cDNA的合成原理及方法

Word-18-cDNA的合成原理及方法

cDNA的合成原理及办法RT-PCR重要环节cDNA的合成原理及办法逆转录PCRRT-PCR具有敏捷度高、专一性好、简便快捷等优点，其不仅是定量检测微量样品和表述水平低的基因的一种有效办法，同时也是从真核生物中得到目的基因的一条重要途径cDNA的合成是RT-PCR的重要环节以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，随机引物、oligodT或基因特异性引物的引领下合成互补的DNAcomplementaryDNA,cDNA,再根据一般PCR的办法用两条引物以cDNA为模板，则可扩增出不含内含子的可编码完整基因的序列不同mRNA拷贝成cDNA的效率不同；因此，适合于一种mRNA拷贝的条件可能对另一种niRNA不适合普通来说，从事不均一mRMA群体时，所使用的条件是导致cDNA合成的终产量达到最大，下述参数非常重耍

1.逆转录酶有两种不同的逆转录酶能够催化以mRNA为模板，oligodT作为引物，合成与mRNA互补的cDNA链一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒AMV,由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNA酶H活性，它最适温度是42℃,最适pH

8.3在高反应温度时可消退mRNA的二级结构对逆转录的妨碍,然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度其它，禽源逆转录酶制剂可被能切割DNA的核酸内切酶污染另一种来源于鼠白血病病毒Mo-MLV,是单肽链的，有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNA酶H活性，最适温度37℃,最适pH

7.6,较弱的RNA酶H活性对得到2-3kb的mRNA的全长cDNA有很大益处在第一链反应前可用氢氧化甲基汞处理，破坏mRNA的二级结构，这一步对于最适反应温度较低37℃的鼠源逆转录酶催化的反应可能更为重要临合成cDNA第一链之前加入过量的筑基试剂，能够使氢氧化甲基汞从RNA上解离

2.单价阳离子离子条件基本上影响各种模板的转录效率用钾比用钠离子可得到较长的转录产物对于cDNA长度的最适钾离子浓度为140-150mMo

3.二价阳离子对于反转录酶活性来说，二价阳离子是必须的低于4mMMg2未能观看到活性；产生全长转录产物的最适浓度是6-10成

4.脱氧核昔三磷酸使用四种脱氧核昔三磷酸dNTP中每一种的高浓度对于有效合成cDNA是特殊重要的假如其中惟独一种的浓度下降到10-50微摩尔以下，全长转录物的产量将显然下降常用的dNTP的浓度为200-250微摩尔材料与办法1材料RNA样品2仪器、用具PCR仪、电泳仪等、

0.2mlPCR管1个、移液器、碎冰3试剂值的协调十分关键普通来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过2〜3摄氏度，同时引物和产物的Tm值也不要相差太大，20摄氏度范围内较好

④引物的额外序列与退火温度若有额外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构能够使用加长的引物普通说来，引物5,端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，能够在较低退火温度的条件下举行4到5个扩增循环;然后在假定引物5端序列已经加入到模板中,计算得出的退火温度下举行其余的循环在引物上添加限制酶位点时一个重要的考虑是大多数限制酶的有效切割要求在它们的识别序列的5端有2至3个非特异的额外碱基，这样就会增强引物的非模板特异序列的长度长引物序列的另一个缺点是影响溶解温度的精确计算，而这对于确定PCR反应时的退火温度又是必需的对于低于20个碱基的引物，Tm值能够按照Tm=4G+C+2A+T计算而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式获得，现有些PCR引物设计软件大多数都采纳这种方式

⑤引物的3,末端核甘酸组成引物3末端和模板的碱基彻低配对对于得到好的结果是十分重要的，而引物3末端最后5到6个核苜酸的错配应尽可能的少假如3,末端的错配过多，利用降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败引物3,末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性应特殊注重引物不能互补，尤其是在3,末端引物间的互补将导致不想要的引物双链体的浮现，这样得到的PCR产物其实是引物自身的扩增这将会在引物双链体产物和自然 模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增胜利引物3末端的稳定性由引物3末端的碱基组成打算，普通考虑末端5个碱基的AG此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3,末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位启发需要注重的是，引物3,末端应尽量避开T试验证实，以T结尾的引物即使与T,G或C错配仍可有效延长

