基因表达调控与重组DNA技术课件

第十三---十五章基因表达调控及重组DNA技术第十三---十五章主要内容

基因及基因表达调控相关概念原核基因表达调控基本原理真核基因表达调控基本原理重组DNA技术相关概念重组DNA技术基本原理2主要内容基因及基因表达调控相关概念2

负载特定遗传信息的DNA片段，包括：DNA编码序列、非编码调节序列和内含子序列。

基因（Gene）负载特定遗传信息的DNA片段，包括：DNA编码序列、基因组（Genome）

来自一个遗传体系的一整套遗传信息原核：单个环状染色体所含的全部基因真核：一个生物体的染色体所包含的全部

DNA，又称染色体基因组线粒体基因组叶绿体基因组基因组（Genome）来自一个遗传体系的一整套遗传信息原核HumanGenomeHumanGenome人类基因组计划（HumanGenomeProject,HGP）1985年美国提出计划投入30亿美元，15年完成

1990年正式启动英、法、德、日、中国等先后加入中国的任务：人类3号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序，该区域约占人类整个基因组的1％。

人类基因组计划1985年美国提出中国的任务：年10月启动2000年6月完成草图2001年2月《nature》公布草图

Nature,409(6822):860-921,2001

2004年10月《nature》公布精度>99%的测序图人类基因数：2-2.5万

Nature,431(7011):931-945,2004HGP的进展Thepost-genomeeraiscoming年10月启动HGP的进展Thepost-ge谱主为生物学大师耗资200万完成盼未来降价普及助提早预防疾病“生命天书”——首份个人基因图公布

(2007.5.30)JamesWaston谱主为生物学大师“生命天书”——首份个人基因图公布Ja

基因表达调控是指细胞生物接受环境信号刺激或适应环境营养供给状况的变化，在基因表达水平上作出应答反应的分子机制。重组DNA技术本质上是一项生物技术，目的在于通过人工重组DNA的方法，获得某一目的基因的无性繁殖系—DNA克隆，或使目的基因在一定的表达体系表达有特殊意义的蛋白质。主要研究内容：基因表达方式、规律、调节机理基因表达调控是指细胞生物接受环境信号刺激或适应环境营养供给第一节基因表达调控10第一节基因表达调控10一、基因表达的概念*

在各种调节机制控制下，从基因激活开始，经历转录、翻译等过程产生具有生物学功能的蛋白质分子，从而赋予细胞一定的功能或表型，或使生物体获得一定的遗传性状。11一、基因表达的概念*在各种调节机制控制下，从基因激活

DNARNA蛋白质转录翻译逆转录简单定义：转录＋翻译广义：包括rRNA、tRNA的表达DNARNA蛋白质转录翻译逆转录简单定义：转录＋翻译广二、基因表达调控的意义

生物体基因数量很多，但在某一特定时期只有一小部分基因处于活化状态，能进行转录（例如，真核细胞约2～5％基因具转录活性）。因此，机体内存在着复杂的调节机制，调节基因的表达。通过调控基因的表达，使生物体适应环境、调节代谢、维持其生长与繁殖。基因表达调控的意义：13二、基因表达调控的意义生物体基因数量很多，但在某一特定三、基因表达的规律*

阶段特异性（时间特异性）

组织特异性（空间特异性）14三、基因表达的规律*阶段特异性（时间特异性）组织特

阶段特异性（时间特异性）甲胎蛋白

某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发生，称时间特异性*

多细胞生物的不同基因在不同发育阶段按特定时间顺序开启和关闭，称阶段特异性*哺乳类nAChR：胚胎型α2βγδ(烟碱型乙酰胆碱受体)

成年型α2βεδ15阶段特异性（时间特异性）甲胎蛋白某一特定基因的

组织特异性（空间特异性）在个体生长的某一阶段，不同细胞有不同基因表达胰岛素：胰岛细胞血红蛋白：红细胞鸟氨酸循环酶类：肝细胞X

YXY

AB16组织特异性（空间特异性）在个体生长的某一阶段，不同细胞四、基因表达的方式

有些基因的产物对于生物体的整个生命过程都是必不可少的，这类基因在生物体的几乎所有细胞中持续表达，这类基因被称为管家基因。这类基因的表达称为基本的基因表达*

。例如：葡萄糖酵解途径中各种酶的编码基因基本的基因表达也是在一定机制控制下进行（一）基本的基因表达17四、基因表达的方式有些基因的产物对于生物体的整个生命过（二）可调节的基因表达

与管家基因不同，另一些基因表达状况极易受外环境变化的影响，随外环境变化，这类基因表达水平可升高或降低,又称适应性表达；又称奢侈基因。

特点：不是细胞生命必不可少的表达受外环境的影响较大，不恒定表达有间断性和空间特异性18（二）可调节的基因表达与管家基因不同，另一些基因

诱导基因表达水平在特定环境中增高的现象这类基因叫可诱导基因阻遏基因对环境信号应答表现为表达水平降低这类基因叫可阻遏基因DNA损伤：DNA损伤修复酶被诱导色氨酸供应充足：参与合成色氨酸的酶被阻遏诱导阻遏DNA损伤：DNA损伤修复酶被诱导五.基因表达的多级调控基因表达调控在多级水平上进行基因激活

转录起始*

转录后加工及转运mRNA降解

翻译及翻译后加工

蛋白质降解20五.基因表达的多级调控基因表达调控在多级水平上进行基因激活六、基因表达调控原理以mRNA转录为例DNA元件调节蛋白RNA聚合酶活性*调控要素（一）转录起始调节基因表达21六、基因表达调控原理以mRNA转录为例DNA元件*调控

（1）DNA元件：具有调节功能的特异DNA序列操纵子：由功能上相关的一组酶或蛋白质基因在染色体上串联一起并共同享用同一表达调控的DNA组件所构成的一个转录单位。操纵子调节序列编码序列：编码蛋白质启动序列：结合RNA聚合酶操纵序列：结合阻遏蛋白*1、原核生物（1）DNA元件：具有调节功能的特异DNA序列操纵子：由

