课件-维生素类药物分析

第十三章维生素类药物的分析1维生素：是维持养物质，

不能正常代谢机能所必需的微量营维生素。各种维生素的化学结构以及性质虽然不同，但它们却有着以下共同点：①维生素大多以维生素原（维生素前体）的形式存在于食物中。7-脱氢胆固醇β-胡萝卜素维生素A代谢维生素D3代谢2②维生素不是构成机体组织和细胞的组成成分，它也不会产生能量，它的作用主要是参与机体代谢的调节。③大多数的维生素，机体不能或量不足，不能满足机体的需要，必须经常通过食物中获得。④

对维生素的需要量很小，日需要量常以毫克（mg）或微克（μg）计算，但一旦缺乏就会引发相应的维生素缺乏症，对

健康造成损害。3脂溶性

维生素A、D2、D3、

E、K1

等水溶性

维生素B族（B1、B2、B6、B12）维生素C、叶酸、烟酸、烟酰胺、泛酸维生素M维生素PP维生素分类（按溶解性分）：4维生素A醇维生素A醋酸酯维生素A棕榈酸酯第一节维生素A的分析一、结构与性质（一）结构环己烯R:

-H-COCH3-COC15H31共轭多烯醇侧链51.溶解性不溶于水，乙醇中微溶，与三氯甲烷、乙醚、环己烷和石油醚任意互溶（二）性质（二）性质1.具有共轭多烯侧链存在多种

异构化合物维生素A325.5新维生素Aa328新维生素Ab320.5新维生素Ac310.5异维生素Aa323异维生素Ab3248具有UV吸收特性：在325～328nm间有最大吸收max易发生脱氢、脱水、聚合反应去氢维生素A（A2）去水维生素A（A3）鲸醇9易被氧化

环氧化物维生素A醛维生素A酸紫外线、O2、氧化剂维生素A

△或有金属离子存在时氧化↑103.与三氯化锑发生呈色反应三氯甲烷中11蓝色紫红CHCl3维生素A

SbCl

3三氯化锑反应UVTLC12二、鉴别试验（一）三氯化锑反应（Carr-Price反应）条件：无水、无醇-RCOOSbCl5+CH2蓝色紫红+CH2-RCOOSbCl5维生素ASbCl513方法

取维生素A油溶液1滴，加氯仿10ml，振摇溶解，取出两滴，加氯仿2ml，与25%三氯化锑氯仿溶液0.5ml反应，成蓝色，14渐成紫红色。15VitA

无水乙醇

HCl

去水VitA5个共轭双键λmax为326nm一个吸收峰（二）UV法6个共轭双键λmax为350～390nm三个吸收峰，且在332nm的波长处有较低的吸收峰或拐点。△溶剂：无水乙醇-盐酸（100:1）C

H2（三）TLC法

对照品法16BP

显色剂

三氯化锑USP

显色剂

磷钼酸规定斑点颜色和Rf值紫外分光光度法三氯化锑比色法HPLC法17三、含量测定（一）UV法（三点校

）测定依据：维生素A分子结构中多烯共轭体系，具有紫外吸收特性，在325-328nm处有最大吸收。异构体（新维生素Aa、Ab和Ac，异维生素

Aa和Ab ）、氧化产物（环氧化物、维生素A醛和维生素A酸）、光照产物（鲸醇）、

、去氢维生素A、去水维生素A等杂质会有紫外吸收，干扰维生素A在紫外区的测定。为了得到准确的测定结果，消除非维生素A产生的无关吸收所引

起的误差，故采用“三点校

”测定。18杂质的吸收在310～340nm波长范围内呈一条直线，随波长的增大而吸收度变小。物质对光的吸收具有加和性。191.测定原理杂质维生素A纯品维生素A样品（三）生物效价及换算因数维生素A含量是用生物效价表示单位

IU/g（国际单位）211IU

0.344g全反式维生素A醋酸酯1IU

0.300g全反式维生素A醇1g维生素A醋酸酯相当的国际单位数为

290700（0

IU）1g0.344g1g维生素醇相当的国际单位数为

333000（0

IU）221g0.300g标

样

1cm标

1cm

样E

1%E

1%含量（IU

g

）含量（IU

g

）含量样（IU

g

）02000

19000233 000

18(VitA酯)(VitA醇)2.波长的选择24三点波长的选择原则为：一点选择在维生素A的最大吸收波长处（即1）维生素A的max2

3分别在1的两侧各选一点测定对象：纯度高的维生素A醋酸酯25第一法

等波长差法3-1=1-21=328nm2=316nm

3=340nm△=12nmA

32

8

校正

3

.