⑥PCR产物的长度及在耙序列内的位置全部的计算机程序都提供对PCR产物长度范围的挑选普通说来，PCR产物长度对扩增效率有影响特定的应用状况下，PCR产物长度部分取决于模板材料预期产物的特定长度常常取决于应用的需要若目的是建立测定特异DNA片段的临床检验办法，120〜300bp的小DNA扩增产物可能是最好的产物应具有好的特异性和高的产生效率，并含有能用于探针捕获杂交试验的足够信息这一长度范围的产物能够利用采纳两步扩增循环办法获得，从而削减扩增时光其他PCR办法有不同的最佳产物长度例如，利用定量的RNA-PCR检测基因表述时，产物应当足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都可以在凝胶上很简单的辨别出来这些产物普通在250〜750bp范围内

⑦补充说明若在cDNA序列内找寻PCR引物，需特殊注重两点首先，尽力将•引物和产物保持在mRNA的编码区域内，由于这是生成蛋白质的独特序列，不像3,末端非编码区域与许多其他mRNA有同源性；其次，尽力把引物放在不同的外显子上，以便使RNA特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区分若PCR的目的是克隆一个基因或cDNA的特异序列，产物的大小是按照详细应用预选的在这里，计算机程序能够提供关于期望区域侧翼挑选引物对的信息在挑选用来扩增来自不同物种DNA的引物时，应避免mRNA的5,和3,末端非翻译区序列,由于它们可能没有任何的同源性

3.简并引物设计

①设计简并引物时，一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码的简并度很明显，我们期望挑选简并度最低的氨基酸，达到提升特异性的目的

②充分注重物种对于密码子的偏好性，挑选该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性

③应努力避开3末端的简并，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3末端不要位于密码子的第三位

④在一些多义位置使用脱氧次黄喋吟di代替简并碱基

4.测序引物设计固然，测序引物的设计普通都由测序公司来完成，假如需要自己设计的话；那么除了根据上面所提到的引物设计通用标准外，还需要注重两点

①测序引物的特异性的标准掌控应当更严格一些，也就是说设计时更优先考虑特异性由于在测序反应中，假如引物与模板在非预期位置退火并启发链延长，会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读

②测序引物的Tm值适当高一些现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA聚合酶来催化，并采纳PCR的热循环程序选用的测序引物的Tm值稍高一些，有助于使反应顺当跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应

5.探针的设计探针的设计，按照不同的用途各有其设计特征，这里只是就通用的原则举行研究

①探针的长短普通在20-50核甘酸之间，过长合成成本高，且易浮现聚合酶合成错误，杂交时光长太短则特异性下降

②注重G和C的含量努力控制在40-60%,同时一种碱基延续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生

③探针自身序列不能形成二聚体，也不能有“发夹”结构存在，这一点上的要求就要比一般引物设计严格得多

④假如探针地靶任务是多个基因的混合物，就必需控制该探针与无关基因之间的相像性在70%以下PCR中常见问题分析与对策.PCR产物的电泳检测时光普通认为PCR产物应在48h以内完成电泳检测，有的最好于当日电泳检测，大于48h后带型就会浮现不规章，甚至消逝RNaseFreedH20；5XRTBuffer含25mMMg2；dNTPlOmMeach；RNaseInhibitor1OU/u1；OligodT2022umol/L；ReverTraAce4办法1以总RNA为模板，合成cDNA第一链，体系如下2反转录反应条件为30℃lOmin,42℃30min,99℃5min,4℃5mino反应结束后冰浴5mino注重事项

