当酶标半抗原与抗体结合后课件

第五课酶免疫技术；胶体金技术

临床免疫实验室张君龙

2018第五课酶免疫技术；胶体金技术临床免疫实验室张君龙

2第五课（第一部分）

酶免疫技术酶免疫技术特点ELISA的原理和类型ELISA的技术要点第五课（第一部分）

酶免疫技术酶免疫技术特点以酶标记抗体或抗原作为主要试剂，利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体免疫学反应检测的敏感性的一种标记分析技术，称为酶免疫技术（enzymeimmunoassay，EIA）

一、酶免疫技术的定义和特点以酶标记抗体或抗原作为主要试剂，利用酶催化底物酶免疫技术一般由两部分组成：1.抗原+抗体IC（酶标抗原或抗体参与）2.底物显色色泽程度与IC中的酶活性及数量相关，颜色深浅可确定待测抗原或抗体存在或含量特点:

免疫反应的高特异性酶(专一性)催化反应的高效性及高灵敏度抗体或抗原上的酶酶免疫技术一般由两部分组成：特点:抗体或抗原上的酶酶免疫组化技术酶免疫测定技术二、酶免疫技术的分类均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定(ELISA)液相酶免疫测定酶免疫组化技术二、酶免疫技术的分类均相酶免疫测定非均相酶免疫

均相酶免疫分析又叫勿需分离的酶免疫分析，酶标抗原与抗体结合后，其中的酶活性将被减弱或增强，因此不需分离即可测定反应系统中酶活性的变化，从而推算出待测物的含量。1、均相酶免疫分析技术均相酶免疫分析又叫勿需分离的酶免疫分析，酶标本抗原酶增强免疫测定技术示意图（EMIT）EMIT的基本原理及特点：半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制（图A）。从酶活性的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。标本抗原浓度与显色程度成正比。标本抗原酶增强免疫测定技术示意图（EMIT）EMIT的基本原应用：主要用于检测小分子激素和半抗原（如：药物）应用：主要用于检测小分子激素和半抗原（如：药物）

异相酶免疫分析要求，酶标抗原与抗体结合后，需采用适当的方法分离游离的和抗原（或抗体）结合复合物-酶标记物，测定底物显色程度，从而推算出待测物的含量。2、异相酶免疫分析技术异相液相酶免疫分析固相酶免疫分析——ELISA异相酶免疫分析要求，酶标抗原与抗体结合后，以检测抗原为例：3、ELISA的原理和类型（一）ELISA的基本原理E酶标抗体固相抗体固相载体待测抗原ELISA:enzyme-linkedimmunosorbentassay(酶联免疫吸附试验)以检测抗原为例：3、ELISA的原理和类型（一）ELISA1.间接法1.双抗体夹心法2.双位点一步法3.竞争法2.双抗原夹心法（二）方法类型检测抗原的方法检测抗体的方法3.竞争法1.间接法1.双抗体夹心法2.双位点一步法3.竞争法

顾名思义，由两个抗体夹一个抗原形成“三明治”复合物，来检测抗原的方法，仅适合于至少含两个抗原决定簇的多价抗原检测。1.双抗体夹心法检测抗原的方法E酶标抗体固相抗体固相载体待测抗原顾名思义，由两个抗体夹一个抗原形成“三明治”1.抗体（检测抗原）2.加样本、孵育、洗涤3.加酶结合物、孵育、洗涤4.加底物液、终止液、比色EE检测抗原EE1.抗体（检测抗原）2.加样本、孵育、洗涤3.加酶结合物、

Colorless

阴性阳性OD浓度底物液、终止液Colorless阴应用：

如：乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、细胞因子、肿瘤标志物AFP、CEA等的测定应用：如：乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、细胞因子、肿瘤标志物

在双抗体夹心法的基础上发展而来，所检测抗原有两个不同的抗原决定簇，两种针对不同抗原决定簇的单克隆抗体可同时和抗原反应，生成夹心式“三明治”复合物。2.双位点一步法在双抗体夹心法的基础上发展而来，所检测抗原有双位点一步法测抗原示意图

双位点一步法测抗原示意图钩状效应（hookeffect）

当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量，严重时甚至可出现假阴性结果。（类似于沉淀反应中抗原过剩的后带现象）应用如：乙型肝炎表面抗原的检测（HBsAg）钩状效应（hookeffect）当标本中测定抗原：受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。3.竞争法AgE+AbAgEAbAgAbAg+测定抗原：受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固

竞争法示意图

竞争法示意图

所谓间接法是指利用酶标记的抗抗体（即二抗）来检测与固相抗原结合的抗体。1.间接法测抗体检测抗体的方法所谓间接法是指利用酶标记的抗抗体（即二抗）来间接法检测抗体示意图1.Antigencoating2.Sample(humanantibody)3.Anti-(human)Ig-enzyme