操纵子结构编码序列

启动序列

操纵序列其他调节序列(promoter)(operator)PO(codingsequence)操纵子结构编码序列启动序列操纵序列其他调节序列(p

原核生物启动序列（启动子）RNA转录起始-35区-10区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrptRNATyrlacrecAAraBADTTGACA

TATAAT一致序列原核生物启动序列（启动子）RNA转录起始-35区-10区T

（2）调节蛋白特异因子

决定RNA聚合酶特异识别并结合启动序列的能力（σ因子）阻遏蛋白

与操纵序列结合，抑制RNA聚合酶活性

（负性调节）激活蛋白

促进RNA聚合酶活性（正性调节）（2）调节蛋白特异因子决定RNA聚合酶特异识别并结合

（3）

RNA聚合酶活性

DNA元件与调节蛋白对转录激活的调节作用最终由RNA聚合酶活性体现。启动序列或启动子的结构、调节蛋白的性质对RNA聚合酶活性影响最大。（3）RNA聚合酶活性DNA元件与调节蛋白2.真核生物（1）顺式作用元件：（2）反式作用因子：

（3）mRNA转录激活及其调节2.真核生物（1）顺式作用元件：第二节原核基因表达调控与真核基因表达调控的基本原理28第二节原核基因表达调控与真核基因表达调控的基本原理28一、原核基因表达及其调控的特点1、转录与翻译两过程紧密偶联3、操纵子调节机制中普遍存在阻遏蛋白介导的负性调节*2、普遍存在操纵子调节机制阻遏蛋白操纵序列结合阻遏解聚结合去阻遏阻碍29一、原核基因表达及其调控的特点1、转录与翻译两过程紧密偶联

4、转录产物为多顺反子mRNA5、转录起始是基因表达调控的最关键环节*多顺反子mRNA：多个功能相关的基因串联，转录产物在一条mRNA上，翻译产物为多个多肽链4、转录产物为多顺反子mRNA5、转录起始是基二、操纵子理论通常一个操纵子含有一个启动序列及数个编码基因（2～6个，甚至更多），还有其它调节序列。编码序列

启动序列

操纵序列其他调节序列(promoter)(operator)PO(codingsequence)操纵子结构31二、操纵子理论编码序列启动序列操纵序列其他调节序列(乳糖操纵子调节机制

阻遏蛋白的负性调节

CAP的正性调节协调调节32乳糖操纵子调节机制32

乳糖操纵子结构CAP结合位点PIIPOZYA调控区结构基因I:阻遏蛋白编码基因

PI:阻遏蛋白基因启动序列

Z:β-半乳糖苷酶Y:透酶

A:乙酰基转移酶结构基因O:操纵序列（阻遏蛋白结合部位）P:启动序列CAP结合位点调控区乳糖操纵子结构CAP结合位点PIIPOZYA调控区结

1.阻遏蛋白的负性调节（无乳糖）*阻遏蛋白与O序列结合,抑制转录,lac操纵子关闭阻遏蛋白mRNACAP结合位点PIIPOZYARNA聚合酶

1.阻遏蛋白的负性调节（无乳糖）*阻遏蛋白与O序列结合

诱导剂结合于阻遏蛋白，阻遏蛋白与O序列解离，转录抑制解除，lac操纵子开启乳糖别乳糖CAP结合位点PIIPOZYAmRNA

阻遏蛋白的负性调节（有乳糖）*

诱导剂结合于阻遏蛋白，阻遏蛋白与O序列解离，转录抑制解除，

CAP:分解代谢基因激活蛋白

catabolitegeneactivatorprotein同二聚体cAMP

结合区

DNA

结合区CAP:分解代谢基因激活蛋白同二聚体cAMP结合区

2.CAP的正性调节（无葡萄糖）*cAMPCAP蛋白PIIPOZYACAP结合位点mRNA无葡萄糖，cAMP浓度高cAMP与CAP结合

与CAP结合位点结合转录活性提高约50倍

2.CAP的正性调节（无葡萄糖）*cAMPCAP蛋白P

CAP的正性调节（有葡萄糖）*cAMPCAP蛋白PIIPOZYACAP结合位点mRNA有葡萄糖，cAMP浓度低cAMP与CAP结合受阻转录活性下降

CAP的正性调节（有葡萄糖）*cAMPCAP蛋白PI

阻遏蛋白mRNACAP结合位点PIIPOZYARNA聚合酶

3.阻遏蛋白与CAP的协调调节*（1）无乳糖时,阻遏蛋白封闭转录，CAP无作用阻遏蛋白mRNACAP结合位点PIIPOZYARNA聚合

（2）有乳糖时,乳糖操纵子去阻遏,虽可转录,

但活性很低,必须由CAP的正性调节来加强PIIPOZYACAP结合位点mRNA

（2）有乳糖时,乳糖操纵子去阻遏,虽可转录,P

乳糖操纵子强的转录活性既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖乳糖操纵子强的转录活性（一）真核基因结构特点1.转录产物为单顺反子

一个基因——

一条mRNA——

一条多肽链2.重复序列

高度重复序列、中度重复序列、单拷贝序列3.基因不连续性

非编码序列内含子1235’3’三、真核基因表达调控42（一）真核基因结构特点1.转录产物为

（二）真核基因转录特点活性染色体结构变化

对核酸酶敏感、甲基化程度降低、组蛋白乙酰化修饰2.正性调节占主导

真核RNA聚合酶对启动子的亲和力极小或根本没有实质的亲和力，转录起始需依赖多种激活蛋白的作用3．转录与翻译分隔进行

转录在核内进行，翻译在胞浆进行（二）真核基因转录特点活性染色体结构变化2.正性调节

转录（起始）调节实质上是调节蛋白与DNA的相互作用

1、顺式作用元件：2、反式作用因子：

3、mRNA转录激活及其调节（三）真核基因转录激活调节44转录（起始）调节实质上是调节蛋白与DNA的相互作用1

1.顺式作用元件*

指结构基因两侧或内部具有调节功能的DNA序列，因其作用于自身分子并发挥作用，所以称顺式作用元件。

根据位置、性质及作用方式的不同分为启动子、增强子和抑制子。1.顺式作用元件*指结构基因两侧或内部具有

真核生物——顺式作用元件结构基因序列

启动子(promoter)P

抑制子(silencer)

