具加工工艺流程 图5-4环保餐盘的实物图（互花米草纤维为主要原料 图5-5环保餐碗的实物 图5-6秸秆生物质加工纸浆模塑产品的工艺示范流程图（团队制作 图5-7原色果托盘实物图（正面、与局部 图5-8染色果托盘实物 图5-9纸浆模塑水果托盘一般应力应变曲 图5-106种类型果托盘的压缩性和缓冲性能（左图与右图 图5-11工业包装生产线与轻质物流托架产品（左图与右图 表表1-1转录组发现互花米草重要生态价值的..........................................表1-2常见植物纤维组分及比 表2-1主要仪 表2-2主要试剂列 表2-3PCR引 表2-4PCR反应体系（50μl）与扩增程 表2-5比对和进化分析的ITS的序列信 表3-1主要试剂列 表3-2主要仪 表3-3盐胁迫与非盐胁迫下互花米草叶片组织提取的TotalRNA的浓度和纯 表3-4miRNA数据统 表3-5GO的富集性分 表3-6降解组所获得以及匹配到组的reads 表3-7降解组获得互花米草microRNA靶结果 表3-8miRNA靶GO富集的注 表3-9miRNA靶的Kegg通路分 表3-10互花米草miRNA探 表3-11互花米草miRNA信号 表4-1实验仪 表4-2实验仪 表4-3实验试 表4-4实验仪 表4-5实验试 表4-6互花米草及相关植物秸秆抽提物的含 表4-7互花米草及相关原料灰分含 表4-8互花米草及相关原料综纤维素和戊聚糖含 表4-9互花米草及相关原料克拉森木素含 表4-10互花米草及相关原料的纤维尺 表4-11互花米草及相关原料纤维长度统计处理结 表4-12互花米草及其相关原料纤维的壁厚与腔 表4-13实验仪 表4-14实验试 表5-1实验仪 表5-23种污泥纤维板的性能指 表5-3实验仪 表5-43种不同餐具产品检测结 表5-5植物纤维/三聚胺（60/100）复合材料的抗压缩性 表5-6实验仪 表5-7不同浆料的水果托盘性 符号及缩写词略 英文全 中文全 National biothchnology国立生物技术信 Untranslated pri- Primary DEPC- Distilledwatertreatedwith transcription-polymerse Gene Pre- miRNA PostTranscriptionGene Openreading RNAInducedSilencing 第一章互花米草的研究现状互花米草的和分很强的耐盐、耐淹和抵抗风浪能力[1]。目前为止，米草属全球共有17种，其中狐米草Spatens(Aiton)Muhl，密花米草SdensifloraBrongn.，欧洲米草SmaritimaTrin.S.Trin.，S.arundinacea(Thouars)Carmich.，S.bakeriMerr.，S.ciliataBrongn.，S.caespitosaEaton.，S.pectinataBoscexLink.，S.×longispicaHauman&ParodiexHubbard.S.×neyrauti和唐氏米草S.×townsendiiH.&J.Groves[2]，米草属系统发育关系如图1-1。1-1米草属系统发育关系Fig.1-1Phylogenyoftus年从英国等地引进了大米草（S.anglica）苗和[6]，并由江苏省农科院新洋试但大米草在改善海滩生态环境和保滩护岸中效果不明显[8]1979年仲崇信先生与佛罗里达分别引进了3种不同生态型的互花米草、孤米草和大蝇草，以取代植南达广西，覆盖了除海南岛、岛以外的全部沿海省份，见图1-2。1985年大草的生物量锐减至50hm2以下[10-11]，而互花米草在我国的总量达到了hm2，剩下的5000hm2大部分分布在长江河口、三角洲和渤海沿海地区，图1-2互花米草植物在的分布Fig1-2.DistributionofS.alterniflorasaltmarshesin互花米草的生物学特征长，茎叶都有叶鞘。