Ch12-tan-基因诊断与基因治疗课件

第十六章基因诊断与基因治疗Genediagnosisandgenetherapy第十六章基因诊断与基因治疗1基因诊断的概念：以DNA和RNA为诊断材料，应用分子生物学技术方法，直接检查基因的结构、或表达是否异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。基因诊断的概念：2用途——诊断下列两种类型疾病：1、内源基因的变异2、外来生物的入侵基因结构的异常基因致病基因表达的异常用途——诊断下列两种类型疾病：1、内源基因的变异3第一节基因诊断一、基因诊断的特点：1.特异性高，针对性强：使用基因探针通过分子杂交进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于病因诊断或发病原因分析。2.灵敏度高:

用放射性同位素、酶或化学发光试剂标记探针，有很高的检测灵敏度，PCR扩增也有很高的灵敏度。3.早期诊断：无临床表现4.取样方便：不受组织时相限制5.安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型6.适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。第一节基因诊断一、基因诊断的特点：4二、基因诊断的内容和技术直接诊断___致病基因明确间接诊断___致病基因不明确，基因连锁分析分子基础——基因结构异常基因表达异常二、基因诊断的内容和技术直接诊断___致病基因明确5（1）DNA序列测定（2）核酸分子印迹杂交（3）聚合酶链反应（PCR）单链构象多态性检测PCR-SSCP限切酶酶谱分析PCR-RFLP随机引物分析PCR-RAPD（4）DNA芯片技术基因诊断的常用技术类型（1）DNA序列测定基因诊断的常用技术类型61、点突变的诊断PCR结合点杂交DNA芯片技术限制性片断长度多态性分析法RFLP针对不同突变类型的基因诊断技术1、点突变的诊断针对不同突变类型的基因诊断技术7

正常基因：设计寡核苷酸探针MGGTACGATGCGGTTAACGCGCCATGCTACGCCAATTGCGC突变基因：设计寡核苷酸探针N

GGTACGATGTGGTTAACGCGCCATGCTACACCAATTGCGC

8MNMNMNMNMNMNMNMN9杂交的结果：（Ⅰ）受检者DNA与N杂交，与M不杂交：突变基因纯合子（Ⅱ）与M、N都能杂交：突变基因杂合子（Ⅲ）与M杂交，与N不杂交：没有这种突变基因（Ⅳ）M、N均不杂交：可能是新突变杂交的结果：（Ⅰ）受检者DNA与N杂交，与M不杂交：突变10（2）诊断未知的点突变常用检测方法：①PCR-SSCP②DNA芯片③测序（2）诊断未知的点突变11①PCR-SSCP检测法单链构象多态性SinglestrandconformationpolymorphismSSCP①PCR-SSCP检测法12基本原理

单链DNA在中性溶液中可形成一定的空间构象，构象与其碱基顺序相关。因此当单链DNA中碱基变异时，如碱基替换，它的空间构象也发生一定变化。这种现象称为单链构象多态性。基本原理13单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率不仅与链长有关，还与单链DNA的空间构象有关，因此碱基变异引起的构象变化也可改变单链DNA的电泳迁移率。单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其14ssDNAdsDNA高温变性，快速冰浴野生型DNA突变型DNASSCP原理示意图慢快点样孔ssDNAdsDNA高温变性，快速冰浴野生型DNA突变型DN152、少数核苷酸缺失或插入突变的诊断方法同点突变的诊断2、少数核苷酸缺失或插入突变的诊断方法同点突变的诊断163、大片断缺失或插入突变的诊断常采用PCR法致病基因引物1引物2引物3引物43、大片断缺失或插入突变的诊断致病基因引物1引物2引物3174、基因重排（染色体易位）的诊断常采用PCR法引物1引物2引物34、基因重排（染色体易位）的诊断引物1引物2引物3185、基因扩增的诊断常采用Southern印迹杂交定量法5、基因扩增的诊断19关于多态性分析基因组的核酸分子碱基排列顺序在同种生物的不同个体之间或等位基因之间存在差异的现象称为基因多态性。DNA多态性可分为位点多态性和重复序列多态性两种。关于多态性分析基因组的核酸分子碱基201、限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析1、限制性片段长度多态性（restrictionfragm21DNA分子中某些碱基的变异（即位点多态性）可使某种限制性核酸内切酶的切点消失或出现新的切点，因此用同一种限制性核酸内切酶消化不同个体的DNA分子时，会产生各不相同的限制性片段类型。这种现象称为限制性片段长度多态性。DNA分子中某些碱基的变异（即位点多态性）可22限制酶酶切位点的改变造成的RFLP可分为两种情况：