52

2

A

328

A

316

A

340

第二法 等吸收度法(皂化法)测定对象：维生素A醇32621

A

A6

A71=325nm2=310nm

3=334nm

2

.

555

A

310

4

.

260

A

334A

32

5

校正

6

.

815

A

3253.测定方法和计算方法27第一法：直接测定法——纯度高的维生素A醋酸酯方法：S

环己烷

9～15IU

/

ml溶液

分别于300、316、328、340、360nm处测Aimax

是否在326～329nm之间判断

改用第二法28是否求算并与规定值比较A

i

/

A

3

2

80A340

0.811

A328A360

0.299

A328A328

1.000

A328A316

0.907

A328A300

0.555

A328规定值

差值29Ai

/

A328判断差值是否超过

0

.

0

2有一个以上超过

0

.

0

2无超过

0

.

0

2计算A328（校正）30用A328计算31

100%A328

A328A32

8(校正)f

3

.

52

2

A

A

A

328

316

340A

32

8

校正

03%－15%－3%第二法A32

8校正A328第二法（2）第二法：皂化法——维生素A醇的测定32除去植物油的干扰

异丙醇溶解乙醚提取

挥干乙醚

稀释至9～15IUm/l

于300、310、235、334nm处测Ai皂化液植物油

甘油和脂肪酸盐VitA醋酸酯

VitA醇

S

K

OH/乙醇水溶性脂溶性第一法无法消除杂质干扰时用此法判断max是否在323～327nm之间取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定计算A32533A300是否判断A300

/A325

是否小于或等于0.73是34否取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定计算A325(校正)35

100%A325

A325A32

5(校正)f

6

.

815

A

325

2

.

555

A

310

4

.

260

A

334A

32

5

校正

03%－3%A32

5校正A325A32

5校正（二）HPLC法36适用于维生素A醋酸酯原料及其制剂中维生素A的含量测定色谱条件：

固定相：硅胶流动相：正己烷-异丙醇（997:3）流速：1ml/min检测波长：325nm系统适应性试验：维生素A醋酸酯主峰与其顺式异构体峰的分离度应大于3.0（三）三氯化锑比色法37原理：维生素A与三氯化锑的无水氯仿溶液作用，产生不稳定的蓝色，在618nm~620nm波长处有最大吸收，符合Beer定律。方法：取维生素A对照品，制成系列浓度的氯

仿溶液，加入一定量的三氯化锑无水氯仿溶液，在5s～10s内，于620nm波长处测定吸收度，绘制标准曲线。按同法测定供试液的吸收度，根据标准曲线计算含量。3.

注意事项：①呈色不稳定，要求操作迅速，一般规定加入三氯化锑后应在5s~10s内测定。②水分干扰测定，三氯化锑水解产生SbOCl而使溶液浑浊，影响比色。③温度影响较大，样品测定时的温度与绘制标准曲线温差≤1℃。④专属性差，常使测定结果偏高。⑤三氯化锑有腐蚀性。3839维生素ACH33CH3CHCH2OHCH3CH3脱氢——去氢维生素A氧化——环氧化物异构体UV——鉴别和含量测定与三氯化锑呈色——鉴别和含量测定脱水——去水维生素A氧化——维生素A醛、酸第二节维生素B1的分析40广泛存在于米糠、麦麸和酵母中。具有维持糖代谢及神经传导与消化的功能，主要用于治疗脚气病、多发性神经炎和胃肠道疾病。一、结构及性质N(一)结构CH3NCH2

CH3盐酸硫胺氨基嘧啶环－CH2－噻唑环（季铵碱）41（二）性质溶解性维生素B1为白色结晶或结晶性粉末，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。水溶液呈酸性。硫色素反应噻唑环在碱性介质中开环，再与嘧啶环上的氨基环合，经铁

化钾等氧化剂氧化成具有荧光的硫色素。维生素B1

OH

O

硫色素

正丁醇

蓝色荧光UV共轭λmax=246nm424.碱性与酸成盐与生物碱沉淀试剂（碘化钾、酚、碘溶液、硅钨酸等）反应，生成组成恒定的沉淀，可用于鉴别和含量测定。5.盐酸根呈氯化物的特性反应，用于鉴别嘧啶环——伯氨噻唑环——季铵43二、鉴别试验（一）硫色素反应——维生素B1的专属反应荧光化钾