EEE4.Substrate5.Stopsolution间接法检测抗体示意图1.Antigencoating2.国际通用的标准板形是8X12的96孔式附：国际通用的标准板形是8X12的96孔式附：酶标仪图附：酶标仪图附：OD值[antibody]吸光度与抗体浓度标准曲线OD值[antibody]吸光度与抗体浓度标准曲线

只要更换不同的固相抗原，用一种酶标抗抗体就可检测出各种相应的抗体。优点应用

人体内多种自身抗体检测，如：抗CCP抗体、抗心磷脂抗体等只要更换不同的固相抗原，用一种酶标抗抗体就可检2.竞争法抗体的检测一般不采用竞争法。抗体的竞争法测定不同于单个抗原决定簇的小分子抗原的竞争法。测定可靠性受竞争抗体的特异性和亲和力影响。亲和力的差异易造成部分无法解释的结果。2.竞争法抗体的检测一般不采用竞争法。E酶标Ab待测AbHBeAb竞争法（传统）固相Ag固相Ab待测Ab中和AgE酶标Ab中和AgE酶标Ab显色强弱与待测含量呈反比HBeAb竞争法（改良）E酶标Ab待测AbHBeAb竞争法（传统）固相Ag固相Ab待4.捕获法测IgM抗体血清中某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定捕获法：先将所有血清IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，再测定特异性IgM。

4.捕获法测IgM抗体血清中某些抗原的特异性IgM常和特捕获法测IgM抗体示意图

应用：如：检测乙肝IgM型抗体捕获法测IgM抗体实际上夹心法的两次运用RF的干扰捕获法测IgM抗体示意图应用：如：检测乙肝IgM型抗体捕获亲合素：Avidin生物素：Biotin6.BAS-ELISA（参见相关章节）1个亲合素可以和4个生物素分子亲密结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，一经结合就极为稳定。把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。System生物素亲合素-ELISA亲合素：Avidin6.BAS-ELISA（参见相关章节）BAS-ELISA法示意图

待检标本BAS-ELISA法示意图待检标本应用

由于BAS-ELISA法的放大作用，可对体内含量极微的物质进行检测，例如：细胞因子、粘附分子等的检测。应用由于BAS-ELISA法的放大作用，可对不同试剂生产厂家，测定同一种物质而设计ELISA方法可有所不同，但都是在以上几种经典方法的衍化和变通。不同试剂生产厂家，测定同一种物质而设计ELISAELISA技术要点包括三个方面：三、ELISA

的技术要点

试剂制备反应条件的选择操作的标准化ELISA技术要点包括三个方面：三、ELISA的技术要点（2）固相载体选择（1）抗原和抗体的选择（5）终止液（4）底物（3）酶的选择及标记过程1.试剂制备（2）固相载体选择（1）抗原和抗体的选择（5）终止液（4）底（1）抗原和抗体★酶标记抗体或抗原也称为结合物(conjugate)要求：抗原纯度高、抗原性完整抗体特异性好,效价高,亲和力强,比活性高用于ELISA的抗体有多克隆和单克隆，效果为：Fab段>单克隆>多克隆（1）抗原和抗体★酶标记抗体或抗原也称为结合物(conjug(２)固相载体★对固相载体的要求最常用固相载体(２)固相载体★对固相载体的要求最常用固相载体

①

结合抗体或抗原量大②

抗体或抗原固定后洗涤不易脱落③

不影响其免疫活性④抗体Fc段固定于载体,结合位点朝外对固相载体的要求①

结合抗体或抗原量大对固相载体的要求ELISA最常用载体：聚苯乙烯膜载体:硝酸纤维素膜聚苯乙烯优点：

①较强吸附蛋白质的性能②抗体或抗原能保留免疫活性③聚苯乙烯可制成各种形状缺点：

包被液pH在9.0左右为宜，小于6.0时非特异性吸附增多。

ELISA最常用载体：聚苯乙烯抗原或抗体固相化包被(coating)：将抗原或抗体固相化的过程

封闭(blocking)：用1%~5%牛血清白蛋白或5%~20%小牛血清再包被一次，可减小或消除本底包被板的保存：

4℃、干燥、密封抗原或抗体固相化包被(coating)：将抗原或抗体固相化的★（3）酶的选择酶的主要要求常用的酶及其底物★（3）酶的选择酶的主要要求常用的酶及其底物用于标记的酶应符合以下条件：酶催化效率高具有可与抗原或抗体共价结合的基团标记后酶不影响抗原抗体的免疫反应性标记后酶不影响酶催化活性抗原抗体反应的最适pH时，酶的活性稳定酶对人体无害，价廉易得用于标记的酶应符合以下条件：酶活性：指1min将1μmol底物转化为产物所需的酶量常用酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）HRP的特点：1）分子量小，标记后较稳定2）pH稳定范围宽，3.2~12都能催化反应3）水溶解度好，可配制较高的酶结合物浓度AP的特点：高纯制品难得,稳定性及酶标记物收率低,价格较高酶活性：

戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和抗体蛋白分子中的氨基反应形成结合物，将两个分子以五碳桥连接起来。

改良过碘酸钠法

HRP中的多糖羟基被氧化成活泼的醛基，后者即可与抗体蛋白中的游离氨基形成Schiff碱而交联，再经硼氢化钠还原终止反应，即得到稳定的酶标结合物。制备抗体酶结合物用方法：戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分①无色、无味、无毒、性质稳定②呈色产物的量在一定范围内与酶的浓度或活性成正比③至少应有一种能终止酶反应的试剂④光照不影响底物和产物的稳定性⑤价廉易得

（4）对底物的要求★①无色、无味、无毒、性质稳定

（4）对底物的要求★常用酶及其底物辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）作用底物邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）颜色橙黄色黄色黄色最大吸收峰492nm450nm405nm特点OPD稳定性差，需新鲜配制，需避光，有致癌性TMB稳定性好，不需避光，无致突变作用，水溶性稍差AP高纯制品难得，稳定性及酶标记物收率低，价格较高常用酶及其底物辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）作用（5）终止液

常为浓酸或浓碱★（5）终止液★建立某一ELISA测定，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，选择阳性结果吸光度值在1.0左右，阴性结果小于0.2的最高稀释度为合适浓度。2.反应条件的选择建立某一ELISA测定，应对包被抗原或抗体的浓3.测定方法的标准化试剂盒的标准化生产由厂家在生产试剂盒时进行测试完成检测的标准化由工作人员进行，应力求各个操作步骤的标准化3.测定方法的标准化(a)加样(b)pH值(c)温度(d)孵育时间(e)洗涤(f)比色标准化操作程序（SOP）ELISA全自动化检测仪(a)加样(b)pH值(c)温度(d)孵育时间(e)洗涤(f

酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，它的最小检测限为ng甚至pg水平。四、酶免疫测定的应用酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，它的最1．将Fab’或F(ab’)2片段与固相载体交联，提高测定的特异性。2．过量抗体的非竞争法将逐步取代限量抗体的竞争法，前者的灵敏度和可测范围至少可比后者大6-10倍。3．随着酶免疫技术与放大系统及自动化原理相结合，使酶免疫分析检测更敏感、更特异、更客观、更准确。五、发展趋势1．将Fab’或F(ab’)2片段与固相载体交联，提高测定的小结酶免疫技术定义酶免疫技术的分类ELISA的原理和类型ELISA的技术要点膜载体的酶免疫测定酶免疫测定的应用主要内容小结酶免疫技术定义主要内容固相膜免疫分析技术

(solidphasemembrane-basedimmunoassay)是以微孔膜作为固相载体，利用液体可以流过微孔膜，也可以通过毛细管作用在膜上向前移行的特性，以酶或各种有色微粒子（如彩色胶乳、胶体金、胶体硒等）标记抗体或抗原，通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的检验方法。

胶体金免疫技术斑点酶免疫吸附试验免疫印迹试验第五课（第二部分）胶体金技术

固相膜免疫分析技术

(solidphasemembran胶体金免疫技术

胶体金标记+抗原抗体反应免疫电镜技术光镜染色技术蛋白质染色技术流式细胞术斑点免疫金渗滤试验斑点免疫金层析试验（colloidalgoldimmunoassay）胶体金免疫技术胶体金标记+抗原抗体反应免疫电镜技一、胶体金与免疫金的制备胶体特性：胶体金（colloidalgold）

金溶胶，是金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液。1~100nm大小稳定均匀单一分散状

对电解质敏感胶体金的特性：呈色性和光吸收性：胶体金颗粒大小(nm)呈色吸收峰波长(nm)16酒红色51824.5橙红色52241红色52571.5紫红色535一、胶体金与免疫金的制备胶体特性：胶体金（colloidal稳定性：介于小分子离子溶液和粗分散相之间影响因素：胶体金胶粒间的相互吸引力胶体金胶粒及其溶剂化层的带电情况胶体界面的溶剂膜胶体金的特性：聚沉现象：胶粒间吸引力超过排斥力时，胶粒聚集使颗粒直径变大，超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象。引起因素：电解质温度浓度稳定性：介于小分子离子溶液和粗分散相之间胶体金的特性：聚沉现制备原理：0.01%氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾磁力搅拌，准确加入1%柠檬酸三钠水溶液2ml继续煮沸15分钟冷却后加蒸馏水恢复至原体积胶体金的制备：氯金酸（HAuCl4）还原剂：柠檬酸钠、鞣酸、维生素C、白磷、硼氢化钠聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。技术要点：2分钟后：灰色黑色酒红色制备原理：0.01%氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾胶注意事项：