花期为7-10月，由3-13个长3-15cm或5-15cm直1-1.8cm16-24小穗，小穗侧扁，呈覆瓦状排列，为两性花，花药纵向开裂，长0.5-0.7cm，子房平滑，2个白色羽毛状柱头50cm1-2m[14]株根状茎蔓延并扩散。互花米草具有极高的繁殖系数，穗粒数可多达665粒，6小时以内仍能正常生长。互花米草适盐范围为0~3%[17-18]。1979年我国引种互花米草以来，其在减缓风暴潮压力、保护滩堤、促进家环保2003年的首批物种中，互花米草作为唯一的海岸统计显示，全球盐碱土地的总面积已超过10亿hm2，约占世界陆地面积的7.6%[25]0.27hm20.33hm2，约占耕地面积的10%[26]。土壤盐碱化严重着人类赖以生存的土壤资源，是日益互花米草因长期适应海岸滩涂的高盐生态环境，发生了一系列生理生化改（13）[28]+的吸收[29]30。1-3Fig.1-3SaltglandofS.关键及生化调控机制[31-32]。加小分子抗氧化剂GSH和游离脯氨酸等含量来适应外界盐浓度变化。等[34]植物抗逆稳态生长的研究进展建离子稳态、调节渗透平衡、诱导抗氧化系统、改变光合作用以及调节表达渗透平衡与离子稳态的建立具有更快的钠离子积累，使植物对钠离子高度敏感，引起根部细胞[44]。AtNHX1是Na＋/H＋逆向转运蛋白的另一重要成员，在Na＋进入液泡的区隔H+/ATPNa＋/H＋逆向转运蛋即钠/钾的离子比例。研究发现，拟南芥中具有调控K+吸收的高/低亲和力系吸收的高亲和力系统，以保持细胞质中具有足够的钾离子[48]。胞质较高的渗透压，促进植株在高盐条件下对水分的吸收。甜菜碱（glycinebetaine，GB）就是植物响应高盐等逆境条件下的一种渗透保护剂[49]，由胆碱单加氧酶（CMO）和甜菜醛脱氢酶（BADH）催化合成。研究表明，转CMO和BADH的植物在盐胁迫下的膜结构损伤降低，抗盐性提高[50]。脯氨酸既是酶（P5CS）是参与脯氨酸合成的2个关键酶，在盐胁迫下，拟南芥植株的P5CR转录水平提高5倍[52]。γ－氨基丁酸（GABA）是植物细胞内抵御高盐等逆调，并鉴定分析了GABA氨基转移酶的相关pop2。甘露醇和海藻糖也是有效的渗透保护剂，WuS等[54]6-磷酸甘露糖还原酶(M6PR)海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphatesynthase,TPS)转入烟草植株中,获得的光合作用与抗氧化系统的调控（CAT[60]盐胁迫对光反应的影响主要反映在对光系统I（PSI）、光系统II（PSII）和电子传递的影响[61]。PSII是进行水光解放氧的主要部位，在光合作用中起着关PSII光解放氧功能，导致其向反应中心提供的电子数还表现在暗反应过，1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）是植物光合作用的限速酶，盐胁迫可抑制Rubisco的酶活性，从而导致RuBP、磷酸甘油酸、磷酸三糖等含量下降，同时抑制Pi的再生，降低植物对CO2的吸收利用[63]。植物内源激素及转录调控的信号通路研究表明，细胞素（CTK）、脱落酸（ABA）和乙烯（ET）三种激素与植物的抗盐性有密切关系[64-65]。ABA是一种倍半萜结构的植物内源，ABACTK的表达增加，在某些抗盐的启动子附近区域具有ABA的顺式调控元件，如ABA反应因子等，因此，ABA可以诱导这些抗盐的表达[66]。植物中发现了很多与胁迫调控有关的的转录因子如MYB、AP2/ERF、AREB/ABF等[68-70]。