①cDNA第一链合成的反应液冰上配制使用ReverTraAce、RNaseInhibitor等酶类时，应轻轻混匀，避开起泡；因为酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应渐渐吸取请教梯度PCR设置梯度问题请问梯度PCR在变性、退火及延长三步均可设置梯度，那么假如在摸条件时三步均设置梯度，是否有N*M*K每种参考书上都有关于梯度PCR地做法首先应当明确的是所谓梯度PCR,只是在退火时候的条件试探试想一下，在变性及延长过程中的温度有须要试探吗？这两个根据常规的就能够了至于如何举行梯度PCR,实际很容易，只要你的仪器是gradientPCR仪，根据正常的设置举行即可普通的gradientPCR仪地温度是每一排或者每一行一个温度，你可根据2度提增或者减，举行一次试探条件的反应，然后得到你的产物假如需要量少，估量试探条件的过程已经拿到足够的样品了梯度PCR只是便利你寻觅最佳PCR退火温度，可能削减你做PCR的次数和时光使用时和楼上的兄弟说的一样，但有一点需要说明一下，就是你所设的温度梯度并不能象楼上的兄弟所说的那么容易，设温度梯度时，第一行的温度是需要一个容易计算的比如一个12X8的96孔板，假如一共可设12个温度梯度，也就是说每8个孔是一个温度你所设的初始温度是56度，你设的温度梯度是14,那你每一排的温度相差就是14/12以些类推其它，一个PCR引物和体系设计出来以后，如何确定一个基准的温度，然后再按照这个温度上下调节呢？其实一个很有用且容易的办法就是你将你所设计的引物我PCR产物放到Oligo中去评价，它会给你一个最佳的退火温度和循环参数，这个温度实际上就和你利用梯度PCR试探出来的退火温度几乎是一样的所以，以我的阅历就直接用软件给出的退火温度就没有问题不会有那么多种组合的，三种参数再加上时光这一维，PCR惟独一个平面的BLOCKo其实变性和延长都没有须要设置梯度，至于举行通常所说的梯度PCR按照PCR仪的产品说明书举行就能够了我们学院有几种PCR仪，birad的、ABI的，还有红色的那种忘了啥名，ABI的设置最容易，能够直接设定所要的温度，甚至还能够设置时光梯度，就是每个循环变化多少时光，而birad的要你自己设置好b1ock最左边一竖行（最低温度）和最右边一竖行（最高温度）的温度，然后仪器会算出每一个竖行的温度，自己能够查看一下，按照自己所要的温度举行放置EP管（固然，普通竖行的温度只是临近你所要的温度，而不是精确地和你所要的相同，而且各个竖行之间不是等温差的），biorad的是比较老的，PTC-100和PTC-200,不知道新的仪器是不是也一样反正产品说明书都将得非常明白的梯度PCR是寻觅最佳PCR退火温度时使用的,普通就在退火时设置梯度就能够了设计的引物经软件分析，获得一个退火温度，你能够上下浮动5度，设梯度但是，温度并不是递增的，每一竖排的8个是一样的温度，在运行前要登记各排的温度，PCR结束后就能够点样观测哪个温度的样品条带最好，然后就能够确定该引物的退火温度了普通只对退火温度设置梯度温度，我主要补充一点是，无数PCR仪器的梯度不是平均分布的，12排的温度，两边最外面的2排都比较临近，中间的稍为平均一点该回答共有0位秀友支持回答者8star一级试用期回复时光2022-05-2502:30『生物部落空间』你所购买的引物说明书上应当给出了退火温度，我作试验时正向引物和反向引物的退火温度还不一样，不能太低，太低简单浮现杂带，应当高于说明书上的退火温度1〜2度为宜我的试验是这样，仅供参考该回答共有位秀友支持回答者dandi一级试用期回复时光2022-05-2509:05『生物部落空间』如楼上所说，梯度PCR是为了试探退火温度的设置办法楼上各位都说了，各种型号的仪器的设置大同小异普通同一排的一个温度，所以不要放错了，并做好标记跑完了跑个胶照个相，看看那个温度的条带特异性最好就知道了假如特异性都很好，那就照看一下内参和其他引物的退货温度，个人认为，退火温度高点比低点好该回答共有0位秀友支持回答者dwc326一级试用期回复时光2022-05-2923:26『生物部落空间』主要设置退火温度梯度PCR有用技巧增强PCR的特异性

1.primersdesign这是最重要的一步抱负的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件a.足够长，18-24bp,以保证特异性.固然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b.GC%40%~~~~60%c.5端和中间序列要多GC,以增强稳定性d.避开3,端GCrich,最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe.避开3端的互补，否则简单造成DIMERf.避开3端的错配g.避开内部形成二级结构h.附加序列RTsite,Promotersequence加到5端，在算Tm值时不算，但在检测互补和二级结构是要加上它们

1.使用兼并引物时，要参考密码子使用表,注重生物的偏好性,不要在3端使用兼并引物,并使用较高的引物浓度luM-3uMj.最好学会使用一种designsoftware.PP5,01igo6,DNAstar,VectorNTI,Onlinedesginetal.*引物的另一个重要参数是熔解温度Tmo这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tin对于设定PCR退火温度是必须的在抱负状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以削减非特异性结合合理的退火温度从55℃到70℃o退火温度普通设定比引物的Tm低5℃设定Tm有几种公式有些是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物有些是按照GC含量估算Tm确定引物Tm最可信的办法是近邻分析法这种办法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性大部分计算机程序使用近邻分析法按照所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大由于大部分公式提供一个估算的Tm值，全部退火温度只是一个起始点能够利用分析几个逐步提升退火温度的反应以提升特异性开头低于估算的Tm5℃,以2℃为增量，逐步提升退火温度较高的退火温度会削减引物二聚体和非特异性产物的形成为得到最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值引物对的Tm差异假如超过5℃,就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出显然的错误起始假如两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提升特异性，能够在按照较高Tm设计的退火温度先举行5个循环，然后在按照较低Tm设计的退火温度举行剩余的循环这使得在较为严紧的条件下能够得到目的模板的部分拷贝

