流式细胞术的基本原理

流式细胞术的基本原理

第1页，共17页。流式细胞术（flowcytometer，FCM）：利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。第2页，共17页。流式细胞仪：是集现代物理电子技术、激光技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体的先进科学技术设备第3页，共17页。第4页，共17页。流式细胞仪分为四部分：1）流动室与液流系统2）光源与光学系统3）信号收集、转换与分析系统4）细胞分选系统第5页，共17页。1）流动室与液流系统

第6页，共17页。2）光源与光学系统

激光（单色性、单向性）前向散射（FSC）侧向散射（SSC）第7页，共17页。激发波长

发射波长第8页，共17页。3）信号收集、转换与分析系统

激发波长经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT将光信号转换成电信号，电信号输入到放大器放大。第9页，共17页。放大器分两类：线性放大和对数放大。细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。细胞膜表面抗原等的检测，由于表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍，故取对数放大。第10页，共17页。光谱重叠与荧光补偿实际中激发波长是正态或偏态曲线，荧光素之间的波谱常有重叠，故流式细胞仪加入了电子补偿系统，去除因光谱重叠而进入其他荧光探测器的荧光信号，即荧光补偿。第11页，共17页。流式细胞术的对照设置阴性对照：调节荧光探测器合适的放大倍数，将仪器归零，确定样本的基础荧光域值阳性对照：检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性空白对照：不标记，自发荧光PS：补偿对照：多色分析样本时为荧光光谱重叠进行的的补偿调节第12页，共17页。4）细胞分选系统根据某参数决定细胞液滴是否被分选，然后由充电电路对其充电，带电液滴通过静电场发生偏转而分离488

nm

laser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector第13页，共17页。流式细胞术流程第14页，共17页。应用细胞膜：流动性、膜电位、膜通透性细胞内离子浓度：H+、Na+、K+和Ca2+细胞周期：全周期分析、S期分析、M期分析细胞表面蛋白质分析：免疫细胞分型、其他表面蛋白分析细胞功能：如凋亡、抗药性基因表达：内源及外源基因表达细胞分选细胞克隆第15页，共17页。Thankyou！第16页，共17页。内容梗概流式细胞术的基本原理。利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。流式细胞仪：是集现代物理电子技术、激光技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体的先进科学技术设备。激发波长

发射波长。激发波长经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT将光信号转换成电信号，电信号输入到放大器放大。放大器分两类：线性放大和对数放大。细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。细胞膜表面抗原等的检测，由于表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍，故取对数放大。实际中激发波长是正态或偏态曲线，荧光素之间的波谱常有重叠，故流式细胞仪加入了电子补偿系统，去除因光谱重叠而进入其他荧光探测器的荧光信号，即荧光补偿。阴性对照：调节荧光探测器合适的放大倍数，将仪器归零，确定样本的基础荧光域值。根据某参数决定细胞液滴是否被分