耐盐相关功能蛋白表达或由转录因子控制的特定种类的表达，而这些的内与盐胁迫有关的信号途径主要有盐敏感(saltoverlysensitive,SOS)信号转导途径、脱落酸(abscisicacid,ABA)介导的信号通路、不依赖脱落酸的信号途径、蛋白激酶如钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependentproteinkinase,CDPK)级联反应途径、磷脂信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinaseMAPK)M．AINOUCHE等人通过转录组米草植物的根和叶片组织，发现和报在以下三个方面相关的功能信息[31]。如下表1-1所示，与盐胁迫响应相关的SNF1相关蛋白激酶，硫氧还蛋白过氧化物酶，黄嘌呤脱氢酶，玉米黄质环氧，结合结构域表达，af193802_1zinc手指转录因子wrky1的，WRKYDNA结合蛋70kDaA2，金属耐受性蛋白。与木质素和纤维素代谢相关的主要包括：纤维素酶，肉桂-还原酶，糖基转移酶48kDa的亚基前体，GDP-甘露糖焦磷酸化酶。植物抗逆生长相关miRNA的研究进展Sunkar等[75]构建了拟南芥逆境条件下的小分子RNA文库，发现26个新的miRNAmiR393在盐胁迫诱导下表达量大幅上调，miR397b和miR402小幅上调，miR389a的表达量明显下调，该研究表明，miRNA可能在植物抗逆境过有重要作用。Shen等[76-77]研究发现，水稻或拟南芥在高盐处理和miR393的表达量均呈下降趋势，植株的耐盐性提高。表1- 转录组发现互花米草重要生态价值的Table1-1EcologicallyimportantgenesfoundinS.alterniflorareferencesLu等[78]发现，在盐胁迫下，杨树中的miR530a，miR1445，miR1446a，miR1446e，miR1447，miR1711miR1711的表达量呈下降趋势，而miR4882miR1450的表达量呈上升趋势。Jagadeeswaran等研究发现，miR395c和miR395e能提高植株的耐盐性[79]。将miR169的miR169g和miR169n导入水稻后发现，水稻的耐盐性有所提高[80]。Jung等研究表明，在盐胁迫条件下，miR417对拟南芥萌发和幼苗成活都具有负调节作用[81]。Ding等利用芯miRNA表达差异[82]。Suprasanna等研究发现，甘蔗受到短暂的盐冲击以上研究表明，miRNA在植物耐盐过发挥重要的调控功能。miRNA21-25ntRNA，它由一段1993Lee等[85]在研究秀丽隐杆线虫(Caenorhabditielegan)胚胎发育过发现了第一个miRNAlin-4以来,已经通过克隆和生物信息学等方法在6月，miRNARegistryDatabase20miRNA30424200个物种[89]。的作用下，转录生成几百个核苷酸长度的初级转录产物pri-miRNA。随后，pri-miRNADicerDCL164-303ntmiRNA前体后在细胞核输出蛋白Exportin-5的同源蛋白HASTY作用下，双链miRNA：不完全互补配对，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性。2）与靶标完全互补配对，直接结合于靶miRNA上，导致靶的特异性剪切。3）具有以上2种作用模式，当与靶标完全互补配对时，直接靶向切割目的植物miRNA研究技术与方法可以同时快速检测某一物种所有已知miRNAs的表达谱，是一种高通量、高灵敏的表达检测方法。自1995问世自今,该技术已广blot、RT-PCR及直接克隆等传统的检测方法相比，miRNAmicroarray具有信息高度保守性，因此也可以根据已知的miRNA序列设计特异性探针，利用miRNAmicroarray对未知组信息植物物种的保守miRNA进行检测与分析。深度技术（miRNA技术miRNA技术仅局限于研究那些序列信息或二级茎环结构信息已知miRNA，无法快速大量的寻找和发现新的miRNA分子。