粒径大小：颜色、最大吸收波长、电镜检测粒径均一程度：测定100个以上的胶体金颗粒，统计分析平均直径（颗粒大小）及标准差（均一性）有无凝集颗粒：应清亮透明，若浑浊或有漂浮物，提示制备的胶体金有较多凝集颗粒。氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。1%氯金酸水溶液在4℃可保存数月；氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，配制时避免接触金属；制备用高质量水：双蒸水、三蒸水或去离子水制备用玻璃容器必须绝对清洁（最好经硅化处理：用含5%二氯甲硅的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用）鉴定：保存：

玻璃容器室温、避光3个月左右，4℃半年，避免低温冻存最好在制备完毕后20天以内进行标记。胶体金的制备：注意事项：粒径大小：颜色、最大吸收波长、电镜检测氯金酸易潮制备原理：免疫金：胶体金+抗原或抗体胶体金颗粒表面的负电荷与蛋白质表面带正电荷的基团借静电吸附而形成牢固的结合。胶体金的制备：制备原理：免疫金：胶体金+抗原或抗体胶体金颗粒表面的负电荷与胶体金溶液pH的调整待标蛋白质最适标记量的确定标记过程金标记物的纯化技术要点：被标记物IgGMcAb亲和层析AbSPAConA亲和素最适pH值9.08.27.65.9~6.28.09~10在磁力搅拌下，将蛋白溶液逐滴加入到胶体金溶液中，数分钟后加入一定量的稳定剂（5%牛血清白蛋白或1%聚乙二醇20000）目的：去除未标记的蛋白、未充分标记的胶体金、标记过程中形成的聚合物方法：超速离心法、凝胶过滤法胶体金溶液pH的调整技术要点：被标记物IgGMcAb亲和层析在调节胶体金的pH时，先用终浓度为0.1%的聚乙二醇（PEG20000）稳定胶体金后，再插入电极到胶体金溶液中测定pH。蛋白质溶液标记前，先用低浓度盐水透析数小时，并高速离心去除聚合物。注意事项：用稀释液配制成工作浓度保存稀释液：含稳定剂的缓冲液（PBS、Tris缓冲液）稳定剂：PEG、BSA常用加入50%甘油、-18℃可保存1年以上免疫金的保存：在调节胶体金的pH时，先用终浓度为0.1%的聚乙二醇（PEG二、胶体金免疫技术的方法学种类与原理

（一）斑点金免疫渗滤试验（二）斑点金免疫层析试验二、胶体金免疫技术的方法学种类与原理（一）斑点金免疫渗滤试原理：（一）斑点免疫金渗滤试验：Ag或Ab标本免疫金洗涤液阳性反应呈现红色斑点硝酸纤维素膜原理：（一）斑点免疫金渗滤试验：Ag或Ab标本免疫金双抗体夹心法方法类型：间接法待测抗原胶体金标记抗体包被抗体NC膜包被抗原胶体金标记二抗待测抗体NC膜双抗体夹心法方法类型：间接法待测抗原胶体金标记抗体包被抗体操作要点：试剂盒组成：渗滤装置（反应板）胶体金标记物洗涤液操作要点：平放反应板，于小孔内滴加待测标本1~2，待完全渗入；滴加免疫金试剂1~2滴，待完全渗入；滴加洗涤液2~3滴，待完全渗入；结果判断：膜上显示淡红色或红色斑点为阳性，无颜色显示为阴性，颜色深浅提示阳性程度。操作要点：试剂盒组成：双抗体夹心法方法类型：竞争法胶体金免疫层析试验（GICA）：原理：胶体金技术+蛋白质层析技术双抗体夹心法方法类型：竞争法胶体金免疫层析试验（GICA）：方法类型：间接法方法类型：间接法技术要点：试剂盒组成：胶体金层析条操作要点（以双抗体夹心法为例）：将试剂条标记线一端浸入待测标本中2~5秒，或在加样处加一定量的待检标本，水平放置；5~20分钟内观察结果；结果判断：出现一条棕红色条带为阴性（保证带），出现两条棕红色条带为阳性；无保证带出现为试剂失效。技术要点：试剂盒组成：胶体金层析条临床应用评价：1.免疫金测定技术特点简单、快捷、操作人员不需培训无需特殊仪器设备试剂稳定，便于保存特别适用于床旁检验2.免疫金测定技术灵敏度问题定性和半定量试验，不能准确定量。敏感性不及酶标法和酶发光免疫测定法3.免疫金测定技术临床应用用于检测正常体液中不存在的物质（如传染病Ag/Ab、毒麻类药物）检测正常含量极低，却在特殊情况下异常升高的物质（如人β-HCG）临床应用评价：1.免疫金测定技术特点固相膜免疫分析技术

