赛默飞-基于DNA测序的微生物鉴定技术介绍

基于DNA测序的微生物鉴定技术介绍技术支持黄志zhi.huang@The

worldleader

inserving

science赛默飞世尔：服务于科学的全球顶尖企业公司规模•6.5万名员工，50个国家•

年销售收入200亿美元涉及的领域•

科学研究领域•

专业应用领域旗下主要品牌•

实验室全方位供应商2ThermoFisher

微生物整体解决方案样品采集鉴定/分型样品制备增菌检测确认药敏3ThermoFisher

提供最全面的核酸检测解决方案基因芯片4基因芯片基因测序的技术进化5微生物鉴定/分型发展的三个阶段第一阶段：表型•

培养、格兰氏染色、生理生化反应、形态学、脂肪酸、核蛋白第二阶段：核酸片段长度多态性

(进入分子生物学技术时代）•

限制性片段长度多态性(RFLP)•

随机扩增的多态性DNA(RAPD)•

脉冲场凝胶电泳(PFGE)•

细菌核糖体基因分型(Ribotyping)•

扩增片段长度多态性(AFLP)•

重复序列扩增(rep-PCR)第三阶段：基因序列分析（基于测序技术，确定目标基因每个碱基的组成序列）•

靶向测序：16SRNA测序•

全基因组测序6MicroSEQ®

ID

微生物鉴定系统技术基础：基于16S核糖体RNA的基因测序的鉴定方法•

细菌命名学的新标准−

依据《伯杰氏系统细菌学手册》，采用16SrDNA序列分型•

提供更高的分类学信息•

快速准确提供鉴定结果•

客观性，重现性好•

方便不同团体、实验室间信息共享和交流DNA序列测定成为微生物鉴定的金标准8基于16S核糖体基因测序的鉴定方法——《中国药典2015》推荐9核糖体RNA的结构RNA

(核糖体RNA)细菌:DNA

(染色质/体)

真菌:16SrDNA

(E.

coli:

1541

bp)LSUrDNA10MicroSEQ

ID细菌鉴定16SrRNA

Gene5001541MicroSEQ®

500System

作为日常检测作为补充检测MicroSEQ®

FullGene

System11MicroSEQ

ID真菌鉴定●

用于酵母和真菌鉴定●

26S大亚基D2区(LSUD2)of

rRNA

Gene●

序列长度300-500bp

用于真菌鉴定12MicroSEQ

ID

系统构成Applied

Biosystems™3500

and

3500XLDNA

sequencing

instruments•

FAST

Bacterial

500

16SID

Kit•

FAST

Fungal

D2

ID

Kit•

FullGene

16SID

kit•

MicroSEQID

Software•

Validated

Bacterial

andFungal

librariesPCRThermalCycler13MicroSEQ

ID

微生物快速鉴定系统操作流程5小时完成鉴定14鉴定软件:自动获得准确的种级别微生物鉴定结果15经过验证的强大数据库•

经验证数据库•

16S

500:

2100

entries•

16S

全基因:

1262

entries•

D2(真菌):

1300

entries•

16S

增补数据库:

7000entries•

不定期更新•

新增加的菌•

最新的命名原则•

包括诸多环境分离菌的信息最大，最全面且经过验证的细菌和真菌数据库16MicroSEQ

ID鉴定技术的特点•

可以鉴定细菌和真菌•

不需要事前掌握待检微生物的信息•

无需革兰氏染色•

无需鉴定经验，判断客观•

准确•

稳定•

简单将不能或难以鉴定的微生物种类从20％

下降到2％！17MicroSEQ®

微生物鉴定系统全球顶级制药企业的共同选择！•

全球前10强:全部采用•

全球前25强:

23家采用•

全球前25强:

20家在不同子工厂中同步使用*Listof

Top

50

Pharma

fromPharmaceutical

Executive,May2017一专多能的仪器平台毛细管电泳仪器平台MicroSEQ®ID序列测定AFLP/MLVA片段分析菌种鉴定溯源分型19菌株分型的分子平台•

测序检测•

MLST•

片段分析•

AFLP•

MLVA20Ion半导体测序技术原理123dNTPH+∆QAdddNTPsthat

buildthe

DNA

sequenceIons

get

released

whenDNA

bases

are

matchedSequence

output

isgeneratedby

the

detection

system

芯片上存在上百万个微小测序孔

每个测序孔中含有一个微珠，微珠上联接了待测序的模板DNA片段

测序开始时，依次掺入碱基，随着每个碱基的掺入，释放出氢离子并检测21赛默飞最新型高通量测序平台：Ion

GeneStudio

S5

系列Ion

GeneStudio™

S5Ion

GeneStudio™

S5PlusIon

GeneStudio™

S5PrimeNewNewFast.Flexible.Powerful.NewIon510™

Chip2–3

M

readsUp

to

400

bpIon520™

Chip3–6

M

readsUp

to

600

bpIon530™

Chip15–20

M

readsUp

to

600

bpIon540™

Chip

Ion550™

Chip60–80

M

reads

100–130M

readsUp

to

200

bpUp

to

200

bp22更长读长：600bpIsothermalAmplificationIon

Chef

SystemIon

520

Chip3.1MReadsIon

530

Chip15.0MReadsThecontent

providedhereinmay

relate

to

products

that

havenot

been

officiallyreleasedandissubject

to

change

without

notice23完整而快速的高通量测序方案让未知微生物无处遁形Ampliconclean-upandlibraryReversetranscriptionandPCRRNAextractionPreparetemplateRunsequenceAnalyzedataconstruction1hour4hours3hours5–11

hours2.5hours5hoursMagMAX™-96Viral

RNAIsolationKitPathAmpFluReagentsIon

Xpress™

PlusFragmentIon

ChefSystemorIon

OneTouch™2SystemIon

S5SystemorIon

PGMSystemTorrentSuite™Software,PathogenDetector

pluginLibrary

Kit48小时内完成从样本到微生物全基因组测序的工作24宏基因组复杂的样本，混合的微生物，包括食品、呕吐物、粪便、土壤等25Ion

16S

Metagenomics

Kit:

Primer

SetsPrimer

Sets•

Set

V2-4-8•

Set

V3-6,7-916SgeneV1V5V7V8V9V2V3V4V620080010001400

154214006001200.

Stringent

Bioinformatic

Assay

Design:

Analyses

against

the

entire

GreenGenes

database

as

wellas

the

26Kspecies

of

primary

metagenomic

interest..

BroadCoverage

Primer

Sets:

Addresses

multiple

groups

of

organisms

using

amulti-ampliconapproach

(amplicon

sizes

200-300bp

range).

Maximum

Read

Length:Uses400bp

sequencing

chemistry26两种测序方案互为补充Ion16S

Metagenomics

KitonIon

S5/S5XL

SystemsApplied

Biosy