深度技术是新一代RNA（RNA-seq，RNA已成为当前发现和研究miRNA的重要，大大增加了新miRNA的检出速度[93]，并且除了获取已知miRNA的表达谱之外，新一代技术在miRNA互补链、miRNA编辑、miRNA异构体检测及miRNA靶方面由于生物信息学分析等预测方法无法区分预测miRNA靶的真伪，科学家需要花费大量的时间和精力去验证这些错误的预测结果，这极大地影响了现和发展，2008German等[94]人首次运用一种新的实验方法降解组cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAendsRACE)以及高通量测序等技术的优势，已成功应用于水稻等植物miRNA的靶筛选与鉴定。降解组的原理是，植物miRNA主要通过与靶完全或几乎完全配对引起补配对的第十个核苷酸上，靶经剪切产生5'和3'两个剪切片段。其中3'5'3'polyARNA连接酶进行连接，连接产物可进一步用于下游高通量。而含有帽子结构的5'剪切片段或是其他缺少5'单磷酸的RNA则无法被RNA酶连接，因而不能对其进序分析。通过对数据进行比对分析，可以发现在mRNA序列的某个位点出现一个波峰，而该位点为候选的靶miRNA剪切位点。利用降解组，可以摆脱生物信息学预测的限制，可以有效地从实验样本中找到miRNA作用的靶。互花米草生物质资源研究概况互花米草高耐受性生长及其生物质合成速率随着光照辐射的增强而匀速上升，即使在400μmol·mol-1CO2浓度下仍可保净光合速率达24.44μmol·m-2·s-1CO2,分别是土著滩涂植物芦苇和三棱藨草的1.54倍和3.64倍[97]。由于互花米草具有高效的光合作用机制，使其碳水化合物[100]。乔治亚州盐沼中的互花米草的初级生产力为4500-7600g·m-2a-1干质量10004000和8001800gm-2-1干质量水化合物含量，在乔治亚州盐沼中，其含量分别在1%和2%以上，特别是在52%和1]等通研崇明滩花米发现9量分别达(3648.0±331.0)和(3844.2±663.2)g·m2干质量，比同期玉米和向日葵的总生物量(分别为1935.1和3212.6g·m2干质量)都高[103]。在我国，互花米草的种群总面积达到了34178hm2，年产生物量达到了2.05为29306J·g-1）[12]。互花米草生物质的综合利用概况[105]用互花米草（大米草）作为原料进行了气、热、电三联产系统及工艺的研究获成，因互米含量，所气稳性，备腐严，没有得到推广应用。等0]以互花米草为原料生产沼气，发现互花米草单位原料干物质产气量可达0.200.22Lg-1，比猪(0.13Lg-1)、稻(.14Lg-)秸(0.18 Lg-1)的产气率都要大，接近牛粪(0.230.29g-1)和玉米秆(0.24Lg1)的产气率，表明互花米草是生产沼气的良好原料。等[107]用氢氧化钾活化互花米草活性炭其活性远高于城市与工厂水处理用活性炭一级标准并对胺有较大的吸附能力。刘晓辉等[108]对以互花米草为原料制作碎料板的生产工艺进行了有效的探索试验结果表明互花米草与在人造板工业得到实际应用的麦秆和稻秆原料相比，性能没有明显差别。集双等[109]利用互花米草秸秆纤维的理化特性经物理磋磨成浆将其与化学浆复配混合利用纸浆模塑工艺技术成功生产了纸浆模塑系列产品该技术体系开辟了秸秆生物质的处理高值化利用新途径对滩涂植物实现平衡控制使生物质资源变废为利实现了碳友好循环与利用。秸秆生物质及其综合利用现状秸秆生物质及其物质组成生物质（Biomass）EU（欧盟）附属的产业委员定义为“以可被微生的成分通过光合作用将能转化为化学能而产生的各种有机质[111]，主要指农林业生产过除粮食、果实以外的秸秆、树木等天然植物纤维、农产品加工业下脚料、农林废弃物及畜牧业生产过的禽畜粪便和废弃物等[112]纤维素分1-4Fig.1-4Structureofplant1-5Fig.1-5Schematicrepresentationofthelignifiedsecondaryplantcell1-2Table1-2Compositionandcorrespondingproportionsofcommonplant半纤维素纤维素木质素其他（灰分，杂质等1-4所示）[113]。植物细胞壁中的半纤维素和木质素通过共价键连接成网络结构1-5所示[114]OO上的葡萄糖残基，相对分子质量达200~2000kDa，如图1-6所示。纤维素分子的OO