增强子(enhancer)

增强子(enhancer)46真核生物——顺式作用元件结构基因序列启动子(promRNA聚合酶II启动位点周围一组转录控制组件常见组件：

TATA盒（TATAAA）-25bp~-30bp

GC盒（GGGCGG）

CAAT盒（CCAATC）CAAT盒GC盒TATA盒转录起始点-30bp~-110bp启动子promoter47RNA聚合酶II启动位点周围一组转录控制组件常见组件：CA

增强子*

：

远离转录起始点、决定组织特异性表达、增强启动子转录活性的特异DNA序列，其发挥作用的方式与方向、距离无关。

抑制子*

：

对启动子转录活性起抑制作用的DNA序列负性调节元件增强子*：抑制子*：

2、反式作用因子（转录因子）转录因子、转录调节因子、转录调节蛋白

基本转录因子转录激活因子转录抑制因子2、反式作用因子（转录因子）

绝大多数转录因子属于反式作用因子*真核生物：由某一基因表达后，通过DNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用控制另一基因的转录。绝大多数转录因子属于反式作用因子*真核生物：由某一基因表达

ABAB

RNA聚合酶结合启动子所必须的一组转录因子

基本转录因子FEBDARNA

polⅡTATADNATATATFⅡD

TFⅡA

TFⅡB

TFⅡF

TFⅡERNApolⅡRNA聚合酶结合启动子所必须的一组转录因子基本转录因子

转录激活因子（正性调节因子）

通过DNA－蛋白质、蛋白质－蛋白质相互作用起正性调节作用的转录因子。

转录抑制因子（负性调节因子）

通过DNA－蛋白质、蛋白质－蛋白质相互作用起负性调节作用的转录因子。与增强子结合的转录因子与抑制子结合的转录因子转录激活因子（正性调节因子）转录抑制因子（真核RNA聚合酶II不能单独识别启动子，而是由基本转录因子TFIID识别并结合启动子，形成TFIID－启动子复合物，然后有一系列的转录因子（如TFIIA、TFIIB、TFIIE、TFIIF等）加入形成前起始复合物，调节转录的起始。3．mRNA转录激活及其调节54真核RNA聚合酶II不能单独识别启动子，而是由基本转录因子T第三节重组DNA技术55第三节重组DNA技术55基因重组（geneticrecombination）

自然发生的基因重排真核、原核均会发生基因变异、物种演变、生物进化的基础基因工程（geneticengineering）重组DNA技术人工进行基因重组基因重组（geneticrecombination）自

克隆*(名词)：就是指来自同一母本的所有副本或拷贝的集合。克隆化（动词）：获取同一拷贝的过程。二、重组DNA技术相关概念母本克隆clonecloning（一）克隆与克隆化57克隆*(名词)：就是指来自同一母本

细胞克隆：从大量群体细胞中分离出某一种类型细胞，经扩增获得这样一类相同的细胞。在分子生物学领域所说的分子克隆专指

DNA克隆(DNAcloning)。

分子克隆：从众多不同的分子群体中分离到的很多相同分子的集合。细胞克隆：在分子生物学领域所说的分子克隆专指分子克隆：（二）重组DNA技术*

应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（目的基因或目的DNA）与载体DNA连接成复制子，然后通过转化或转染等方法导入宿主细胞，生长、筛选出含有目的基因的转化子细胞。转化子细胞经扩增、提取，获得大量目的DNA的无性繁殖系，即DNA克隆，基因工程。59（二）重组DNA技术*应用酶学的方法，在体外将各

目的DNA载体DNA连接复制子（重组DNA）导入宿主细胞（转化或转染）转化子细胞转化子细胞扩增，可获得大量重组DNA目的DNA载体DNA连接复制子（重组DNA）导入宿主细

基因克隆DNA克隆重组DNA同一概念生物技术工程基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程

获得DNA的无性繁殖系获得目的基因的表达产物重组DNA的目的

基因克隆同一概念生物技术工程基因工程、细胞工程、酶工程、蛋（三）工具酶限制性核酸内切酶连接酶DNA聚合酶反转录酶多聚核苷酸激酶62（三）工具酶限制性核酸内切酶62

限制性核酸内切酶*识别和切割双链DNA分子内部特异核苷酸序列的一类核酸酶。限制性核酸内切酶共分三类，基因工程常用II类酶，这类酶常识别DNA的回文序列

*

。限制性核酸内切酶*识别和切割双链DNA分子内部特异核苷酸序

HpaI：5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’平端PstI：5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’突出粘性末端EcoRI：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’突出粘性末端HpaI：5’-GTTAAC-3’平端Pst

（四）目的基因targetgenecDNA(complementaryDNA)

在体外以RNA（通常为mRNA）为模板，经反转录合成的单链DNA。基因组DNA(genomicDNA)

代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。目的基因又称外源DNA（四）目的基因targetgenecDNA(c

携带外源DNA，实现外源DNA无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体：质粒噬菌体DNA病毒DNA质粒（1）双链环状DNA，细菌染色体外（2）2-3kb或数百kb