①限制酶识别位点发生单个碱基置换，导致酶切位点消失或获得，此称为点多态性。这种多态性只有两个等位片断，即多态位点的有或无。限制酶酶切位点的改变造成的RFLP可分为两种23

②限制酶识别位点之间的DNA序列缺失、插入或重组，限制酶识别序列不发生变化，但它在基因组中的位置发生了变化。这种多态性可以有两个或两个以上的等位片断。②限制酶识别位点之间的DNA序列缺失、插入或重组，限24RFLP分析法限制酶酶切图谱直接分析法RFLP间接分析法RFLP分析法25（1）限制酶酶切图谱直接分析法①限制酶酶切—Southern印迹杂交。②PCR—限制酶酶切（1）限制酶酶切图谱直接分析法26应用RFLP诊断镰刀状红细胞性贫血正常人珠蛋白基因GAGHbS的珠蛋白mRNAGlu正常人珠蛋白肽链GUGHbS的珠蛋白肽链ValHbS的珠蛋白基因6CAC正常人珠蛋白mRNA6CTC应用RFLP诊断镰刀状红细胞性贫血正常人珠蛋白基因G27MstⅡ酶切位点CCTNAGGCCTNTGGMstⅡ酶AT替换MstⅡ酶切位点CCTNAGGCCTNTGGMstⅡ酶AT替28HbA---------CCTGAGGAG-------HbS---------CCTGTGGAG-------MstⅡMstⅡMstⅡ1.1kb0.2kb1.3kbHbA---------CCTGAGGAG-------291.1kb1.3kb0.2kbSSASFAARFLP法检测HbSSS:HbS纯合子AS:HbS杂合子AA:正常F:被检胎儿(放射性自显影图谱)1.1kb1.3kb0.2kbSSASFAARFLP法检测H30（2）RFLP间接分析法——RFLP连锁分析法甲型血友病疾病种类：X染色体连锁性遗传病缺陷基因：凝血因子Ⅷ基因主要临床表现：出血性疾病（2）RFLP间接分析法——31应用PCR-RFLP连锁分析法诊断甲型血友病用一对引物扩增凝血因子Ⅷ基因第18外显子内的一个142bp片断，该片断含一个BclⅠ多态性位点。酶解后，如果存在BclⅠ酶切位点，则产生99bp和43bp两个片断；如果不存在则只有142bp一个片断。研究证明，142bp片断与甲型血友病基因连锁。应用PCR-RFLP连锁分析法诊断甲型血友病32142bp99bp正常男性女性携带者先证者胎儿绒毛样品142bp99bp正常男性女性携带者先证者胎儿绒毛样品332、DNA重复序列多态性分析2、DNA重复序列多态性分析34（三）基因表达异常的诊断1、mRNA的定量分析（1）相对定量斑点杂交RT-PCR（2）绝对定量2、mRNA长度分析Northern印迹杂交RT-PCR（三）基因表达异常的诊断2、mRNA长度分析35三、遗传病的基因诊断

1、直接诊断策略2、间接诊断策略三、遗传病的基因诊断1、直接诊断策略36（一）血红蛋白病1.异常血红蛋白病1、DNA检测与分析（1）PCR-限制酶谱分析法（2）Southern印迹杂交分析法2、RNA检测与分析RT-PCR（一）血红蛋白病37镰状细胞贫血病（sicklecellaneamia）MstII酶切位点CCTNAGGGGANTCC点突变TACCANAGGGGTNTCC

酶切凝胶电泳Southernblock珠蛋白基因探针杂交

镰状细胞贫血病（sicklecellaneamia）M382.