O

1-6Fig.1-6StructuralformulaofcellulosepolymerO200OOOOOOOO

OOO1-7Fig.1-7Structuralformulaof木质素是由一系列的苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接的一种结构复杂无加固木化组织的细胞壁，并起着把相邻细胞粘结在一起的作用[18]。由于植物细胞19。秸秆生物质综合利用进展2004年荷兰乌德勒支大学EdwardSmeets等[120]20501172.822005年世界石油消费量（38.37亿吨）30.57倍。2005年能源部与农业部报告显示，本土具有13.7亿吨生物质原料的年产图1-82010年各种农作物秸秆在总资源量中的占Fig.1-8ProportionofvariousstrawcropsofthetotalresourcesofChinain图1-92010年我国秸秆综合利用率情Fig.1-9ComprehensiveutilizationratestatusofstrawcropsinChinain年的秸秆理论资源量为8.40亿吨，可收源量约为7.00亿吨。不同农作1-8，由图可以看出，玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆是我国秸秆资源的主要组成部分。2010年我国秸秆综合利用率达到70.60%，利用量约5亿吨，主要用来作为饲料、肥料和，少部分作为食用菌基料以及人造板和造纸的原料（1-9所示。虽然秸秆综合利用技术水秸秆生物质综合利用概况供物质保障；此外，秸秆还可以作为栽培食用菌的基料[125]。秸秆能源化利用。资源枯竭、环境污染日趋严重已经成为生有机质。秸秆生物质中硫的平均含量不到0.38%，而煤炭中硫的含量高达1%，是秸秆的3倍[127]，秸秆能源燃烧时，排放的SO2、NO2等环境污染气体很少。同时，秸秆燃烧生物质排放的CO2与其再生时吸收的CO2达到碳平衡，具有CO2零排放的作用，即从根本上解决了能源消耗带来的温室效应问题[128]。因此，物质，也是仅次于煤炭、石油和天然气的4大能源物质[129]。秸秆生物质可以通种生物质能产品[130]。和最主要的利用方式就是将秸秆生物质发酵生如的Lignol公司利用不列颠哥伦比亚省森林区生物质（软木）生品为主，生产乙醇或生物为辅，目前已研究成套中试设备体系，正在纤维生物质工业化利用进展中国造纸测算，2010年我国造纸原料结构分布见图1-10，其中木浆使用量比重占原料总量的23%，非木浆占15%，废纸浆占62%。在我国造纸工业图1-102010年我国造纸原料结构Fig.1-10RelativeproportionsofpapermakingrawmaterialsinChinain只适合低或中等比例取代硬木纸浆生产纸或[133]M.GonzálezAlriols等通蒸煮工艺和最佳制浆条件[135]。López对棕榈树的残余部分是否适宜乙烯-乙二醇有良好的制浆性能。Pahkala通过研究分析多种草本植物不同的化学组成和将会得到提高[139]近年来我国对纤维生物质资源应用于制浆造纸方面也有大量的研究。李松华对一枝黄花的化学成分和纤维形态进行了全面研究，发现其具有良化学药化学药原备装蒸煮（升温、放气、保温放黑原筛漂1-11Fig.1-11Processdiagramfortraditionalchemical低，如秸秆类原料制浆得率仅在30%左右。