（3）独立自主复制，稳定遗传（4）遗传标志(五)基因载体（克隆载体）66质粒（1）双链环状DNA，细菌染色体外(五)基因载三、重组DNA技术的原理与基本过程*1.获取目的基因2.选择、构建基因载体3.目的基因与载体连接，形成重组分子4.重组分子导入受体细胞5.筛选、扩增6.表达目的基因67三、重组DNA技术的原理1.获取目的基因67

+载体目的基因重组DNA分子细菌转化或转染扩增筛选+载体目的基因重组DNA分子细菌转化或转染扩增筛选（1）化学合成（4）PCR（2）基因组DNA文库

（3）cDNA文库1.获取目的基因69（1）化学合成（4）PCR（2）基因组DNA文库

组织或细胞染色体

限制性内切酶多个DNA片段载体多种转化子

（基因文库）重组DNA导入宿主细胞mRNA逆转录cDNAcDNA文库组织或细胞染色体限制性内切酶多个DNA片段载体多种转化子聚合酶链式反应（PCR）

在有特定模板、特异DNA引物及合成DNA所需要的dNTP存在时，向DNA合成体系内加入耐热的DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶*

），经反复变性、退火及延伸的多个循环反应，生成特异DNA产物的过程。71聚合酶链式反应（PCR）在有特定模板、特异DNA

变性：解开模板双链DNA95℃退火：使引物与单链模板DNA结合

55℃延伸：DNA链的合成

72℃变性：解开模板双链DNA退火：使引物与单链模板DNA结合延

2.克隆载体的选择与构建目的基因不能自我复制3.目的基因与载体连接（DNA连接酶*

）重组DNA4.重组DNA导入受体菌安全菌感受态导入方式：转化转染感染2.克隆载体的选择与构建3.目的基因与载体连接（DN

5.重组体的筛选（1）直接选择法

抗药性标志选择amprtetrkanr

标志补救α互补分子杂交（2）非直接选择法

常用免疫学方法特异性强、灵敏度高5.重组体的筛选（1）直接选择法（2）非直接选择法

6.克隆基因的表达

常见表达体系：（1）原核——大肠杆菌（简单、迅速、经济）缺点：无转录后加工——适于表达cDNA

无翻译后加工——无糖基化修饰包涵体

（2）真核——酵母、昆虫细胞、哺乳类动物细胞表达有生物活性的蛋白质6.克隆基因的表达常见表达体系：（2）真核——酵母、四、重组DNA技术的应用1.疾病基因的发现镰刀形红细胞贫血脆性X综合征(FMRI基因沉默)2.生物制药

利用基因工程技术生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界上的一项重大产业。如生产干扰素、胰岛素、细胞因子等。76四、重组DNA技术的应用1.疾病基因的发现镰刀形红细胞贫3.DNA诊断

DNA诊断又称基因诊断，是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平上分析、鉴定遗传性疾病所涉及的基因置换、缺失或插入等突变。4.基因治疗

所谓基因治疗就是向功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。对于基因治疗，人们担心的潜在危险之一是可能会引起未知的遗传效应，如肿瘤等，此外还涉及社会伦理方面的争论。5.遗传病的预防3.DNA诊断DNA诊断又称基因诊断，是利

本章重点

基本概念

基因表达、操纵子、DNA元件、顺式作用元件、反式作用因子（转录因子）、启动子、增强子、基因工程、限制性核酸内切酶、管家基因

原核基因表达调控特点

乳糖操纵子结构及作用机制

基因表达调控的规律、方式、要素本章重点基本概念原核基因表达调控特点乳糖操纵

PCR原理及基本过程

重组DNA技术基本原理

真核基因转录特点

真核基因转录激活调节

真核基因结构特点PCR原理及基本过程重组DNA技术基本原理1、Geniusonlymeanshard-workingallone'slife.(Mendeleyer,RussianChemist)

天才只意味着终身不懈的努力。20.8.58.5.202011:0311:03:10Aug-2011:032、Ourdestinyoffersnotonlythecupofdespair,butthechaliceofopportunity.(RichardNixon,AmericanPresident)命运给予我们的不是失望之酒，而是机会之杯。二〇二〇年八月五日2020年8月5日星期三3、Patienceisbitter,butitsfruitissweet.(JeanJacquesRousseau,Frenchthinker)忍耐是痛苦的，但它的果实是甜蜜的。11:038.5.202011:038.5.202011:0311:03:108.5.202011:038.5.20204、Allthatyoudo,dowithyourmight;thingsdonebyhalvesareneverdoneright.----R.H.Stoddard,Americanpoet做一切事都应尽力而为，半途而废永远不行8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:105、Youhavetobelieveinyourself.That'sthesecretofsuccess.----CharlesChaplin人必须相信自己，这是成功的秘诀。-Wednesday,August5,2020August20Wednesday,August5,20208/5/20206、Almostanysituation---goodorbad---isaffectedbytheattitudewebringto.----LuciusAnnausSeneca差不多任何一种处境---无论是好是坏---都受到我们对待处境态度的影响。11时3分11时3分5-Aug-208.5.20207、Althoughtheworldisfullofsuffering,itisfullalsooftheovercomingofit.----HellenKeller,Americanwriter虽然世界多苦难，但是苦难总是能战胜的。20.8.520.8.520.8.5。2020年8月5日星期三二〇二〇年八月五日8、Formanismanandmasterofhisfate.----Tennyson人就是人，是自己命运的主人11:0311:03:108.5.2020Wednesday,August5,20209、Whensuccesscomesinthedoor,itseems,loveoftengoesoutthewindow.-----JoyceBrothers成功来到门前时，爱情往往就走出了窗外。11:038.5.202011:038.5.202011:0311:03:108.5.202011:038.5.202010、Lifeismeasuredbythoughtandaction,notbytime.——Lubbock衡量生命的尺度是思想和行为，而不是时间。8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:1011、Tomakealastingmarriagewehavetoovercomeself-centeredness.要使婚姻长久，就需克服自我中心意识。Wednesday,August5,2020August20Wednesday,August5,20208/5/202012、Treatotherpeopleasyouhopetheywilltreatyou.你希望别人如何对待你，你就如何对待别人。11时3分11时3分5-Aug-208.5.202013、Todowhateverneedstobedoneto

preservethislastandgreatestbastionof

freedom.(RonaldReagan,AmericanPresident)为了保住这最后的、最伟大的自由堡垒，我们必须尽我们所能。20.8.520.8.5Wednesday,August5,202014、Wherethereisawill,thereisaway.(ThomasEdison,Americaninventor)有志者，事竟成。11:01:1911:01:1911:018/5/202011:01:19AM15、