硫色素OH

1维生素B

铁蓝色荧光正丁醇H+OH-44

环合45NH3C

N

NH2HClNCH3S

C2H4OHCH2NaOHCH2NH3C

N

NH2CH3NNaS2

4C

H

OHO-H2ONH3C N NNCH3NaS

C2H4OHCH32

4N3H

CNN

N

S C

H

OHH[O]-2HNNCH3H3C N N S

C2H4OH硫色素46方法

取本品约5mg，加氢氧化钠2.5ml，加铁

化钠试液0.5ml与正丁醇5ml,强烈振摇2min,放置分层，上面醇层显强烈蓝色荧光。加酸

，再加碱又重现。（二）沉淀反应维生素B1具有嘧啶环和氨基，显生物碱特征，可与生物碱沉淀或显色剂反应。K2HgI4

淡黄[B]

H2HgI4

I2

KI

红色[B]

HI

I2

硅钨酸

白色[B]2

SiO2

OH

2

12WO3

4

H2O苦酮酸

白色扇形47

蓝

KI

淀粉试纸MnOCl

H（三）氯化物反应AgNO

AgCl48白NH

HO

HNO3HNO3

PbS

49

NaS

VitB

PbNO

NaOH231（四）硫元素反应（五）IR本品的红外光谱图应与对照图谱一致三、含量测定50非水溶液滴定法——原料药UV法——制剂硫色素荧光法——USP51（一）非水溶液滴定法原理：维生素B1分子含有2个碱性的已成盐的伯胺和季铵基团，在非水溶液中均与HClO4作用，根据消耗HClO4的量可以计算维生素B1的含量。B

Cl

HCl

HClO

Hg

（Ac）

B

ClO

HClO

反应摩尔比1:2W

%V样

V空

T

F含量%T

c

M

0.1

337.27n

2

16.86mg

/

ml

N

NH2CH3SCH2CH2OHN

NCH2

CH3Cl-HCl52（二）UV法共轭双键结构，UV特征紫外吸收峰随PH变化而变化溶剂水pH7λmax232-3E1%1cm345盐酸2246421ChP

片剂、注射剂含量计算（每片）相当于标示量的%=E1%A

稀释倍数

平均片重100%100

W

标示量1cm规格g铁

化钾异丁醇荧光硫色素VitB

NaOH原理激发波长365nm发射波长435nm通过与对照品荧光强度的比较即可测得供试品含量（三）硫色素荧光法可用于维生素B1及其制剂的含量测定54SdAb1

100%VitB

%

A

bS

d

W样

稀释度W对

稀释度+

NaOH

+

铁

化钾

+

异丁醇对照液+NaOH+异丁醇+

NaOH

+

铁

化钾

+

异丁醇+NaOH+异丁醇供试液计算55特点56专属性反应灵敏度高，线性范围宽代谢产物不干扰，适用于体液分析可用CNBr为氧化剂，反应定量完全，适合于生物样本分析。NCH3CH2NCH357维生素B1嘧啶环与生物碱沉淀剂或显色剂反应——鉴别UV——鉴别和含量测定氨基碱性——和酸成盐非水滴定——含量测定噻唑环季铵碱——和酸成盐，含量测定硫色素反应——鉴别和含量测定硫元素反应——鉴别盐酸盐——鉴别58632OHHO1

OOHOH

CCH2OHL－抗坏血酸第三节维生素C的分析γ-内酯*

5*

4一、结构及性质(一)结构烯二醇结构(二)性质1.溶解性维生素C易溶于水，微溶于乙醇，不溶于三氯甲烷和乙醚。2.酸性654321OHHOOH

C

OHOCH2OHC3－OH的酸性较强pK1=4.17，59C2－OH的酸性较弱pK=11.57。2故表现为一元酸的性质，能与碳酸氢钠成钠盐。3.旋光性维生素C有2个手性碳原子，有4个光学异构体。4.还原性维生素C中的烯二醇基具有强还原性，易被氧化为二酮基而成为去氢抗坏血酸。烯二醇结构OHOHC

CO

O二酮基结构CC[o]

-2H+2H60OOCH2OHH

C

OHOOCH2OHCHHOCHOHC

OCOCOONa

H有生物活性无生物活性CH2OHH

C

OHOOHO

OHL－抗坏血酸去氢抗坏血酸二酮古洛糖酸[O]H+OH-6125.水解性维生素C中的内酯环在强碱中可水解，生成酮酸盐。CH2OHH

C

OHOOHO

OHNa2CO3OHCH2OHH

C

OHOONaONaOHCOONaOCCHOHC

OHOCH2OHCH6.糖类的性质维生素C结构与糖类相似，有糖类的显色反应。7.UV65432OHHO1

OOHOH

CCH2OH具有共轭双键，其稀HCl溶液在243nm处有最大吸收。63在中性或碱性条件下，红移至265nm。二、鉴别试验（一）与氧化剂反应CH2OHH

C

OHO

OHO

OHOOCH2OHH

C

OHO

O

[O]

