生态学实验技术第五讲-生态化学计量学实验技术课件

第五讲生态化学计量学实验技术

生态化学计量学是研究生物系统能量平衡和多种化学元素（主要是C、N、P）平衡的科学。

生态化学计量学结合了生物学、化学和物理学等基本原理，通过研究生态过程中化学元素的比例关系，将复杂的生命现象简化为元素之间的配比和动态平衡，为研究C、N、P等元素在生态系统过程中的耦合关系提供了一种综合方法。第五讲生态化学计量学实验技术

生态化学计背景

生物科学研究方向出现窄化现象，阻碍了把整个生物界作为一个功能整体来进行研究，使得不同领域的联系变得更加困难。

窄化现象主要体现在两个方面：1、在生物组织的不同水平上（如分子、个体、种群和生态系统）。2、在特定的模式生物范围内（如线虫、水蚤、拟南芥、果蝇）或特定的生境中（如湖泊、森林、海洋和草地）。背景生物学科不同层次的研究在元素水平可统一起来生态化学计量学主要研究生态过程中化学元素的比例关系，将复杂的生命现象简化为元素之间的配比和动态平衡，使生物体（分子、细胞器、细胞和有机体）能够根据它们的元素组成加以明显区分。生态化学计量学能够将生物学科不同层次（分子、细胞、有机体、种群、生态系统和全球尺度）的研究理论在元素水平上统一起来，成为近年来新兴的一个生态学研究领域。生物学科不同层次的研究在元素水平可统一起来生态化学计量学主要研究元素陆地生态系统中的生态化学计量学主要关注碳、氮、磷三种元素的比率关系。

N、P作为植物生长的必需矿质营养元素和生态系统常见的限制性元素，一般植物蛋白质的16%是N，

核酸的9.5%是P，

这两个比例在不同来源的生物中相对稳定。因而氮磷含量的差异可以反映生物体中蛋白质和核酸含量的差异。C约占植物有机体干物质的50%左右,这一比例在生物的不同类群中随细胞的结构组成发生变化。生态化学计量学主要研究元素在植物个体水平，C、N、P的组成及分配是相互联系、不可分割的一个整体，它们的相互作用及与外界环境的关系共同决定着植物的营养水平和生长发育过程。如植物要获得C首先需要投资N到同化器官。同样,为了获得N，植物要投资同化的有机物到根系。

近年来由于人类活动的强烈影响，这三种元素的循环在速度和规模上都发生了前所未有的改变，导致一系列环境问题的出现。

在植物个体水平，C、N、P的组成及分配是相元素与环境等因素相联系环境对有机体元素间比值的影响很大，不同的地质、气候和生物等因素都会影响比值。有机体根据自身元素比值从环境中摄取所需元素，并通过消耗和释放不同于环境元素比值的元素，对周围环境的元素比值产生影响。

环境和有机体的的元素化学计量比值之间形成复杂的反馈关系，一旦两者的化学计量比值不相匹配，就会引发有机体种群行为和进化的改变，影响生物的生长发育过程和形态的改变。元素与环境等因素相联系化学计量学的主要原理：动态平衡理论有机体与其环境保持一种相对稳定的平衡状态。正常有机体的养分元素组成比较稳定，即使外界环境不断变化也不会发生很大变化。生物在长期进化过程中,形成了一定的内稳态机制，即生物在变化的环境(包括食物)中具有保持其自身化学组成相对恒定的能力，它是生态化学计量学存在的前提。化学计量学的主要原理：

植被根、茎和叶中的养分含量取决于土壤养分供应和植被养分需求间的动态平衡，因此植物的养分比率常常会趋向一固定的比值，这种模式最先在海洋中被观察到，后来发现在陆地生态系统也是如此。

1958年,哈佛大学的Redfield首次证明:海洋浮游生物的C、N、P有特定的组成(摩尔比106:16:1，该比率后被称为Redfield比率)。植被根、茎和叶中的养分含量取决于土壤养分供应

一般群落水平上生态化学计量学内稳性与生态系统功能和稳定性正相关，化学计量学稳定的物种具有较高而稳定的生物量，而由较多这类物种（优势种）组成的生态系统具有较高生产力和较大稳定性。从早期的原核生物到后期的原核生物，再到单细胞真核生物和多细胞真核生物，内稳性是逐渐增强的。如藻类和真菌的内稳性低于其它低等植物，低等植物低于高等植物，植物低于动物。养分的供应状况和光强、施肥、物种、器官、生长发育阶段等都会影响到植物的生态化学计量内稳性。生态化学计量内稳性一般群落水平上生态化学计量学内稳性与生态系统