Everymanisthemasterofhisownfortune.----RichardSteele每个人都主宰自己的命运。20.8.511:01:1911:01Aug-205-Aug-2016、Asselfishnessandcomplaintcloudthemind,solovewithitsjoyclearsandsharpensthevision.----HelenKeller自私和抱怨是心灵的阴暗，愉快的爱则使视野明朗开阔。11:01:1911:01:1911:01Wednesday,August5,202017、Donot,foronerepulse,giveupthepurposethatyouresolvedtoeffect.----WillianShakespeare,Britishdramatist不要只因一次失败，就放弃你原来决心想达到的目的。20.8.520.8.511:01:1911:01:19August5,202018、Thereisnoabsolutesuccessintheworld,onlyconstantprogress.世界上的事没有绝对成功，只有不断的进步。2020年8月5日星期三上午11时1分19秒11:01:1920.8.519、Nothingismorefataltohappinessthantheremembranceofhappiness.

没有什么比回忆幸福更令人痛苦的了。2020年8月上午11时1分20.8.511:01August5,202020、Nomanishappywhodoesnotthinkhimselfso.——PubliliusSyrus认为自己不幸福的人就不会幸福。2020年8月5日星期三11时1分19秒11:01:195August202021、Theemperortreatstalentastools,usingtheirstrongpointtohisadvantage.

君子用人如器，各取所长。上午11时1分19秒上午11时1分11:01:1920.8.5谢谢观看THEEND1、Geniusonlymeanshard-worki

第十三---十五章基因表达调控及重组DNA技术第十三---十五章主要内容

基因及基因表达调控相关概念原核基因表达调控基本原理真核基因表达调控基本原理重组DNA技术相关概念重组DNA技术基本原理82主要内容基因及基因表达调控相关概念2

负载特定遗传信息的DNA片段，包括：DNA编码序列、非编码调节序列和内含子序列。

基因（Gene）负载特定遗传信息的DNA片段，包括：DNA编码序列、基因组（Genome）

来自一个遗传体系的一整套遗传信息原核：单个环状染色体所含的全部基因真核：一个生物体的染色体所包含的全部

DNA，又称染色体基因组线粒体基因组叶绿体基因组基因组（Genome）来自一个遗传体系的一整套遗传信息原核HumanGenomeHumanGenome人类基因组计划（HumanGenomeProject,HGP）1985年美国提出计划投入30亿美元，15年完成

1990年正式启动英、法、德、日、中国等先后加入中国的任务：人类3号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序，该区域约占人类整个基因组的1％。

人类基因组计划1985年美国提出中国的任务：年10月启动2000年6月完成草图2001年2月《nature》公布草图

Nature,409(6822):860-921,2001

2004年10月《nature》公布精度>99%的测序图人类基因数：2-2.5万

Nature,431(7011):931-945,2004HGP的进展Thepost-genomeeraiscoming年10月启动HGP的进展Thepost-ge谱主为生物学大师耗资200万完成盼未来降价普及助提早预防疾病“生命天书”——首份个人基因图公布

(2007.5.30)JamesWaston谱主为生物学大师“生命天书”——首份个人基因图公布Ja

基因表达调控是指细胞生物接受环境信号刺激或适应环境营养供给状况的变化，在基因表达水平上作出应答反应的分子机制。重组DNA技术本质上是一项生物技术，目的在于通过人工重组DNA的方法，获得某一目的基因的无性繁殖系—DNA克隆，或使目的基因在一定的表达体系表达有特殊意义的蛋白质。主要研究内容：基因表达方式、规律、调节机理基因表达调控是指细胞生物接受环境信号刺激或适应环境营养供给第一节基因表达调控90第一节基因表达调控10一、基因表达的概念*

在各种调节机制控制下，从基因激活开始，经历转录、翻译等过程产生具有生物学功能的蛋白质分子，从而赋予细胞一定的功能或表型，或使生物体获得一定的遗传性状。91一、基因表达的概念*在各种调节机制控制下，从基因激活

DNARNA蛋白质转录翻译逆转录简单定义：转录＋翻译广义：包括rRNA、tRNA的表达DNARNA蛋白质转录翻译逆转录简单定义：转录＋翻译广二、基因表达调控的意义

生物体基因数量很多，但在某一特定时期只有一小部分基因处于活化状态，能进行转录（例如，真核细胞约2～5％基因具转录活性）。因此，机体内存在着复杂的调节机制，调节基因的表达。通过调控基因的表达，使生物体适应环境、调节代谢、维持其生长与繁殖。基因表达调控的意义：93二、基因表达调控的意义生物体基因数量很多，但在某一特定三、基因表达的规律*

阶段特异性（时间特异性）

组织特异性（空间特异性）94三、基因表达的规律*阶段特异性（时间特异性）组织特

阶段特异性（时间特异性）甲胎蛋白

某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发生，称时间特异性*

多细胞生物的不同基因在不同发育阶段按特定时间顺序开启和关闭，称阶段特异性*哺乳类nAChR：胚胎型α2βγδ(烟碱型乙酰胆碱受体)