地贫(1)-地贫1）DNA检测与分析（a）RFLP（b）PCR2）RNA检测与分析RT-PCR2.地贫39（2）-地贫的基因诊断1)DNA检测与分析（1）PCR-探针法（2）PCR-RFLP连锁分析法（3）DNA芯片技术2)RNA检测与分析RT-PCR（2）-地贫的基因诊断40C地中海贫血珠蛋白基因3’端缺失0.6kb

BglIIBglIIACC地中海贫血珠蛋白基因3’端缺失0.6kb

Bg41（二）血友病AfactorVIII基因缺陷（碱基取代、缺失或插入等）基因产物凝血因子VIII无活性或不稳定，导致凝血障碍。PCR扩增因子VIII基因的18号外显子142bp片段BclI限制酶酶切位点在基因内18号外显子3´端电泳染色,分析片段的家系分布,作出产前诊断142bp99bp父母儿胎儿

(先证者)(女)（二）血友病AfactorVIII基因缺陷（碱基取代、缺42四、肿瘤的基因诊断一)肿瘤基因诊断的策略1、检测肿瘤标记基因或mRNA2、检测肿瘤相关基因3、检测肿瘤相关病毒基因四、肿瘤的基因诊断一)肿瘤基因诊断的策略43（二）肿瘤相关基因的检测

ras癌基因的检测1、常见突变类型：点突变（突变热点在12、13、61位密码子的编码区）2、常用检测方法（1）PCR-ASO（2）PCR-SSCP（二）肿瘤相关基因的检测44抑癌基因p53的检测1、常见突变类型：点突变突变热点在5~8号外显子，有少量插入或缺失2、常检测方法（1）PCR-SSCP（2）PCR结合序列分析（3）PCR-RFLP抑癌基因p53的检测45五、感染性疾病的基因诊断目前应用最多是PCR法，不仅可检测病原体的DNA（如乙肝病毒、巨细胞病毒、乳头瘤病毒、结核杆菌等），而且可检测RNA病原体（RT-PCR检测艾滋病病毒、丙肝病毒等）。五、感染性疾病的基因诊断目前应用最多是PCR法，不仅可检测病46应用范围1.可快速准确查出致病病原体;2.适于早期诊断、带菌带毒者和潜在感染的发现；3.大规模病原流行病学的现场筛查4.病原体抗药性的快速敏感试验;5.对微生物的科属种进行准确分类鉴定;。应用范围47六基因诊断在法

医学中的应用PCR结合DNA指纹技术六基因诊断在法

医学中的应用PCR结合DNA指纹技术48Southernblot应用DNA指纹分析血迹中的DNASouthernblot应用血迹中的DNA49第二节基因治疗

Genetherapy基因治疗的概念基因治疗是指把目的基因导入人体，通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达或低表达、或已异常突变而不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。第二节基因治疗

Genetherapy基因治疗的概念50Ch12-tan-基因诊断与基因治疗课件51Ch12-tan-基因诊断与基因治疗课件52一、基因治疗的必要条件（1）用传统治疗无效或效果不佳；（2）发病的分子机制已阐明，且目的基因已经克隆且对其产物有详尽的了解，；（3）目的基因能在体外操作，能有效的导入靶细胞；能在靶细胞中一段时间或长期稳定驻留；（4）导入基因能有适度表达；（5）基因导入方法和所用载体对靶细胞安全无害；（6）目的基因的表达不需严格控制，或能够人为控制；（7）人类的基因治疗需经过严格审批一、基因治疗的必要条件（1）用传统治疗无效或效果不佳；53二、基因治疗的主要策略二、基因治疗的主要策略54（一）基因修复或基因矫正

矫正突变碱基，精确的原位修复最理想，难以实现（一）基因修复或基因矫正

矫正突变碱基，精确的原位修复55(二)基因置换指将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以导入基因置换基因组内的原有缺陷基因基因打靶技术（同源重组）(二)基因置换56（三）基因增补1、概念通过导入外源基因是靶细胞表达其本身不表达的基因。2、基因添加的两种类型（1）针对特定的缺陷基因导入其相应正常基因（2）向靶细胞中导入靶细胞中本来不表达的基因（三）基因增补1、概念57（四）基因干预采取特定的方式抑制某个基因的表达，或通过破坏某个基因使之不表达1.反义核酸技术2.核酶3.RNA干扰技术（RNAi)（四）基因干预采取特定的方式抑制某个基因的表达，或通过破坏某58Ch12-tan-基因诊断与基因治疗课件59三、基因治疗的基本程序（一）目的基因的选择和制备三、基因治疗的基本程序（一）目的基因的选择和制备60（二）靶细胞的选择（二）靶细胞的选择61（三）基因的导入