生长速率理论生物体的C∶N∶P与生长率有很强的关系。生物体的快速生长需要大量的核糖体RNA合成蛋白质，由于核糖体RNA中含有大量的P，从而使得生长率高的生物具有较低的C∶P和N∶P。已在浮游动物、节肢动物和细菌研究中得到验证。由于植物具有贮存物质的功能以及RNA中的P占植物全磷的比例较低，高等植物是否符合生长率假说仍具不确定性。生长速率理论

生态化学计量学主要研究内容：（1）区域C:N:P化学计量学格局及其驱动因素（2）C:N:P计量关系与植物个体生长发育、种群增长、群落动态和生态系统过程的联系（3）不同营养级之间对C:N:P化学计量学的调节（4）环境要素和生物组成元素之间的计量关系生态化学计量学主要研究内容：（1）区域C:N:P化学计量学格局及其驱动因素代表性的研究包括:（1）区域C:N:P化学计量学格局及其驱动因素Elser等对全球陆生植物及无脊椎食草动物的研究,表明尽管陆生环境和淡水湖泊环境有着巨大的差异，但是陆生植物和无脊椎食草动物具有相近的N:P比率。

Reich对全球1280种陆生植物的研究发现，随着纬度的降低和年平均气温的增加，叶片的N和P含量降低,而N:P则升高。McGroddy等研究了全球森林生态系统的C:N:P计量学关系，发现尽管从全球来看，植物叶片的C:N:P存在较大变化，但在生物群区的水平上相对稳定，并且叶片凋落物的C:N相对稳定。Elser等对全球陆生植物及无脊椎食草动物的研Yan等研究了全球220个地点的433种水生草本植物的N、P含量和N:P比值，发现水生草本植物比陆生植物具有更高的P含量和更低的N:P比值，而N含量相近。蕨类植物的N、P含量高于种子植物；禾草类植物的N、P含量低于杂草类植物；单子叶植物N、P含量低于杂草类植物；浮叶植物和浮水植物的N、P含量高于挺水植物。Han等研究了中国753种陆生植物的N:P比率，发现和全球相比，中国植物的P含量相对较低，这可能导致了叶片N:P高于全球平均水平。Yan等研究了全球220个地点的433种水生He等对内蒙古温带草地、青藏高原高寒草地,以及新疆山地草地199个取样地点213个物种的化学计量学分析发现：植物叶片N:P比率主要受P含量的影响；中国草地植物的P含量相对较低，而N:P高于其他地区草地生态系统，并且在草地生物群区之内，N、P及N:P不随温度和降水发生明显变化。这些研究还发现，草本植物叶片的N、P含量通常高于木本植物。He等对内蒙古温带草地、青藏高原高寒草地,（2）C:N:P计量关系与植物个体生长发育、种群增长、群落动态和生态系统过程的联系植物种内不同发育阶段，以及群落和生态系统不同组成物种之间对C、N、P等多种元素要求均有差异,这种差异引起不同层次上资源“供应-需求”之间的错配或矛盾,从而调节生理和生态学过程。目前在生活型、生活史、光合途径等方面的比较研究报道较多。（2）C:N:P计量关系与植物个体生长发育、种群增长、群落动生活型：针叶林C:N高于阔叶林，C:P和N:P低于阔叶林;常绿林的N:P高于落叶林;草本的N:P低于木本生活史：森林植物C/N随植株年龄增大而增加。湿地植物N∶P在生长初期其值较小，在生长旺盛期先升高后降低，随后在成熟期逐渐增加并趋于稳定。光合途径：仅有研究表明C3植物的N∶P高于C4植物,