2.stabilityofprimers定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的引物产量受合成化学的效率及纯化办法的影响定制引物以干粉形式运送最好在TE重溶引物,使其终于浓度为100uMTE比去离子水好，由于水的pH常常偏酸，会引起寡核昔的水解引物的稳定性依靠于储存条件应将干粉和溶解的引物储存在-20℃以大于10uM浓度溶于TE的弓I物在-20℃能够稳定保存6个月，但在室温15℃到30℃仅能保存不到1周干粉引物能够在-20C保存至少1年，在室温15℃到30℃最多能够保存2个月

3.optimizereactantsconcentrationa.magnesiomionsMg离子的作用主要是dNTP-Mg与核酸骨架互相作用并能影响Polymerase的活性，普通的状况下Mg的浓度在

0.5-5mM之间调节，同样要记住的是在调节了dNTPs的浓度后要相应的调节Mg离子的浓度，对实时定量PCR,使用3到5nlM带有荧光探针的镁离子溶液b.其他的离子NH4+K+都会影响PCR,增强K+的浓度后，会由于中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度，从而降低了PCR的严谨性stringency,NH4+也有相同的作用.MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER,一种是加Mg的一种是已经混合了NH42S04的，固然，过高的阳离子浓度KCL

0.2M时，DNA在94度根本不会发生变性，固然也就无从谈起PCR了.c.polymerase不同公司的酉每效有所不同，需要operator自己掌控适合的酶的浓度，一些高保真没的效率要远远低于Taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也耍大一些.其它，普通的状况下，变性的温度能够使用90~92度，变性的时光也能够缩短，从而保证polymerase的活性d.template50ulPCRSYSTEMhumangDNA

0.lug-lugE.ColilOng-lOOngLamadaDNA

0.5ng-5ngPlasmidDNA

0.lng-10ng

4.termperaturea.denaturation常规是94度5分钟，GCRich的摸板是95度5分钟除了GCRich外，常规的APPLICATIONS能够将这部分时光缩短到1到2分钟，或者在CYCLE1时赋予较长的时光，而取消开头的denaturationb.annealing重点到了普通状况卜，是从55度开头.按照状况协作以Mg离子浓度举行调节.有条件的“J以做gradientper.退火的时光在30-60S,时光短一些能够获得更好的效果.由于，polymerase在annealingtemp.时也会有一些活性.所以在A.T.的时光过长，会极大的增强非特异性扩增的风险，其它,在对于一些困难户，比如从gDNA里扩增大片段，还可使用twostepPCR.

5.touchdownPCR原理很容易，但确实是一个很实用的办法举个例子，ANNEALINGTEMP.55度945min9430s6030s72Imin2cycles9430s5930s72Imin2cycles9430s5830s72Imin2cycles9430s5130s72Imin2cycles9430s5030s72Imin20cycles725min

6.hotstartPCR热启动PCR是除了好的引物设计之外，提升PCR特异性最重要的办法之一尽管TaqDNA聚合酶的最佳延长温度在72℃,聚合酶在室温仍然有活性因此，在举行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开头，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增在用于引物设计的位点由于遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表述克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效限制TaqDNA聚合酶活性的常用办法是在冰上配制PCR反应液,并将其置于预热的PCR仪这种办法容易廉价，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能彻低消退非特异性产物的扩增热启动利用抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度包括延缓加入TaqDNA聚合酶，在反应体系达到90度时，PAUSE,将温度保持在70度以上，手工加入polymerase,但这个办法过于烦琐，尤其是对高通量应用，并简单造成污染其他的热启动办法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起有无数公司提供这样的酶ampliwaxPCRGemsPerkinElmerTaqBeadHotStartPolymerasePromegaMagnesiumwaxbeadsStratagene.象手动热启动办法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用还有一种办法是使用inactiveDNAPolymerase,polymerase被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激发了