(solidphasemembrane-basedimmunoassay)是以微孔膜作为固相载体，利用液体可以流过微孔膜，也可以通过毛细管作用在膜上向前移行的特性，以酶或各种有色微粒子（如彩色胶乳、胶体金、胶体硒等）标记抗体或抗原，通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的检验方法。

胶体金免疫技术（本节课部分））斑点酶免疫吸附试验免疫印迹试验小结：固相膜免疫分析技术

(solidphasemembran英语词汇enzymeimmunoassay，EIAELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay)coatingblockingconjugatehookeffectBAS-ELISA（Biotin-Avidinsystem)ABC(Avidin-Biotincomplex)colloidalgoldimmunoassay英语词汇enzymeimmunoassay，EIATips

Theenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)isatestthatusesantibodiesandcolorchangetoidentifyasubstance.ELISAisapopularformatof"wet-lab"typeanalyticbiochemistryassaythatusesasolid-phaseenzymeimmunoassay(EIA)todetectthepresenceofasubstance,usuallyanantigen,inaliquidsampleorwetsample.TheELISAhasbeenusedasadiagnostictoolinmedicine,aswellasaquality-controlcheckinvariousindustries.Antigensfromthesampleareattachedtoasurface.Then,afurtherspecificantibodyisappliedoverthesurfacesoitcanbindtotheantigen.Thisantibodyislinkedtoanenzyme,and,inthefinalstep,asubstancecontainingtheenzyme'ssubstrateisadded.Thesubsequentreactionproducesadetectablesignal,mostcommonlyacolorchangeinthesubstrate.TipsTheenzyme-linkedimmunos第五课酶免疫技术；胶体金技术

临床免疫实验室张君龙

2018第五课酶免疫技术；胶体金技术临床免疫实验室张君龙

2第五课（第一部分）

酶免疫技术酶免疫技术特点ELISA的原理和类型ELISA的技术要点第五课（第一部分）

酶免疫技术酶免疫技术特点以酶标记抗体或抗原作为主要试剂，利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体免疫学反应检测的敏感性的一种标记分析技术，称为酶免疫技术（enzymeimmunoassay，EIA）

一、酶免疫技术的定义和特点以酶标记抗体或抗原作为主要试剂，利用酶催化底物酶免疫技术一般由两部分组成：1.抗原+抗体IC（酶标抗原或抗体参与）2.底物显色色泽程度与IC中的酶活性及数量相关，颜色深浅可确定待测抗原或抗体存在或含量特点:

免疫反应的高特异性酶(专一性)催化反应的高效性及高灵敏度抗体或抗原上的酶酶免疫技术一般由两部分组成：特点:抗体或抗原上的酶酶免疫组化技术酶免疫测定技术二、酶免疫技术的分类均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定(ELISA)液相酶免疫测定酶免疫组化技术二、酶免疫技术的分类均相酶免疫测定非均相酶免疫

均相酶免疫分析又叫勿需分离的酶免疫分析，酶标抗原与抗体结合后，其中的酶活性将被减弱或增强，因此不需分离即可测定反应系统中酶活性的变化，从而推算出待测物的含量。1、均相酶免疫分析技术均相酶免疫分析又叫勿需分离的酶免疫分析，酶标本抗原酶增强免疫测定技术示意图（EMIT）EMIT的基本原理及特点：半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制（图A）。从酶活性的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。标本抗原浓度与显色程度成正比。标本抗原酶增强免疫测定技术示意图（EMIT）EMIT的基本原应用：主要用于检测小分子激素和半抗原（如：药物）应用：主要用于检测小分子激素和半抗原（如：药物）

异相酶免疫分析要求，酶标抗原与抗体结合后，需采用适当的方法分离游离的和抗原（或抗体）结合复合物-酶标记物，测定底物显色程度，从而推算出待测物的含量。2、异相酶免疫分析技术异相液相酶免疫分析固相酶免疫分析——ELISA异相酶免疫分析要求，酶标抗原与抗体结合后，以检测抗原为例：3、ELISA的原理和类型（一）ELISA的基本原理E酶标抗体固相抗体固相载体待测抗原ELISA:enzyme-linkedimmunosorbentassay(酶联免疫吸附试验)以检测抗原为例：3、ELISA的原理和类型（一）ELISA1.间接法1.双抗体夹心法2.双位点一步法3.竞争法2.双抗原夹心法（二）方法类型检测抗原的方法检测抗体的方法3.竞争法1.间接法1.双抗体夹心法2.双位点一步法3.竞争法