枯落物生态化学计量学特征与植物活体的规律相似土壤的生态化学计量特征：森林低于草原、沙漠低于极寒高原。生活型：针叶林C:N高于阔叶林，C:P和N:P低于阔叶林;生态学实验技术第五讲-生态化学计量学实验技术课件生态学实验技术第五讲-生态化学计量学实验技术课件（3）不同营养级间对C:N:P化学计量学的调节在C:N:P计量学研究中,一个重要的例子就是可以根据植物叶片的N:P比率来判断土壤养分状况。对欧洲湿地植物施肥研究发现，当植物N:P<14时，表现为受N的限制；当N:P>16时，表现为受P的限制。内蒙古羊草草原的施肥试验表明,N:P>23时是P限制,而N:P<21时是N限制。一般来说，温带森林地区一般是受氮素限制，热带地区主要是受磷素限制。（3）不同营养级间对C:N:P化学计量学的调节

由于气候、地貌、植被、母岩、年代、土壤动物等土壤形成因子和人类活动的影响，土壤碳氮磷总量变化很大,土壤C∶N∶P比的空间变异性较大，如我国湿润温带土壤中的C∶N比稳定在10∶1到12∶1左右，热带、亚热带地区可高达20∶1，而一般耕作土壤表层有机质的C∶N比在8∶1到15∶1，平均在10∶1到12∶1之间。目前部分土壤氮储量估算和生态系统碳模型研究中常将土壤C∶N比视为一个常数，并根据土壤和生物量中碳含量以及C∶N比值，似估计大部分土壤和生物量的氮储量。由于气候、地貌、植被、母岩、年代、土壤动物等

有机物C∶N比值越高，分解速度也就越慢，这是因为微生物得不到足够的氮素来构成其躯体，从而影响其繁殖速度。土壤微生物每分解25份碳素就需要1份氮素组成自己的身体，即微生物需要C∶N比约为25∶1的底物来满足它们的需氮量。在C∶N比较高时，微生物需要输入氮来满足他们的生长；在C∶N比较低时，氮超过微生物生长所需的部分就会释放到凋落物和土壤中。有机物C∶N比值越高，分解速度也就越慢，这是（4）环境要素和生物组成元素间的计量关系

低营养条件下，植物生长缓慢，C/N和C/P增加，植物对营养的利用率较高；

高营养条件下，植物生长和蛋白质的合成均最大化，C/N和C/P减小，对营养的利用率变小。除了生物组成元素之间的计量关系，目前发现环境要素如光照可能影响植物的C:N:P计量关系。近年来的一些研究表明，光：养分可能存在计量关系，特别是在浮游生物中。如光照可以改变浮游植物的C:P计量关系，随着辐射增强，藻类群落生物量和C:P增长加快。（4）环境要素和生物组成元素间的计量关系养分重吸收率养分添加对元素含量及比值的影响各器官元素化学计量特征的相关性不同生活型和功能性的比较元素化学计量学的大尺度格局生态学系主要研究养分重吸收率生态学系主要研究研究方法一

、样品的采集二、

样品的制备与保存三

、化学元素的测定1、植物全氮、磷、钾的测定2、植物组织中纤维素和可溶性糖含量测定3、土壤碳、氮、磷的测定研究方法一、

样品采集（一）植物组织样品的采集

1、地点的选择：通常按照一定路线多点采集，采样点应代表研究区域的植被类型。

2、植物的选择优势种或常见种，注意植株长相、植株长势、发育期的一致，过大或过小，遭受病虫害或机械损伤以及由于边际效应长势异常的植株都不应采集。缺素诊断采样时，应注意植株的典型性，同时在附近地块另行选取有对比意义的正常典型植株，使分析的结果能在相互比较的情况下说明问题。

一、

样品采集生态学实验技术第五讲-生态化学计量学实验技术课件3、样品数量组成每一平均样品的样株数目视植物种类、密度、株型大小、株龄或生育期以及要求的准确度而定。4、取样部位

所选部位的组织器官应具有最大的指示意义，即在该时期对该养分的丰欠最敏感的组织器官。如需要分不同器官(如叶片，叶鞘或叶柄、茎、果实、细根和粗根等)测定，须立即将其剪开，以免养分运转。3、样品数量

多数情况下取生殖开始时期主茎或主枝顶部的成熟健壮叶或功能叶；一般不采集养分组成变化较快的幼嫩组织。苗期诊断多采集整个地上部分。大田作物结实后，营养体中的养分转化很快，不宜再做叶分析。研究施肥等措施对产品品质的影响时，在成熟期采取茎秆、籽粒、果实、块茎、块根等样品。果树和林木多年生植物的营养诊断通常采用“叶分析”或不带叶柄的“叶片分析”，个别果树如葡萄、棉花，则常做“叶柄分析”。