成年型α2βεδ95阶段特异性（时间特异性）甲胎蛋白某一特定基因的

组织特异性（空间特异性）在个体生长的某一阶段，不同细胞有不同基因表达胰岛素：胰岛细胞血红蛋白：红细胞鸟氨酸循环酶类：肝细胞X

YXY

AB96组织特异性（空间特异性）在个体生长的某一阶段，不同细胞四、基因表达的方式

有些基因的产物对于生物体的整个生命过程都是必不可少的，这类基因在生物体的几乎所有细胞中持续表达，这类基因被称为管家基因。这类基因的表达称为基本的基因表达*

。例如：葡萄糖酵解途径中各种酶的编码基因基本的基因表达也是在一定机制控制下进行（一）基本的基因表达97四、基因表达的方式有些基因的产物对于生物体的整个生命过（二）可调节的基因表达

与管家基因不同，另一些基因表达状况极易受外环境变化的影响，随外环境变化，这类基因表达水平可升高或降低,又称适应性表达；又称奢侈基因。

特点：不是细胞生命必不可少的表达受外环境的影响较大，不恒定表达有间断性和空间特异性98（二）可调节的基因表达与管家基因不同，另一些基因

诱导基因表达水平在特定环境中增高的现象这类基因叫可诱导基因阻遏基因对环境信号应答表现为表达水平降低这类基因叫可阻遏基因DNA损伤：DNA损伤修复酶被诱导色氨酸供应充足：参与合成色氨酸的酶被阻遏诱导阻遏DNA损伤：DNA损伤修复酶被诱导五.基因表达的多级调控基因表达调控在多级水平上进行基因激活

转录起始*

转录后加工及转运mRNA降解

翻译及翻译后加工

蛋白质降解100五.基因表达的多级调控基因表达调控在多级水平上进行基因激活六、基因表达调控原理以mRNA转录为例DNA元件调节蛋白RNA聚合酶活性*调控要素（一）转录起始调节基因表达101六、基因表达调控原理以mRNA转录为例DNA元件*调控

（1）DNA元件：具有调节功能的特异DNA序列操纵子：由功能上相关的一组酶或蛋白质基因在染色体上串联一起并共同享用同一表达调控的DNA组件所构成的一个转录单位。操纵子调节序列编码序列：编码蛋白质启动序列：结合RNA聚合酶操纵序列：结合阻遏蛋白*1、原核生物（1）DNA元件：具有调节功能的特异DNA序列操纵子：由

操纵子结构编码序列

启动序列

操纵序列其他调节序列(promoter)(operator)PO(codingsequence)操纵子结构编码序列启动序列操纵序列其他调节序列(p

原核生物启动序列（启动子）RNA转录起始-35区-10区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrptRNATyrlacrecAAraBADTTGACA

TATAAT一致序列原核生物启动序列（启动子）RNA转录起始-35区-10区T

（2）调节蛋白特异因子

决定RNA聚合酶特异识别并结合启动序列的能力（σ因子）阻遏蛋白

与操纵序列结合，抑制RNA聚合酶活性

（负性调节）激活蛋白

促进RNA聚合酶活性（正性调节）（2）调节蛋白特异因子决定RNA聚合酶特异识别并结合

（3）

RNA聚合酶活性

DNA元件与调节蛋白对转录激活的调节作用最终由RNA聚合酶活性体现。启动序列或启动子的结构、调节蛋白的性质对RNA聚合酶活性影响最大。（3）RNA聚合酶活性DNA元件与调节蛋白2.真核生物（1）顺式作用元件：（2）反式作用因子：

（3）mRNA转录激活及其调节2.真核生物（1）顺式作用元件：第二节原核基因表达调控与真核基因表达调控的基本原理108第二节原核基因表达调控与真核基因表达调控的基本原理28一、原核基因表达及其调控的特点1、转录与翻译两过程紧密偶联3、操纵子调节机制中普遍存在阻遏蛋白介导的负性调节*2、普遍存在操纵子调节机制阻遏蛋白操纵序列结合阻遏解聚结合去阻遏阻碍109一、原核基因表达及其调控的特点1、转录与翻译两过程紧密偶联

4、转录产物为多顺反子mRNA5、转录起始是基因表达调控的最关键环节*多顺反子mRNA：多个功能相关的基因串联，转录产物在一条mRNA上，翻译产物为多个多肽链4、转录产物为多顺反子mRNA5、转录起始是基二、操纵子理论通常一个操纵子含有一个启动序列及数个编码基因（2～6个，甚至更多），还有其它调节序列。编码序列

启动序列

操纵序列其他调节序列(promoter)(operator)PO(codingsequence)操纵子结构111二、操纵子理论编码序列启动序列操纵序列其他调节序列(乳糖操纵子调节机制