顾名思义，由两个抗体夹一个抗原形成“三明治”复合物，来检测抗原的方法，仅适合于至少含两个抗原决定簇的多价抗原检测。1.双抗体夹心法检测抗原的方法E酶标抗体固相抗体固相载体待测抗原顾名思义，由两个抗体夹一个抗原形成“三明治”1.抗体（检测抗原）2.加样本、孵育、洗涤3.加酶结合物、孵育、洗涤4.加底物液、终止液、比色EE检测抗原EE1.抗体（检测抗原）2.加样本、孵育、洗涤3.加酶结合物、

Colorless

阴性阳性OD浓度底物液、终止液Colorless阴应用：

如：乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、细胞因子、肿瘤标志物AFP、CEA等的测定应用：如：乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、细胞因子、肿瘤标志物

在双抗体夹心法的基础上发展而来，所检测抗原有两个不同的抗原决定簇，两种针对不同抗原决定簇的单克隆抗体可同时和抗原反应，生成夹心式“三明治”复合物。2.双位点一步法在双抗体夹心法的基础上发展而来，所检测抗原有双位点一步法测抗原示意图

双位点一步法测抗原示意图钩状效应（hookeffect）

当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量，严重时甚至可出现假阴性结果。（类似于沉淀反应中抗原过剩的后带现象）应用如：乙型肝炎表面抗原的检测（HBsAg）钩状效应（hookeffect）当标本中测定抗原：受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。3.竞争法AgE+AbAgEAbAgAbAg+测定抗原：受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固

竞争法示意图

竞争法示意图

所谓间接法是指利用酶标记的抗抗体（即二抗）来检测与固相抗原结合的抗体。1.间接法测抗体检测抗体的方法所谓间接法是指利用酶标记的抗抗体（即二抗）来间接法检测抗体示意图1.Antigencoating2.Sample(humanantibody)3.Anti-(human)Ig-enzyme

EEE4.Substrate5.Stopsolution间接法检测抗体示意图1.Antigencoating2.国际通用的标准板形是8X12的96孔式附：国际通用的标准板形是8X12的96孔式附：酶标仪图附：酶标仪图附：OD值[antibody]吸光度与抗体浓度标准曲线OD值[antibody]吸光度与抗体浓度标准曲线

只要更换不同的固相抗原，用一种酶标抗抗体就可检测出各种相应的抗体。优点应用

人体内多种自身抗体检测，如：抗CCP抗体、抗心磷脂抗体等只要更换不同的固相抗原，用一种酶标抗抗体就可检2.竞争法抗体的检测一般不采用竞争法。抗体的竞争法测定不同于单个抗原决定簇的小分子抗原的竞争法。测定可靠性受竞争抗体的特异性和亲和力影响。亲和力的差异易造成部分无法解释的结果。2.竞争法抗体的检测一般不采用竞争法。E酶标Ab待测AbHBeAb竞争法（传统）固相Ag固相Ab待测Ab中和AgE酶标Ab中和AgE酶标Ab显色强弱与待测含量呈反比HBeAb竞争法（改良）E酶标Ab待测AbHBeAb竞争法（传统）固相Ag固相Ab待4.捕获法测IgM抗体血清中某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定捕获法：先将所有血清IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，再测定特异性IgM。

4.捕获法测IgM抗体血清中某些抗原的特异性IgM常和特捕获法测IgM抗体示意图

应用：如：检测乙肝IgM型抗体捕获法测IgM抗体实际上夹心法的两次运用RF的干扰捕获法测IgM抗体示意图应用：如：检测乙肝IgM型抗体捕获亲合素：Avidin生物素：Biotin6.BAS-ELISA（参见相关章节）1个亲合素可以和4个生物素分子亲密结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，一经结合就极为稳定。把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。System生物素亲合素-ELISA亲合素：Avidin6.BAS-ELISA（参见相关章节）BAS-ELISA法示意图

待检标本BAS-ELISA法示意图待检标本应用

由于BAS-ELISA法的放大作用，可对体内含量极微的物质进行检测，例如：细胞因子、粘附分子等的检测。应用由于BAS-ELISA法的放大作用，可对不同试剂生产厂家，测定同一种物质而设计ELISA方法可有所不同，但都是在以上几种经典方法的衍化和变通。不同试剂生产厂家，测定同一种物质而设计ELISAELISA技术要点包括三个方面：三、ELISA

的技术要点

试剂制备反应条件的选择操作的标准化ELISA技术要点包括三个方面：三、ELISA的技术要点（2）固相载体选择（1）抗原和抗体的选择（5）终止液（4）底物（3）酶的选择及标记过程1.试剂制备（2）固相载体选择（1）抗原和抗体的选择（5）终止液（4）底（1）抗原和抗体★酶标记抗体或抗原也称为结合物(conjugate)要求：抗原纯度高、抗原性完整抗体特异性好,效价高,亲和力强,比活性高用于ELISA的抗体有多克隆和单克隆，效果为：Fab段>单克隆>多克隆（1）抗原和抗体★酶标记抗体或抗原也称为结合物(conjug(２)固相载体★对固相载体的要求最常用固相载体(２)固相载体★对固相载体的要求最常用固相载体