多数情况下取生殖开始时期主茎或主枝顶部的成熟5、采样时间植物体内各种物质，特别是硝态氮、氨态氮、还原糖等不仅不同生育期的含量有很大的差别，并且一日之间也有显著的周期性变化。因此取样时间应一致。通常选上午8—10时，此时植物生理活动已趋活跃，地下部分根系吸收速率与地上部分趋于上升的光合作用强度接近动态平衡。此时植物组织中的养料贮量最能反映根系养料吸收与植物同化需要的相对关系，最具营养诊断意义。诊断作物氮、磷、钾、钙、镁的营养成分状况的采样还应考虑各元素在植物营养中的特殊性。5、采样时间（二）土壤样品的采集土壤本身在空间分布上具有不均一性，应多点采样，均匀混合，以使土壤具有代表性。在同一个采样测定单位里，如面积不大，可在不同方位上选择5～10个有代表性的采样点取样。常用采样方法：a.对角线采样法：面积较小、地势平坦、土壤较均匀b.梅花形采样法：面积较小、地势平坦、土壤较均匀c.棋盘式采样法：中等面积、地势平坦、地形开阔，土壤较不均匀d.蛇形采样法：面积较大，地势不太平坦，土壤不够均匀（二）土壤样品的采集生态学实验技术第五讲-生态化学计量学实验技术课件“X”

法布点“X”法布点生态学实验技术第五讲-生态化学计量学实验技术课件生态学实验技术第五讲-生态化学计量学实验技术课件采样深度对一般土地采样深度50—100cm即可。可根据研究目的分层取样。常用0-10，10-20，20-30，30-50，50-70，70-100cm。采样量测定所需的土壤样品是多点混合而成，取土量往往较大，实际测定时并不需要太多。具体需要土壤样品量，视分析测定项目而定。一般要求，采样1千克。对多点采集的土壤，可反复按四分法弃取，最后留下所需的土量。采样深度采样时期土壤某些性质可因季节不同而有变化，因此应根据不同的目的确定适宜的采样时间。一般在秋季采样能更好地反映土壤对养分的需求程度，因而建议在定期采样时在一年一熟的农田的采样期放在前茬作物收获后和后茬作物种植前为宜，一年多熟农田放在一年作物收获后。只需采一次样时，则应根据需要和目的确定采样时间。在进行长期定位试验的情况下，为了便于比较，每年的采样时间应固定。采样时期二

、样品的制备与保存

（一）植物样品1、洗剂

采集的植物样品一般需要洗涤，否则可能引起泥土、施肥喷药等显著的污染，这对微量营养元素如铁、锰等的分析尤为重要。洗涤一般用湿布仔细擦净表面沾污物即可。二

、样品的制备与保存

（一）植物样品2、干燥

测定易起变化的成分(例如硝态氮、氨态氮、氰、无机磷、水溶性糖、维生素等)须用新鲜样品。测定不易变化的成分常用干燥样品。洗净的鲜样必须尽快干燥，以减少化学和生物的变化。烘干的温度不能太高，以防止组织外部结成干壳而阻碍内部水分的蒸发，而且高温还可能引起组织的热分解或焦化。通常植物鲜样要分两步干燥，先在80—90℃烘箱(最好鼓风烘箱)中烘15—30分钟(松软组织烘15分钟，致密坚实的组织烘30分钟)，然后，60—70℃烘至恒重。

2、干燥3、粉碎鲜样品剪碎混匀后立即称样，放入研钵中与适当溶剂(或再加石英砂)共研磨，进行浸提测定。干样品可用研钵研磨或粉碎机粉碎。分析样品的细度须视称样的大小而定，通常可用圆孔直径为1mm的筛；如称样仅1—2g者，宜用0.5mm的筛；称样小于1g者，须用0.25或0.1mm筛。4、样品的保存鲜样品如需短期保存，可洗剂后放冰箱中冷藏。干燥的磨细样品必须保存在密封的玻璃瓶(常用磨口广口瓶)中，称样时应充分混匀后多点勺取。3、粉碎目数孔径/mm