641.与AgNO3反应维生素C中有烯二醇基，具有强还原性，可被AgNO3氧化，产生黑色金属银沉淀。方法：取本品0.2g，加水l0ml溶解。取该溶液5m1，加硝酸银试液0.5m1，即生成银的黑色沉淀。652.与2,6-二氯靛酚反应2，6

二氯靛酚V

itC

无色氧化型玫瑰红色H

还原型蓝色OHˉNClHOClOClHOClOHHN（玫瑰色）

（无色）方法：取本品0.2

g，加水l0ml溶解。取该溶液5m1，加2,6-二氯靛酚试液1～2滴，试液的颜色即。663.与其他氧化剂反应亚甲蓝或高锰酸钾维生素C褪色碱性酒石酸铜维生素C砖红色Cu2O沉淀磷钼酸维生素C67钼蓝K

M

n

O

V

itC

M

n

（三）糖类的反应VitC

三氯醋酸

戊糖脱水

糠醛或盐酸50℃

吡咯蓝色（二）薄层色谱法ChP2010采用TLC对维生素C制剂进行鉴别6869O

OCH2OHH

C

OHHOOHO

OCH2OHH

C

OHHHOOC

COHO

OCHOH

3CH2OHH2O-CO2OCHOH

3CH2OHH

C（戊糖）-3H2OO

CHO(糠醛)CHNO（蓝色）NNH50℃(吡咯)（四）UV维生素C在0.0lmol/L盐酸液中，在243nm波长处有惟一的最大吸收，利用此特征进行鉴别。BP中采用该法，并规定其百分吸收系数应为545-585。Absorption0.60.50.40.30.20.10.020070220280300240

260Wavelength

(nm)243nm三、杂质检查71（一）溶液的澄清度与颜色检查：——有色杂质，分光光度法（二）铁、铜离子：原子吸收分光光度法（三）草酸的检查：与钙形成沉淀四、含量测定（一）碘量法1.原理：维生素C在醋酸酸性条件下，可被碘定量氧化。根据消耗碘的体积，可以计算维生素C的含量。V

it

C

I

H

2去氢抗坏血酸

2

I淀粉指示液，终点至蓝色不反应摩尔比1∶1722.方法：取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指

示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定

液(0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6。733.酸性环境——减慢VitC被O2氧化速度新沸冷H2O——赶走水中O2立即滴定——减少O2的干扰74（4）附加剂干扰的排除片剂——滑石粉——过滤注射剂——抗氧剂——Na2SO3Na2S2O3NaHSO3Na2S2O575（二）2,6-二氯靛酚滴定法1.原理自身指示终点法

蓝色

玫瑰红OHH

还原

无色空白76样品V样V空

H

PO3

H

Ac

二氯靛酚液终点：显示过量的2,6-二氯靛酚的颜色（粉红色）2.方法二氯靛酚V

itC

测A（定量过量）（测剩余

）3.酸性环境

HPO3-HAc——稳定VitC快速滴定

2min内——防止其他还原性物质干扰滴定液需经常标定——2,6-二氯靛酚不稳定，

≤一周剩余比色测定78（三）HPLC法79632OHHO1

OOHOH

CCH2OH维生素C烯二醇基酸性——可与碱成盐与硝酸银反应——鉴别与二氯靛酚钠反应——鉴别和含量测定碘量法——含量测定共轭双键——UV，鉴别酯键——水解糖的性质——鉴别旋光性*

4*

5HPLC——含量测定80第四节维生素D的分析维生素D是一类抗佝偻病维生素的总称。ChP2010主要收载有：维生素D2、D3原料药，维生素D2胶丸和注射剂，维生素D3注射剂等。81一、结构及性质(一)结构维生素D2（9,10-开环麦角甾-四烯-3β-醇）（骨化醇）HOHHCH2CH3HHCH3CH3CH3维生素D3（9,10-开环胆甾-三烯-3β-醇）（胆骨化醇）开环的甾体：具有甾类化合物的显色反应。1234