7.BoosterPCR我们知道lughumangenomicDNA大约在3X105幕个模板分子,这样的模板分子数目能够是引物与模板很好的结合.当模板的浓度过低，比如低于100个分子时，引物和模板之间就很难发生反应.引物简单自身举行反应形成二聚体.这样就有来了个boosterPCR我向来找不到合适的词来翻译这个booster.详细是这样的.开头几个cycles保持primer的低浓度，保证primer:template的molarratio在10r

108.以确保开头扩增的精确     性.然后boostePrimer的浓度到正常的水平

8.循环数和长度确定循环数的基本原理是产物可以保证你进一步分析操作的最小循环数.由于过多的循环数简单造成ERRORS和非特异性产物的堆积产物的量不够，优化的办法有

1.增强TEMPLATE

9.增强循环数如何确定循环数,有一个办法.做一个PCR体系,40循环,50ul,分离在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳的循环数另一个会影响PCR特异性的是PCRcycling时在两个温度间变化的速率rampingrate.固然是越高越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台PCR仪,也没有多少选择的余地

9.thermalcyclerPCR仪的因素我们常常简单忽略.长时光的使用后需要调节PCR仪，以保证其可以到达正确的温度.现在的PCR仪基本上都有自检功能self-diagnosis.

10.PCRadditives附加物或者说enhancer实在是多种多样.基本上包括几类，可以增强反应退火效率的化学因子，DNA结合蛋白和一些商业试剂.基本的原理不外是增强引物退火特异性,削减错配，增强产物的长度和产量.在GCRich状况中，additive能够造成配对碱基间的的不稳定，从而提升扩增的效率.而在另一种状况下,additive因为造成错配的primer-template复合物的极大的不稳定，而提升了扩增的忠实性.要注重的是,没有万能的enhancer所有通用，需要你按照自己的状况,最好结合gradientper挑选最优条件.dimethylsulfoxideDMSOupto10%formamideat5%trimethylammoniumchloride10-100uMdetergentssuchasTween

200.1-

2.5%polyethyleneglycolPEG60005-15%glycerol10-15%singlestrandedDNAbindingproteinsGene32proteinInME.colisingle-strandedDNAbindingprotein5uM7deaza-dGTPforGCrich150uMwith50uMdGTPTaqExtenderstratagenePerfectMatchPCREnhancerstratageneQ-solutionQiagen要注重的是，DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性，所以需要scouting出最适的浓度

11.TemplateDNApreparation提取DNA时的试剂会抑制PCR反应的顺当举行.因此需要对TEMPLATEDNA举行纯化.特殊是SDS«O.01%）的状况下就能剧烈抑制PCR的举行.能够加入一些nonionic试剂,如Tween,Nonid,Trition之类的反过来抑制SDS.还有proteinaseK也要除整洁，不然会降解polymerase.

12.NestedPCR容易点说设计两对引物，一对是长的，一对是包含在长引物内的，用长引物扩增的产物作为其次次扩增的模板，这样能够增强产物的量.而且能够削减非特异性带和错配的状况.增强PCR的保真性高保真酶高温DNAPOLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和一些阳离子的存在状况下，在特定的引物指导下按3-5方向合成DNA.包括3种类型a.5,-3,方向的DNA合成本事，没有3-5方向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的合成本事强,由于他不订正合成中浮现的突变b.与a类似,有合成活性,没有3-5的外切活性.但他们能以RNA为模板,合成DNA.如TthDNAPolymerasec.有DNA聚合活性,没有逆转录活性，但有3-5方向的外切酶活性.如pfuDNAPolymerase.能够提升忠实性但是这些聚合酶的产量比TaqDNA聚合酶低酶的混合物将•TaqDNA聚合酶同带有3到5外切核酸酶活性其次种聚合酶混合在一起能够得到比单独TaqDNA聚合酶高的忠实性，并能够获得高产量及扩增长模板其他因素除了酶，高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性将dNTP的浓度从200uM降低到25-50uM能够增强精确度假如四种核甘的浓度不同，忠实性会受影响举行较少的PCR循环也会有助于增强忠实性，由于增强循环数目和产物长度就会增强突变可能性

1.简介寡聚核甘酸引物的挑选，通常是囫囵扩增反应胜利的关键所选的引物序列将打算PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数好的引物设计能够避开背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板引物设计也极大的影响扩增产量若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物获得的产物量可临近于反应指数期的产量理论值固然，即使有了好