目数

孔径/mm

300.60

50

0.335

800.180100

0.154

1500.100

180

0.082000.0742500.0613000.050400

0.0385

500

0.0308600

0.0250700

0.02008000.0150筛子的目数和孔径对照表目数孔径/mm

目数

孔径/mm

300.60

50

0.3（二）土壤样品1、风干：将采回的土样放在纸上或塑料布上，摊成薄薄的一层（厚约2厘米），室内通风阴干。在土样半干时，须将大土块捏碎（尤其是黏性土壤），以免完全干后结成硬块，难以磨细。切忌阳光直晒和酸、碱、蒸气以及尘埃等污染。样品风干后，应拣去动植物残体如根、茎、叶、虫体等和石块、结核（石灰、铁、锰）。如果石子过多，应当将拣出的石子称重，记下所占的百分比（扣除土壤中的砾石，计算土壤容重）。（二）土壤样品样品的凉晒

样品采回来后，不能及时化验或未能送到化验室化验的样品，应及时摊开于塑料上，在通风、干躁、避免阳光照射和不靠近肥料农药处自然凉干。

样品的凉晒样品采回来后，不能及时化验或未能送到化验2、干燥：

在105ºC条件下烘至恒重，在此温度下土壤吸着水被蒸发，而结构水不致破坏，土壤有机质也不致分解。取一部分烘干土壤用四分法取样。拣去样品中的石块，草根等杂质后用2mm直径的筛子过筛，同时测大于2mm的石砾重量。取1/4样品进一步拣去土壤中的杂质，利用RetschS100球磨机粉碎，并使其全部通过土壤筛。

2、干燥：RetschS100球磨机RetschS100球磨机3、样品的保存干燥的磨细样品必须保存在密封的玻璃瓶（常用磨口广口瓶）中，称样时应充分混匀后多点勺取。

样品在粉碎和贮存过程中会吸收一些空气中的水分，所以在精密分析工作中，称样前还须将粉状样品在65℃(12—24小时)或90℃(2小时)再次烘干，一般常规分析则不必。3、样品的保存三、

植物全氮、磷的测定

植物中氮、磷的测定包括待测液的制备和氮磷的定量两大步骤。植物全氮待测液的制备通常用开氏消煮法。植物全磷可用干灰化或其他湿灰化法制备待测液。可用同一份消煮液分别测定氮、磷以及其它元素(如钙、钾、镁、铁、锰等)。三、

植物全氮、磷的测定

植物中氮、磷的测1

植物样品的消煮(H2SO4—H2O2法)

方法原理植物中的氮、磷大多数以有机态存在，钾以离子态存在。样品经浓H2SO4和氧化剂H2O2消煮，有机物被氧化分解，有机氮和磷转化成铵盐和磷酸盐，钾也全部释出。消煮液经定容后，可用于氮、磷、钾等元素的定量。

采用H2O2加速消煮剂，不仅操作手续简单快速，对氮、磷、钾的定量没有干扰，而且具有能满足一般生产和科研工作所要求的准确度，但要防止有机氮被氧化成N2或氮的氧化物而损失。

1

植物样品的消煮(H2SO4—H2O2法)

方法原理操作步骤：(1)常规消煮法

称取植物样品0.3～0.5g装入100ml开氏瓶中，加浓硫酸5ml摇匀(最好放置过夜)，在电炉上先小火加热，待H2SO4发白烟后再升高温度，当溶液呈均匀的棕黑色时取下，稍冷后加6滴H2O2，再加热至微沸，消煮约7—10分钟，稍冷后重复加H2Ｏ2再消煮，如此重复数次，每次添加的H2Ｏ2应逐次减少，消煮至溶液呈无色或清亮后，再加热约10分钟，除去剩余的H2O2。取下冷却后，将消煮液转移入100ml容量瓶中，冷却至室温后用水定容。用无磷钾的干燥滤纸过滤，或放置澄清后吸取上清液测定氮、磷、钾。

每批消煮的同时，做空白试验以校正试剂和方法的误差。操作步骤：(2)快速消煮法称取植物样品0.3～0.5g，放入100ml开氏瓶中，加1ml水润湿，加入4ml浓H2SO4摇匀，分两次各加入H2O22ml，每次加入后均摇匀，待激烈反应结束后，置于电炉上加热消煮，使固体物消失成为溶液，待H2SO4发白烟，溶液成褐色时，停止加热，此过程约需10分钟。冷却后加入H2O22ml，继续加热消煮约5—10分钟，冷却，再加入H2Ｏ2消煮，如此反复一直至溶液呈无色或清亮后(一般情况下，加H2O2总量约8—10ml)再继续加热5—10分钟，以除尽剩余的H2O2。取下冷却后用水定量地转移入100ml容量瓶中，定容。(2)快速消煮法植物全氮的测定