（基因转移技术）基因治疗的方式：体内法：体内直接转移基因法

回体法：靶细胞介导的基因治疗（三）基因的导入

（基因转移技术）基因治疗的方式：62基因导入的方式病毒载体法非病毒载体法基因导入的方式病毒载体法63Ch12-tan-基因诊断与基因治疗课件64Ch12-tan-基因诊断与基因治疗课件65Ch12-tan-基因诊断与基因治疗课件66逆转录病毒载体1、逆转录病毒载体的结构ψLTRLTRgagpolenvψLTRLTRgagpolenv67在包装细胞中包装成假病毒LTRLTRneuψAmproriE在包装细胞中包装成假病毒LTRLTRneuψAmprori682、包装细胞3、逆转录病毒载体的特点（1）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；（2）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；（3）感染靶细胞后不扩散；（4）假病毒感染靶细胞的效率非常高；（5）不感染非增殖细胞。2、包装细胞694、安全性问题（1）感染的可能性（2）污染的可能性（3）在靶细胞基因组中的整合4、安全性问题70（二）腺病毒载体1、结构E1AE1BE2BE2AE4E3L1~L5（二）腺病毒载体E1AE1BE2BE2AE4E3L1~L571Ch12-tan-基因诊断与基因治疗课件722、特点（1）宿主范围广（2）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件（3）可获得高病毒效价（4）重组体非常稳定（5）不会引起肿瘤（6）有较高的安全性（7）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用（8）不整合入染色体2、特点73（三）腺相关病毒载体1、结构ITRITRREPCAPψ（三）腺相关病毒载体ITRITRREPCAPψ742、特点（1）能够进行位点特异性整合（2）无致病性（3）载体结构简单（4）稳定（5）不引起肿瘤形成2、特点75（四）单纯疱疹病毒载体1、结构abU1b`a`c`Usca2、特点（1）滴度高（2）容量大（3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染（4）不整合，但可长期存在并可稳定表达（四）单纯疱疹病毒载体abU176基因转移的非生物学方法（一）脂质体（二）直接注射法（三）受体介导基因转移技术（四）其他方法基因转移的非生物学方法77（四）转染靶细胞的筛选和导入基因的鉴定1、选择靶细胞应考虑因素（1）组织特异性细胞；（2）易获得、寿命长（3）离体细胞易受外源遗传物质转化；（4）易成活。（四）转染靶细胞的筛选和导入基因的鉴定782、常用靶细胞（1）造血细胞（2）皮肤成纤维细胞（3）肝细胞（4）血管内皮细胞（5）淋巴细胞（6）肌肉细胞（7）肿瘤细胞（8）其他细胞2、常用靶细胞（1）造血细胞79四、基因治疗的应用研究四、基因治疗的应用研究80（一）单基因遗传病的基因治疗腺苷脱氨酶缺乏症缺陷基因：腺苷脱氨酶基因主要临床表现：免疫缺陷基因治疗方法：逆转录病毒载体包装细胞骨髓造血干细胞回输体内（一）单基因遗传病的基因治疗81Ch12-tan-基因诊断与基因治疗课件82血友病血友病83（二）肿瘤的基因治疗研究策略（一）修正肿瘤相关基因的功能1、恢复抑癌基因的功能2、纠正癌基因的表达（二）导入特定的基因产生肿瘤特异的药物敏感性（三）肿瘤的免疫基因治疗（二）肿瘤的基因治疗研究84复习题一、名词基因诊断、基因治疗、-地中海贫血、-地中海贫血、基因转染、基因打靶。复习题85二、问题1、基因诊断的优点和应用如何？2、基因治疗的概念、策略和基本步骤是什么？二、问题86第十六章基因诊断与基因治疗Genediagnosisandgenetherapy第十六章基因诊断与基因治疗87基因诊断的概念：以DNA和RNA为诊断材料，应用分子生物学技术方法，直接检查基因的结构、或表达是否异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。基因诊断的概念：88用途——诊断下列两种类型疾病：1、内源基因的变异2、外来生物的入侵基因结构的异常基因致病基因表达的异常用途——诊断下列两种类型疾病：1、内源基因的变异89第一节基因诊断一、基因诊断的特点：1.特异性高，针对性强：使用基因探针通过分子杂交进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于病因诊断或发病原因分析。2.灵敏度高:

用放射性同位素、酶或化学发光试剂标记探针，有很高的检测灵敏度，PCR扩增也有很高的灵敏度。3.早期诊断：无临床表现4.取样方便：不受组织时相限制5.安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型6.适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。第一节基因诊断一、基因诊断的特点：90二、基因诊断的内容和技术直接诊断___致病基因明确间接诊断___致病基因不明确，基因连锁分析分子基础——基因结构异常基因表达异常二、基因诊断的内容和技术直接诊断___致病基因明确91（1）DNA序列测定（2）核酸分子印迹杂交（3）聚合酶链反应（PCR）单链构象多态性检测PCR-SSCP限切酶酶谱分析PCR-RFLP随机引物分析PCR-RAPD（4）DNA芯片技术基因诊断的常用技术类型（1）DNA序列测定基因诊断的常用技术类型921、点突变的诊断PCR结合点杂交DNA芯片技术限制性片断长度多态性分析法RFLP针对不同突变类型的基因诊断技术1、点突变的诊断针对不同突变类型的基因诊断技术93

正常基因：设计寡核苷酸探针MGGTACGATGCGGTTAACGCGCCATGCTACGCCAATTGCGC突变基因：设计寡核苷酸探针N

GGTACGATGTGGTTAACGCGCCATGCTACACCAATTGCGC

94MNMNMNMNMNMNMNMN95杂交的结果：（Ⅰ）受检者DNA与N杂交，与M不杂交：突变基因纯合子（Ⅱ）与M、N都能杂交：突变基因杂合子（Ⅲ）与M杂交，与N不杂交：没有这种突变基因（Ⅳ）M、N均不杂交：可能是新突变杂交的结果：（Ⅰ）受检者DNA与N杂交，与M不杂交：突变96（2）诊断未知的点突变常用检测方法：①PCR-SSCP②DNA芯片③测序（2）诊断未知的点突变97①PCR-SSCP检测法单链构象多态性SinglestrandconformationpolymorphismSSCP①PCR-SSCP检测法98基本原理

单链DNA在中性溶液中可形成一定的空间构象，构象与其碱基顺序相关。因此当单链DNA中碱基变异时，如碱基替换，它的空间构象也发生一定变化。这种现象称为单链构象多态性。基本原理99单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率不仅与链长有关，还与单链DNA的空间构象有关，因此碱基变异引起的构象变化也可改变单链DNA的电泳迁移率。单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其100ssDNAdsDNA高温变性，快速冰浴野生型DNA突变型DNASSCP原理示意图慢快点样孔ssDNAdsDNA高温变性，快速冰浴野生型DNA突变型DN1012、少数核苷酸缺失或插入突变的诊断方法同点突变的诊断2、少数核苷酸缺失或插入突变的诊断方法同点突变的诊断1023、大片断缺失或插入突变的诊断常采用PCR法致病基因引物1引物2引物3引物43、大片断缺失或插入突变的诊断致病基因引物1引物2引物31034、基因重排（染色体易位）的诊断常采用PCR法引物1引物2引物34、基因重排（染色体易位）的诊断引物1引物2引物31045、基因扩增的诊断常采用Southern印迹杂交定量法5、基因扩增的诊断105关于多态性分析基因组的核酸分子碱基排列顺序在同种生物的不同个体之间或等位基因之间存在差异的现象称为基因多态性。DNA多态性可分为位点多态性和重复序列多态性两种。关于多态性分析基因组的核酸分子碱基1061、限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析1、限制性片段长度多态性（restrictionfragm107DNA分子中某些碱基的变异（即位点多态性）可使某种限制性核酸内切酶的切点消失或出现新的切点，因此用同一种限制性核酸内切酶消化不同个体的DNA分子时，会产生各不相同的限制性片段类型。这种现象称为限制性片段长度多态性。DNA分子中某些碱基的变异（即位点多态性）可108限制酶酶切位点的改变造成的RFLP可分为两种情况：