阻遏蛋白的负性调节

CAP的正性调节协调调节112乳糖操纵子调节机制32

乳糖操纵子结构CAP结合位点PIIPOZYA调控区结构基因I:阻遏蛋白编码基因

PI:阻遏蛋白基因启动序列

Z:β-半乳糖苷酶Y:透酶

A:乙酰基转移酶结构基因O:操纵序列（阻遏蛋白结合部位）P:启动序列CAP结合位点调控区乳糖操纵子结构CAP结合位点PIIPOZYA调控区结

1.阻遏蛋白的负性调节（无乳糖）*阻遏蛋白与O序列结合,抑制转录,lac操纵子关闭阻遏蛋白mRNACAP结合位点PIIPOZYARNA聚合酶

1.阻遏蛋白的负性调节（无乳糖）*阻遏蛋白与O序列结合

诱导剂结合于阻遏蛋白，阻遏蛋白与O序列解离，转录抑制解除，lac操纵子开启乳糖别乳糖CAP结合位点PIIPOZYAmRNA

阻遏蛋白的负性调节（有乳糖）*

诱导剂结合于阻遏蛋白，阻遏蛋白与O序列解离，转录抑制解除，

CAP:分解代谢基因激活蛋白

catabolitegeneactivatorprotein同二聚体cAMP

结合区

DNA

结合区CAP:分解代谢基因激活蛋白同二聚体cAMP结合区

2.CAP的正性调节（无葡萄糖）*cAMPCAP蛋白PIIPOZYACAP结合位点mRNA无葡萄糖，cAMP浓度高cAMP与CAP结合

与CAP结合位点结合转录活性提高约50倍

2.CAP的正性调节（无葡萄糖）*cAMPCAP蛋白P

CAP的正性调节（有葡萄糖）*cAMPCAP蛋白PIIPOZYACAP结合位点mRNA有葡萄糖，cAMP浓度低cAMP与CAP结合受阻转录活性下降

CAP的正性调节（有葡萄糖）*cAMPCAP蛋白PI

阻遏蛋白mRNACAP结合位点PIIPOZYARNA聚合酶

3.阻遏蛋白与CAP的协调调节*（1）无乳糖时,阻遏蛋白封闭转录，CAP无作用阻遏蛋白mRNACAP结合位点PIIPOZYARNA聚合

（2）有乳糖时,乳糖操纵子去阻遏,虽可转录,

但活性很低,必须由CAP的正性调节来加强PIIPOZYACAP结合位点mRNA

（2）有乳糖时,乳糖操纵子去阻遏,虽可转录,P

乳糖操纵子强的转录活性既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖乳糖操纵子强的转录活性（一）真核基因结构特点1.转录产物为单顺反子

一个基因——

一条mRNA——

一条多肽链2.重复序列

高度重复序列、中度重复序列、单拷贝序列3.基因不连续性

非编码序列内含子1235’3’三、真核基因表达调控122（一）真核基因结构特点1.转录产物为

（二）真核基因转录特点活性染色体结构变化

对核酸酶敏感、甲基化程度降低、组蛋白乙酰化修饰2.正性调节占主导

真核RNA聚合酶对启动子的亲和力极小或根本没有实质的亲和力，转录起始需依赖多种激活蛋白的作用3．转录与翻译分隔进行

转录在核内进行，翻译在胞浆进行（二）真核基因转录特点活性染色体结构变化2.正性调节

转录（起始）调节实质上是调节蛋白与DNA的相互作用

1、顺式作用元件：2、反式作用因子：

3、mRNA转录激活及其调节（三）真核基因转录激活调节124转录（起始）调节实质上是调节蛋白与DNA的相互作用1

1.顺式作用元件*

指结构基因两侧或内部具有调节功能的DNA序列，因其作用于自身分子并发挥作用，所以称顺式作用元件。

根据位置、性质及作用方式的不同分为启动子、增强子和抑制子。1.顺式作用元件*指结构基因两侧或内部具有

真核生物——顺式作用元件结构基因序列

启动子(promoter)P

抑制子(silencer)

增强子(enhancer)

增强子(enhancer)126真核生物——顺式作用元件结构基因序列启动子(promRNA聚合酶II启动位点周围一组转录控制组件常见组件：

TATA盒（TATAAA）-25bp~-30bp

GC盒（GGGCGG）

CAAT盒（CCAATC）CAAT盒GC盒TATA盒转录起始点-30bp~-110bp启动子promoter127RNA聚合酶II启动位点周围一组转录控制组件常见组件：CA

增强子*

：

远离转录起始点、决定组织特异性表达、增强启动子转录活性的特异DNA序列，其发挥作用的方式与方向、距离无关。

抑制子*

：

对启动子转录活性起抑制作用的DNA序列负性调节元件增强子*：抑制子*：

2、反式作用因子（转录因子）转录因子、转录调节因子、转录调节蛋白

基本转录因子转录激活因子转录抑制因子2、反式作用因子（转录因子）

绝大多数转录因子属于反式作用因子*真核生物：由某一基因表达后，通过DNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用控制另一基因的转录。绝大多数转录因子属于反式作用因子*真核生物：由某一基因表达

ABAB

RNA聚合酶结合启动子所必须的一组转录因子

基本转录因子FEBDARNA

polⅡTATADNATATATFⅡD

TFⅡA

TFⅡB

TFⅡF

TFⅡERNApolⅡRNA聚合酶结合启动子所必须的一组转录因子基本转录因子

转录激活因子（正性调节因子）

通过DNA－蛋白质、蛋白质－蛋白质相互作用起正性调节作用的转录因子。

转录抑制因子（负性调节因子）

通过DNA－蛋白质、蛋白质－蛋白质相互作用起负性调节作用的转录因子。与增强子结合的转录因子与抑制子结合的转录因子转录激活因子（正性调节因子）转录抑制因子（真核RNA聚合酶II不能单独识别启动子，而是由基本转录因子TFIID识别并结合启动子，形成TFIID－启动子复合物，然后有一系列的转录因子（如TFIIA、TFIIB、TFIIE、TFIIF等）加入形成前起始复合物，调节转录的起始。3．mRNA转录激活及其调节134真核RNA聚合酶II不能单独识别启动子，而是由基本转录因子T第三节重组DNA技术135第三节重组DNA技术55基因重组（geneticrecombination）

自然发生的基因重排真核、原核均会发生基因变异、物种演变、生物进化的基础基因工程（geneticengineering）重组DNA技术人工进行基因重组基因重组（geneticrecombination）自

克隆*(名词)：就是指来自同一母本的所有副本或拷贝的集合。克隆化（动词）：获取同一拷贝的过程。二、重组DNA技术相关概念母本克隆clonecloning（一）克隆与克隆化137克隆*(名词)：就是指来自同一母本

细胞克隆：从大量群体细胞中分离出某一种类型细胞，经扩增获得这样一类相同的细胞。在分子生物学领域所说的分子克隆专指

DNA克隆(DNAcloning)。

分子克隆：从众多不同的分子群体中分离到的很多相同分子的集合。细胞克隆：在分子生物学领域所说的分子克隆专指分子克隆：（二）重组DNA技术*

应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（目的基因或目的DNA）与载体DNA连接成复制子，然后通过转化或转染等方法导入宿主细胞，生长、筛选出含有目的基因的转化子细胞。转化子细胞经扩增、提取，获得大量目的DNA的无性繁殖系，即DNA克隆，基因工程。139（二）重组DNA技术*应用酶学的方法，在体外将各