方法原理:

植物样品经开氏消煮、定容后，吸取部分消煮液碱化，使铵盐转变成氨，经蒸馏和扩散，用H3BO3吸收形成四硼酸铵，直接用标准酸滴定，以甲基红—溴甲酚绿混合指示剂指示终点。根据酸的消耗量，即可计算出样品的总含氮量。

试剂：

(1)40%(m/v)NaOH溶液

(2)2%H3BO3—指示剂溶液

(3)酸标准溶液〔C(HCl或1/2H2SO4)=0.01mol/L〕

(4)碱性溶液

植物全氮的测定

方法原理:

植物样品经1)蒸馏法

吸取定容后的消煮液5.00—10.00ml(含NH4—N约1ml)，注入半微量蒸馏器的内室，另取150ml三角瓶，内加入5ml2%H3BO3指示剂溶液，放在冷凝管下端，管口置于H3BO3液面以下，然后向蒸馏器内室慢慢加入约3ml40%(m/v)NaOH溶液，通入蒸气蒸馏(注意开放冷凝水，勿使馏出液的温度超过40℃)，待馏出液体积约达50～60ml时，停止蒸馏，用少量已调节至pH为4.5的水冲洗冷凝管末端。用酸标准溶液滴定馏出液至由蓝绿色突变为紫红色(终点的颜色应和空白测定的终点相同)。用酸标准溶液，同时进行空白液的蒸馏测定，以校正试剂和滴定误差。

1)蒸馏法结果计算

全N%=C(v-v0)×0.041×100/(m×v2/v1)

其中

C—酸标准溶液浓度，mol/L；

v—滴定试样所用的酸标准液，ml；

v0—滴定空白所用的酸标准液，ml；

0.041—N的毫摩尔质量，g/mmol；

m—称样量，g；

v1—消煮液定容体积，ml；

v2—吸取测定的消煮液体积ml。

结果计算

全N%=C(v-v0)×0.041×100/植物全氮的测定-奈氏比色法原理：植物样品在浓硫酸溶液中，历经脱水炭化、氧化等一系列作用，使铵盐转变成氨。氨与奈氏试剂反应生成黄色化合物，此化合物的最大吸收波长为420nm。

植物全氮的测定-奈氏比色法

试剂：100g/L酒石酸钠溶液：100g/LKOH溶液：奈氏试剂：溶解HgI245.0g和KI35.0g于水中，将此溶液洗入1000ml容量瓶中，加入KOH112g，加水至800ml，摇匀，冷却定容，放置数日以后装入棕色瓶中备用。100ug/mlN（NH4+-N）标准液：称取烘干NH4Cl0.3817g溶于水中，定容为1000ml，此为100ug/mlN（NH4+-N）贮备液。用时吸上述溶液50ml，稀释至500ml，即为10ug/mlN（NH4+-N）工作液。试剂：操作步骤：取上述待测液5ml置于50ml容量瓶中加100g/L酒石酸钠溶液2ml，充分摇匀，再加入100g/LKOH溶液中和溶液中的酸（取一份待测液，以酚酞作指示剂，测定中和这份溶液所需KOH的ml数），加水至40ml，摇匀，加奈氏试剂2.5ml，用水定容后充分摇匀。