5687109(二)性质性状维生素D2、D3均为无色针状结晶或白色结晶性粉末；无臭，无味。溶解性维生素D2、D3不溶于水，溶于三氯甲烷、乙醇、乙醚和

。不稳定性维生素D2、D3含多个双键，不稳定，遇光或空气及其他氧化剂易氧化变质。旋光性

维生素D2有6个手性碳原子维生素D3有5个手性碳原子显色反应甾醇类化合物共有UV

共轭多烯82二、鉴别试验（一）显色反应醋酐—硫酸反应D2

黄

红

紫

绿D3

黄

红

紫、蓝三氯化锑反应三氯化铁反应83橙红色渐变粉红橙黄色二氯丙醇和乙酰氯反应

绿色（二）比旋度鉴别84溶

剂浓

度比旋度值维生素D2无水乙醇

40mg/+102.m5°l

～+107.5°注意事项：应于容器开启30分钟内取样在溶液配制后30分钟内测定维生素D3无水乙醇

5mg/+10m5°l

～+112°（三）区别反应以96%乙醇为溶剂，D2显红色，在570nm处有最大吸收加乙醇和85%硫酸D3显黄色，在495nm处有最大吸收（四）其他方法TLC、HPLC、衍生物测85三、杂质检查86维生素D2中麦角甾醇的检查：加洋地黄皂苷溶液，混合，放置18h不得发生浑浊或沉淀。前维生素D的光照产物四、含量测定方法USP：化学法、色谱法和微生物法BP：化学法、色谱法和光谱法ChP：采用正相高效液相色谱法测定维生素D的含量，定量方法为内标法。内标物：邻苯二甲酸二甲酯固定相：硅胶流动相：正己烷-正戊醇（997：3）8788第五节维生素E的分析维生素E是α-

酚及其各种酯类。一、结构及性质(一)结构苯并二氢吡喃醇OHOα-酚12345678α-酚醋酸酯89（二）性质游离酚[O]溶解性维生素E为微黄色或黄色透明的粘稠液体，易溶于乙醇、 和乙醚等 ，不溶于水。水解性H+或OH-Δ氧化性醌904.UV特征芳环其无水乙醇溶液在284nm处有最大吸收，吸收系数为41.0-45.0。（一）硝酸反应二、鉴别试验OC16H33OOHNO3水解OC

H16

33HO维生素Eα-酚HNO375℃，[O]OC16H33OO红91方法：取本品30mg，加无水乙醇l0ml溶解后，加硝酸2ml，摇匀，在75℃。加热约15分钟，溶液应显橙红色。本法简便、快速，呈色反应明显。ChP2010和JP15均采用本法鉴别。（二）三氯化铁反应OC16H33OOKOHΔOC16H33HO维生素Eα-酚Fe3+OC16H33OOH对-醌Fe2+

+NN红色92方法：取本品10mg，加乙醇KOH试液2ml，煮沸5分钟，放冷，加水4ml和乙醚10ml，振摇，静置分层；取乙醚液2ml，加2,2’-联吡啶的乙醇溶液数滴和FeCl3的乙醇溶液数滴，应显血红色。93=

41.0～45.5E1%1cm0.01%无水乙醇溶液λmax

=

284nmλmin

=

254nm（三）UV法94薄层板展开剂显色剂

VitE95硅胶G环己烷-乙醚（4

：1）硫酸（105℃

5′）Rf

=0.7（四）TLC法（五）GC、IR三、杂质检查酚、有关物ChP规定本品须检查酸度、游离质和残留溶剂。（一）酸度目的：检查维生素E

过程中引入的游离醋酸。方法：以NaOH滴定液（0.1mol/L）滴定。96（二）

酚铈量法检查游离

酚1.原理

利用游离

酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈反应摩尔比1:2试剂：硫酸铈滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黄→灰紫）OC16H33HOOC16H33OOH+2Ce4+97+

2Ce3+2.方法取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用0.01mol/L硫酸铈液滴定，消耗硫酸铈液≤1.0ml。98（三）有关物质方法取本品，用正己烷稀释成每1ml含2.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用正己烷稀释成1ml含25μg的溶液，作为对照溶液。用气相色谱测定。限量α-

酚的峰面积不得大于对照溶液主峰面积

(1.0%)其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍(1.5%)各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2.5倍(2.5%)99（四）残留溶剂（正己烷）100方法取本品，用二甲基甲酰胺稀释成每1ml含50mg的溶液，作为供试品溶液；另取正己烷，加二甲基甲酰胺稀释成1ml含10μg的溶液，作为对照品溶液。照残留溶剂测定法（毛细管柱顶空进样等温法）试验，含正己烷应符合规定。四、含量测定101硫酸铈直接滴定法比色法GCHPLC荧光分光光度法（一）GC法ChP收载的维生素E原料药及其制剂均采用本法测定特点选择性好灵敏度高速度快分离效能好102内标法加校正因子载气：氮气固定相：硅酮（OV—17）检测器：