①限制酶识别位点发生单个碱基置换，导致酶切位点消失或获得，此称为点多态性。这种多态性只有两个等位片断，即多态位点的有或无。限制酶酶切位点的改变造成的RFLP可分为两种109

②限制酶识别位点之间的DNA序列缺失、插入或重组，限制酶识别序列不发生变化，但它在基因组中的位置发生了变化。这种多态性可以有两个或两个以上的等位片断。②限制酶识别位点之间的DNA序列缺失、插入或重组，限110RFLP分析法限制酶酶切图谱直接分析法RFLP间接分析法RFLP分析法111（1）限制酶酶切图谱直接分析法①限制酶酶切—Southern印迹杂交。②PCR—限制酶酶切（1）限制酶酶切图谱直接分析法112应用RFLP诊断镰刀状红细胞性贫血正常人珠蛋白基因GAGHbS的珠蛋白mRNAGlu正常人珠蛋白肽链GUGHbS的珠蛋白肽链ValHbS的珠蛋白基因6CAC正常人珠蛋白mRNA6CTC应用RFLP诊断镰刀状红细胞性贫血正常人珠蛋白基因G113MstⅡ酶切位点CCTNAGGCCTNTGGMstⅡ酶AT替换MstⅡ酶切位点CCTNAGGCCTNTGGMstⅡ酶AT替114HbA---------CCTGAGGAG-------HbS---------CCTGTGGAG-------MstⅡMstⅡMstⅡ1.1kb0.2kb1.3kbHbA---------CCTGAGGAG-------1151.1kb1.3kb0.2kbSSASFAARFLP法检测HbSSS:HbS纯合子AS:HbS杂合子AA:正常F:被检胎儿(放射性自显影图谱)1.1kb1.3kb0.2kbSSASFAARFLP法检测H116（2）RFLP间接分析法——RFLP连锁分析法甲型血友病疾病种类：X染色体连锁性遗传病缺陷基因：凝血因子Ⅷ基因主要临床表现：出血性疾病（2）RFLP间接分析法——117应用PCR-RFLP连锁分析法诊断甲型血友病用一对引物扩增凝血因子Ⅷ基因第18外显子内的一个142bp片断，该片断含一个BclⅠ多态性位点。酶解后，如果存在BclⅠ酶切位点，则产生99bp和43bp两个片断；如果不存在则只有142bp一个片断。研究证明，142bp片断与甲型血友病基因连锁。应用PCR-RFLP连锁分析法诊断甲型血友病118142bp99bp正常男性女性携带者先证者胎儿绒毛样品142bp99bp正常男性女性携带者先证者胎儿绒毛样品1192、DNA重复序列多态性分析2、DNA重复序列多态性分析120（三）基因表达异常的诊断1、mRNA的定量分析（1）相对定量斑点杂交RT-PCR（2）绝对定量2、mRNA长度分析Northern印迹杂交RT-PCR（三）基因表达异常的诊断2、mRNA长度分析121三、遗传病的基因诊断

1、直接诊断策略2、间接诊断策略三、遗传病的基因诊断1、直接诊断策略122（一）血红蛋白病1.异常血红蛋白病1、DNA检测与分析（1）PCR-限制酶谱分析法（2）Southern印迹杂交分析法2、RNA检测与分析RT-PCR（一）血红蛋白病123镰状细胞贫血病（sicklecellaneamia）MstII酶切位点CCTNAGGGGANTCC点突变TACCANAGGGGTNTCC

酶切凝胶电泳Southernblock珠蛋白基因探针杂交

镰状细胞贫血病（sicklecellaneamia）M1242.