①

结合抗体或抗原量大②

抗体或抗原固定后洗涤不易脱落③

不影响其免疫活性④抗体Fc段固定于载体,结合位点朝外对固相载体的要求①

结合抗体或抗原量大对固相载体的要求ELISA最常用载体：聚苯乙烯膜载体:硝酸纤维素膜聚苯乙烯优点：

①较强吸附蛋白质的性能②抗体或抗原能保留免疫活性③聚苯乙烯可制成各种形状缺点：

包被液pH在9.0左右为宜，小于6.0时非特异性吸附增多。

ELISA最常用载体：聚苯乙烯抗原或抗体固相化包被(coating)：将抗原或抗体固相化的过程

封闭(blocking)：用1%~5%牛血清白蛋白或5%~20%小牛血清再包被一次，可减小或消除本底包被板的保存：

4℃、干燥、密封抗原或抗体固相化包被(coating)：将抗原或抗体固相化的★（3）酶的选择酶的主要要求常用的酶及其底物★（3）酶的选择酶的主要要求常用的酶及其底物用于标记的酶应符合以下条件：酶催化效率高具有可与抗原或抗体共价结合的基团标记后酶不影响抗原抗体的免疫反应性标记后酶不影响酶催化活性抗原抗体反应的最适pH时，酶的活性稳定酶对人体无害，价廉易得用于标记的酶应符合以下条件：酶活性：指1min将1μmol底物转化为产物所需的酶量常用酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）HRP的特点：1）分子量小，标记后较稳定2）pH稳定范围宽，3.2~12都能催化反应3）水溶解度好，可配制较高的酶结合物浓度AP的特点：高纯制品难得,稳定性及酶标记物收率低,价格较高酶活性：

戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和抗体蛋白分子中的氨基反应形成结合物，将两个分子以五碳桥连接起来。

改良过碘酸钠法

HRP中的多糖羟基被氧化成活泼的醛基，后者即可与抗体蛋白中的游离氨基形成Schiff碱而交联，再经硼氢化钠还原终止反应，即得到稳定的酶标结合物。制备抗体酶结合物用方法：戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分①无色、无味、无毒、性质稳定②呈色产物的量在一定范围内与酶的浓度或活性成正比③至少应有一种能终止酶反应的试剂④光照不影响底物和产物的稳定性⑤价廉易得

（4）对底物的要求★①无色、无味、无毒、性质稳定

（4）对底物的要求★常用酶及其底物辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）作用底物邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）颜色橙黄色黄色黄色最大吸收峰492nm450nm405nm特点OPD稳定性差，需新鲜配制，需避光，有致癌性TMB稳定性好，不需避光，无致突变作用，水溶性稍差AP高纯制品难得，稳定性及酶标记物收率低，价格较高常用酶及其底物辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）作用（5）终止液

常为浓酸或浓碱★（5）终止液★建立某一ELISA测定，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，选择阳性结果吸光度值在1.0左右，阴性结果小于0.2的最高稀释度为合适浓度。2.反应条件的选择建立某一ELISA测定，应对包被抗原或抗体的浓3.测定方法的标准化试剂盒的标准化生产由厂家在生产试剂盒时进行测试完成检测的标准化由工作人员进行，应力求各个操作步骤的标准化3.测定方法的标准化(a)加样(b)pH值(c)温度(d)孵育时间(e)洗涤(f)比色标准化操作程序（SOP）ELISA全自动化检测仪(a)加样(b)pH值(c)温度(d)孵育时间(e)洗涤(f

酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，它的最小检测限为ng甚至pg水平。四、酶免疫测定的应用酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，它的最1．将Fab’或F(ab’)2片段与固相载体交联，提高测定的特异性。2．过量抗体的非竞争法将逐步取代限量抗体的竞争法，前者的灵敏度和可测范围至少可比后者大6-10倍。3．随着酶免疫技术与放大系统及自动化原理相结合，使酶免疫分析检测更敏感、更特异、更客观、更准确。五、发展趋势1．将Fab’或F(ab’)2片段与固相载体交联，提高测定的小结酶免疫技术定义酶免疫技术的分类ELISA的原理和类型ELISA的技术要点膜载体的酶免疫测定酶免疫测定的应用主要内容小结酶免疫技术定义主要内容固相膜免疫分析技术