目的DNA载体DNA连接复制子（重组DNA）导入宿主细胞（转化或转染）转化子细胞转化子细胞扩增，可获得大量重组DNA目的DNA载体DNA连接复制子（重组DNA）导入宿主细

基因克隆DNA克隆重组DNA同一概念生物技术工程基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程

获得DNA的无性繁殖系获得目的基因的表达产物重组DNA的目的

基因克隆同一概念生物技术工程基因工程、细胞工程、酶工程、蛋（三）工具酶限制性核酸内切酶连接酶DNA聚合酶反转录酶多聚核苷酸激酶142（三）工具酶限制性核酸内切酶62

限制性核酸内切酶*识别和切割双链DNA分子内部特异核苷酸序列的一类核酸酶。限制性核酸内切酶共分三类，基因工程常用II类酶，这类酶常识别DNA的回文序列

*

。限制性核酸内切酶*识别和切割双链DNA分子内部特异核苷酸序

HpaI：5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’平端PstI：5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’突出粘性末端EcoRI：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’突出粘性末端HpaI：5’-GTTAAC-3’平端Pst

（四）目的基因targetgenecDNA(complementaryDNA)

在体外以RNA（通常为mRNA）为模板，经反转录合成的单链DNA。基因组DNA(genomicDNA)

代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。目的基因又称外源DNA（四）目的基因targetgenecDNA(c

携带外源DNA，实现外源DNA无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体：质粒噬菌体DNA病毒DNA质粒（1）双链环状DNA，细菌染色体外（2）2-3kb或数百kb

（3）独立自主复制，稳定遗传（4）遗传标志(五)基因载体（克隆载体）146质粒（1）双链环状DNA，细菌染色体外(五)基因载三、重组DNA技术的原理与基本过程*1.获取目的基因2.选择、构建基因载体3.目的基因与载体连接，形成重组分子4.重组分子导入受体细胞5.筛选、扩增6.表达目的基因147三、重组DNA技术的原理1.获取目的基因67

+载体目的基因重组DNA分子细菌转化或转染扩增筛选+载体目的基因重组DNA分子细菌转化或转染扩增筛选（1）化学合成（4）PCR（2）基因组DNA文库

（3）cDNA文库1.获取目的基因149（1）化学合成（4）PCR（2）基因组DNA文库

组织或细胞染色体

限制性内切酶多个DNA片段载体多种转化子

（基因文库）重组DNA导入宿主细胞mRNA逆转录cDNAcDNA文库组织或细胞染色体限制性内切酶多个DNA片段载体多种转化子聚合酶链式反应（PCR）

在有特定模板、特异DNA引物及合成DNA所需要的dNTP存在时，向DNA合成体系内加入耐热的DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶*

），经反复变性、退火及延伸的多个循环反应，生成特异DNA产物的过程。151聚合酶链式反应（PCR）在有特定模板、特异DNA

变性：解开模板双链DNA95℃退火：使引物与单链模板DNA结合

55℃延伸：DNA链的合成

72℃变性：解开模板双链DNA退火：使引物与单链模板DNA结合延

2.克隆载体的选择与构建目的基因不能自我复制3.目的基因与载体连接（DNA连接酶*

）重组DNA4.重组DNA导入受体菌安全菌感受态导入方式：转化转染感染2.克隆载体的选择与构建3.目的基因与载体连接（DN

5.重组体的筛选（1）直接选择法

抗药性标志选择amprtetrkanr

标志补救α互补分子杂交（2）非直接选择法

常用免疫学方法特异性强、灵敏度高5.重组体的筛选（1）直接选择法（2）非直接选择法

6.克隆基因的表达

常见表达体系：（1）原核——大肠杆菌（简单、迅速、经济）缺点：无转录后加工——适于表达cDNA

无翻译后加工——无糖基化修饰包涵体

（2）真核——酵母、昆虫细胞、哺乳类动物细胞表达有生物活性的蛋白质6.克隆基因的表达常见表达体系：（2）真核——酵母、四、重组DNA技术的应用1.疾病基因的发现镰刀形红细胞贫血脆性X综合征(FMRI基因沉默)2.生物制药

利用基因工程技术生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界上的一项重大产业。如生产干扰素、胰岛素、细胞因子等。156四、重组DNA技术的应用1.疾病基因的发现镰刀形红细胞贫3.DNA诊断

DNA诊断又称基因诊断，是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平上分析、鉴定遗传性疾病所涉及的基因置换、缺失或插入等突变。4.基因治疗

所谓基因治疗就是向功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。对于基因治疗，人们担心的潜在危险之一是可能会引起未知的遗传效应，如肿瘤等，此外还涉及社会伦理方面的争论。5.遗传病的预防3.DNA诊断DNA诊断又称基因诊断，是利

本章重点

基本概念

基因表达、操纵子、DNA元件、顺式作用元件、反式作用因子（转录因子）、启动子、增强子、基因工程、限制性核酸内切酶、管家基因

原核基因表达调控特点

乳糖操纵子结构及作用机制

基因表达调控的规律、方式、要素本章重点基本概念原核基因表达调控特点乳糖操纵

PCR原理及基本过程

重组DNA技术基本原理

真核基因转录特点

真核基因转录激活调节

真核基因结构特点PCR原理及基本过程重组DNA技术基本原理1、Geniusonlymeanshard-workingallone'slife.(Mendeleyer,RussianChemist)

天才只意味着终身不懈的努力。20.8.58.5.202011:0311:03:10Aug-2011:032、Ourdestinyoffersnotonlythecupofdespair,butthechaliceofopportuni