地贫(1)-地贫1）DNA检测与分析（a）RFLP（b）PCR2）RNA检测与分析RT-PCR2.地贫125（2）-地贫的基因诊断1)DNA检测与分析（1）PCR-探针法（2）PCR-RFLP连锁分析法（3）DNA芯片技术2)RNA检测与分析RT-PCR（2）-地贫的基因诊断126C地中海贫血珠蛋白基因3’端缺失0.6kb

BglIIBglIIACC地中海贫血珠蛋白基因3’端缺失0.6kb

Bg127（二）血友病AfactorVIII基因缺陷（碱基取代、缺失或插入等）基因产物凝血因子VIII无活性或不稳定，导致凝血障碍。PCR扩增因子VIII基因的18号外显子142bp片段BclI限制酶酶切位点在基因内18号外显子3´端电泳染色,分析片段的家系分布,作出产前诊断142bp99bp父母儿胎儿

(先证者)(女)（二）血友病AfactorVIII基因缺陷（碱基取代、缺128四、肿瘤的基因诊断一)肿瘤基因诊断的策略1、检测肿瘤标记基因或mRNA2、检测肿瘤相关基因3、检测肿瘤相关病毒基因四、肿瘤的基因诊断一)肿瘤基因诊断的策略129（二）肿瘤相关基因的检测

ras癌基因的检测1、常见突变类型：点突变（突变热点在12、13、61位密码子的编码区）2、常用检测方法（1）PCR-ASO（2）PCR-SSCP（二）肿瘤相关基因的检测130抑癌基因p53的检测1、常见突变类型：点突变突变热点在5~8号外显子，有少量插入或缺失2、常检测方法（1）PCR-SSCP（2）PCR结合序列分析（3）PCR-RFLP抑癌基因p53的检测131五、感染性疾病的基因诊断目前应用最多是PCR法，不仅可检测病原体的DNA（如乙肝病毒、巨细胞病毒、乳头瘤病毒、结核杆菌等），而且可检测RNA病原体（RT-PCR检测艾滋病病毒、丙肝病毒等）。五、感染性疾病的基因诊断目前应用最多是PCR法，不仅可检测病132应用范围1.可快速准确查出致病病原体;2.适于早期诊断、带菌带毒者和潜在感染的发现；3.大规模病原流行病学的现场筛查4.病原体抗药性的快速敏感试验;5.对微生物的科属种进行准确分类鉴定;。应用范围133六基因诊断在法

医学中的应用PCR结合DNA指纹技术六基因诊断在法

医学中的应用PCR结合DNA指纹技术134Southernblot应用DNA指纹分析血迹中的DNASouthernblot应用血迹中的DNA135第二节基因治疗

Genetherapy基因治疗的概念基因治疗是指把目的基因导入人体，通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达或低表达、或已异常突变而不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。第二节基因治疗

Genetherapy基因治疗的概念136Ch12-tan-基因诊断与基因治疗课件137Ch12-tan-基因诊断与基因治疗课件138一、基因治疗的必要条件（1）用传统治疗无效或效果不佳；（2）发病的分子机制已阐明，且目的基因已经克隆且对其产物有详尽的了解，；（3）目的基因能在体外操作，能有效的导入靶细胞；能在靶细胞中一段时间或长期稳定驻留；（4）导入基因能有适度表达；（5）基因导入方法和所用载体对靶细胞安全无害；（6）目的基因的表达不需严格控制，或能够人为控制；（7）人类的基因治疗需经过严格审批一、基因治疗的必要条件（1）用传统治疗无效或效果不佳；139二、基因治疗的主要策略二、基因治疗的主要策略140（一）基因修复或基因矫正

矫正突变碱基，精确的原位修复最理想，难以实现（一）基因修复或基因矫正

矫正突变碱基，精确的原位修复141(二)基因置换指将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以导入基因置换基因组内的原有缺陷基因基因打靶技术（同源重组）(二)基因置换142（三）基因增补1、概念通过导入外源基因是靶细胞表达其本身不表达的基因。2、基因添加的两种类型（1）针对特定的缺陷基因导入其相应正常基因（2）向靶细胞中导入靶细胞中本来不表达的基因（三）基因增补1、概念143（四）基因干预采取特定的方式抑制某个基因的表达，或通过破坏某个基因使之不表达1.反义核酸技术2.核酶3.RNA干扰技术（RNAi)（四）基因干预采取特定的方式抑制某个基因的表达，或通过破坏某144Ch12-tan-基因诊断与基因治疗课件145三、基因治疗的基本程序（一）目的基因的选择和制备三、基因治疗的基本程序（一）目的基因的选择和制备146（二）靶细胞的选择（二）靶细胞的选择147（三）基因的导入

（基因转移技术）基因治疗的方式：体内法：体内直接转移基因法

回体法：靶细胞介导的基因治疗（三）基因的导入

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