(solidphasemembrane-basedimmunoassay)是以微孔膜作为固相载体，利用液体可以流过微孔膜，也可以通过毛细管作用在膜上向前移行的特性，以酶或各种有色微粒子（如彩色胶乳、胶体金、胶体硒等）标记抗体或抗原，通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的检验方法。

胶体金免疫技术斑点酶免疫吸附试验免疫印迹试验第五课（第二部分）胶体金技术

固相膜免疫分析技术

(solidphasemembran胶体金免疫技术

胶体金标记+抗原抗体反应免疫电镜技术光镜染色技术蛋白质染色技术流式细胞术斑点免疫金渗滤试验斑点免疫金层析试验（colloidalgoldimmunoassay）胶体金免疫技术胶体金标记+抗原抗体反应免疫电镜技一、胶体金与免疫金的制备胶体特性：胶体金（colloidalgold）

金溶胶，是金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液。1~100nm大小稳定均匀单一分散状

对电解质敏感胶体金的特性：呈色性和光吸收性：胶体金颗粒大小(nm)呈色吸收峰波长(nm)16酒红色51824.5橙红色52241红色52571.5紫红色535一、胶体金与免疫金的制备胶体特性：胶体金（colloidal稳定性：介于小分子离子溶液和粗分散相之间影响因素：胶体金胶粒间的相互吸引力胶体金胶粒及其溶剂化层的带电情况胶体界面的溶剂膜胶体金的特性：聚沉现象：胶粒间吸引力超过排斥力时，胶粒聚集使颗粒直径变大，超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象。引起因素：电解质温度浓度稳定性：介于小分子离子溶液和粗分散相之间胶体金的特性：聚沉现制备原理：0.01%氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾磁力搅拌，准确加入1%柠檬酸三钠水溶液2ml继续煮沸15分钟冷却后加蒸馏水恢复至原体积胶体金的制备：氯金酸（HAuCl4）还原剂：柠檬酸钠、鞣酸、维生素C、白磷、硼氢化钠聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。技术要点：2分钟后：灰色黑色酒红色制备原理：0.01%氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾胶注意事项：

粒径大小：颜色、最大吸收波长、电镜检测粒径均一程度：测定100个以上的胶体金颗粒，统计分析平均直径（颗粒大小）及标准差（均一性）有无凝集颗粒：应清亮透明，若浑浊或有漂浮物，提示制备的胶体金有较多凝集颗粒。氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。1%氯金酸水溶液在4℃可保存数月；氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，配制时避免接触金属；制备用高质量水：双蒸水、三蒸水或去离子水制备用玻璃容器必须绝对清洁（最好经硅化处理：用含5%二氯甲硅的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用）鉴定：保存：

玻璃容器室温、避光3个月左右，4℃半年，避免低温冻存最好在制备完毕后20天以内进行标记。胶体金的制备：注意事项：粒径大小：颜色、最大吸收波长、电镜检测氯金酸易潮制备原理：免疫金：胶体金+抗原或抗体胶体金颗粒表面的负电荷与蛋白质表面带正电荷的基团借静电吸附而形成牢固的结合。胶体金的制备：制备原理：免疫金：胶体金+抗原或抗体胶体金颗粒表面的负电荷与胶体金溶液pH的调整待标蛋白质最适标记量的确定标记过程金标记物的纯化技术要点：被标记物IgGMcAb亲和层析AbSPAConA亲和素最适pH值9.08.27.65.9~6.28.09~10在磁力搅拌下，将蛋白溶液逐滴加入到胶体金溶液中，数分钟后加入一定量的稳定剂（5%牛血清白蛋白或1%聚乙二醇20000）目的：去除未标记的蛋白、未充分标记的胶体金、标记过程中形成的聚合物方法：超速离心法、凝胶过滤法胶体金溶液pH的调整技术要点：被标记物IgGMcAb亲和层析在调节胶体金的pH时，先用终浓度为0.1%的聚乙二醇（PEG20000）稳定胶体金后，再插入电极到胶体金溶液中测定pH。蛋白质溶液标记前，先用低浓度盐水透析数小时，并高速离心去除聚合物。注意事项：用稀释液配制成工作浓度保存稀释液：含稳定剂的缓冲液（PBS、Tris缓冲液）稳定剂：PEG、BSA常用加入50%甘油、-18℃可保存1年以上免疫金的保存：在调节胶体金的pH时，先用终浓度为0.1%的聚乙二醇（PEG二、胶体金免疫技术的方法学种类与原理

（一）斑点金免疫渗滤试验（二）斑点金免疫层析试验二、胶体金免疫技术的方法学种类与原理（一）斑点金免疫渗滤试原理：（一）斑点免疫金渗滤试验：Ag或Ab标本免疫金洗涤液阳性反应呈现红色斑点硝酸纤维素膜原理：（一）斑点免