液是造纸过程污染的“罪魁祸首”，黑液回收，同时水的pH、COD、BOD及SS也大大，环境污染严重。因此，新型草料制浆技术的开发对于草类原料以特殊功能助剂，经塑料成型加工工艺在模具中制成的性能优良的复合材料[143-144]。随着人们环保意识的加强和国家对于循环经济、可持续发展的倡导，进和推动了对于木塑复合材料(WPC)的研究和开发工作[145]。该类复合材料具有替代木材制品和塑料制品，该类材料的应用范围主要有以下几个主要方面用品总量的75%，产品包括地板、护墙板、建筑模板、门窗型材、围栏和1907年，木塑复合材料问世，上世纪90年代在和兴起，同年速器的球形柄是该技术的第一个工业产品。1983年，Woodstock公司采用2002年国家科技部将木塑复合材料列入了生物质重点课题进行研究。同时研究生物降度低、长径比大和比表面积大等特点[154]，从而在很多情况下，植500100亿元以上。201112070035材料的需求也越来越大，传统的PE、PP、PVC基木塑复合材料已不能满足市现在的研究热点。AfrifahK.A.等[156]应用注塑成型技术了聚丁烯(PB)/木粉PE及PP的木塑复合材料的力学性能。BledzkiA.K.等[157]研究了素、黄麻纤维和麻焦纤维填充的PLA和3-羟基丁酸酯与3-羟基戊酸酯共聚物(PHBV)基复合材料，并以PP为基体的复合材料进行对比，SEM分析表明增强纤维与PLA及PHBV基体的结合情况与PP有很大不同。LeiY.等[158]将木粉加入HDPE/PET合金中了新型木塑复合材料，在复合体系中PET以微纤的形式存在，加入25wt%的PET可明显提高HDPE的在黄麻纤维的添加量为50wt%时，了PVC用量变化对复合材料的力学性能、吸水率和热稳定性的影响，发现随着PVC用量的增加，复合材料的力学性能和热稳定性明显提高，而吸水率下降。林业大学李大纲[160]分析木塑复合韩国、欧盟等国家和地区或限制使用EPS材料纸浆模塑率先推广起来的是在欧美等发达国家，我国电子工业部在“十一五”期间把推广纸浆模塑制品替代传统EPS包装材料作为包装领域的研究重点。区、京津地区得到了较为广泛的应用，众多国内著名家电、电子产品公司及中疏解，再经输浆泵将其输送到成型机。在成型过，纤维经过吸滤脱水达到图1- 常规纸浆模塑生产流程（团队制作Fig.1-12moldedpulpproduction纸浆模塑产品原料结构简单，生产工艺无重金属以及化合物的存在。纸本课题研究目的与意义样性等方面也产生了许多效应[13]，给我国沿海滩涂生态系统带来了严重破物种[20]其生态治理和有效利用成为当前我国沿海生态系统需要解决的重要土盐化重人赖生的壤源是益重环和[27]物科学领域迫切需要解决的重大课题。互花米草因长期适应沿海滩涂的高盐生及耐的子控理，望互花草生治提分基和依，为物盐种供传源可利工改济[-8。米草在我国的总面积已达到了近50000hm2，已成为我国沿海潮滩分布面积基于互花米草耐盐耐淹及其快速生物质合成能力以及生物质储量丰富等特点，结合当前我国经济社会发展的科学问题。本一方面以互花米草miR为研究对象，运用高通量、降解组和杂交等技术在转录组我海的花生性子理，找与互物质合成响应的关键靶，为互花米草的综合治理和有效利用提供科学依据，也为今后利用工程改良经济作物和能源作物提供相关的理论基础。第二章米草属种属鉴定与亲缘关系分析前米草属植物的ITS序列分析真核生物5.8S18S和28SrA串联在起形成一个转录本，彼此被间隔区分开，这种与rA转录本一起转录间隔序列称为内转录间隔区(ntrnlrnribdprTS)序列不21rA转录本的转录后加工成熟过，TS序列被剪切去除不参与成熟核糖体的组装和生物学因此，利用PR技术扩增植物rA转录本的TS，并对扩增的TS序列相似在176]。2-1内转录间隔区Fig.2-1Schematicof实验材料与方法2-1Table2-1Listofmain主要仪 公PCRPCR杭LCScienc