30分钟后用分光光度计比色，波长420nm。同时做空白。操作步骤：标准曲线的制作：分别吸取10ug/mlN（NH4+-N）标准液0、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50ml至于50ml容量瓶中，显色步骤同上样品测定。浓度溶液分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ug/mlN（NH4+-N），在420nm波长处比色。以空白消煮液显色后调零点。结果计算：N（%）=ρ·V·ts×10-4/mρ—显色液N（NH4+-N）的质量浓度ug/mlV—显色液体积(ml)ts—分取倍数m—干样品质量(g)10－4—将mg/L浓度单位换算为百分含量的换算因数标准曲线的制作：PE2400元素分析仪植物全氮的测定-元素分析仪PE2400元素分析仪植物全氮的测定-元素分析仪模态氦载气氩载气分析时间准确度（％）精度（％）准确度（％）精度（％）时间（分钟）CHN≤0.3≤0.2≤0.4≤0.36CHNS≤0.3≤0.2≤0.5≤0.48O（氧）≤0.3≤0.2≤0.4≤0.34元素分析范围（毫克）测定区域炉温（℃）C0.001－3.6燃烧100－1100H0.001－1.0还原100－1000N0.001－6.0裂解100－1100模态氦载气氩载气分析时间准确度（％）精度（％）准确度（％）精植物全磷的测定(H2SO4—H2O2消煮,钒钼黄比色法)试剂:钒钼酸铵溶液：25.0g钼酸铵［(NH4)6Mo7O24·4H2O］溶于400ml水中，另将1.25g偏钒酸铵(NH4VO3)溶于300ml沸水中，冷却后加入250ml浓HNO3。将钼酸铵溶液缓缓注入钒酸铵溶液中，不断搅匀，最后加水稀释到1L，贮入棕色瓶中。6mol/LNaOH溶液：24gNaOH溶于水，稀释至100ml。0.2%二硝基酚指示剂：0.2g2,6—二硝基酚或2,4—二硝基酚溶于100ml水中。磷标准液50mg/LP：0.2195g干燥的KH2PO4溶于水，加入5ml浓H2SO4，于1L容量瓶中定容，装入塑料瓶中低温保存。植物全磷的测定(H2SO4—H2O2消煮,钒钼黄比色法)操作步骤：

吸取定容后的消煮液10.00ml放入50ml容量瓶中，加2滴二硝基酚指示剂，滴加6mol/LNaOH中和至刚呈黄色，加入10.00ml钒钼酸铵试剂，用水定容50ml。15分钟后在波长450mm处进行测定，以空白溶液(空白试验消煮液按上述步骤显色)调节仪器零点。标准曲线：吸取50ug/LP标准液0、1、2.5、5、7.5、10、15ml分别放入50ml容量瓶中，按上述步骤显色，即得0、1.0、2.5、5.0、7.5、10、15ug/mlP的标准系列溶液，与待测液一起测定，读取吸光度，然后绘制标准曲线或求直线回归方程。操作步骤：结果计算：P（%）=ρ·V·ts×10-4/mρ—显色液P的质量浓度ug/mlV—显色液体积(ml)ts—分取倍数m—干样品质量(g)10－4—将ug/L浓度单位换算为百分含量的换算因数结果计算：四、

土壤碳氮磷的测定1土壤有效氮测定土壤有效氮包括无机态氮和部分有机物质中易分解的比较简单的有机态氮，即铵态氮、硝态氮、酰胺、氨基酸和易水解的蛋白质氮的总和，也称水解性氮。有机质含量越高，土壤熟化程度越好、有效氮含量也越高，反之也就越低。土壤有效氮能反映近期内土壤氮素供应状况，可为合理使用氮素肥料提供依据。土壤有效氮测定方法包括：碱解蒸馏法和碱解扩散吸收法。四、

土壤碳氮磷的测定1）碱解蒸馏法原理：

碱解蒸馏法适合于各种土壤，锌-硫酸亚铁还原剂能将硝态氮全部还原成铵态氮，并且水解，还原、蒸馏同时进行，加快了分析速度，提高了分析质量。测定原理：置土壤样品于半微量定氮装置中，用4mol/Ｌ氢氧化钠和锌－硫酸亚铁还原剂进行水解，蒸馏，并控制一定时间和蒸馏液体积，将硝态氮在锌一硫酸亚铁及碱性条件下被还原为氨而逸出，蒸馏出来的氨被吸收在硼酸指示剂溶液中。用标准酸滴定，从而计算氮的含量。1）碱解蒸馏法试剂锌一硫酸亚铁还原剂：称取硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)50g和锌粉10g分别磨细过０.25mm筛，用时按5：l比例混合，贮于棕色瓶中备用。氢氧化钠溶液：称取160g氢氧化钠溶于水，冷却后，稀释至lL。硼酸指示剂溶液：称取20g硼酸溶于水，稀释至lL。硫酸标准溶液：用10m1移液管吸取比重为1.84的浓H2S042.8ml，缓慢加入盛有200ml蒸馏水的烧杯中，冷却后移入1000ml容量瓶中定容刻度。在使用时稀释10倍，用Na2CO3

标定。

试剂操作步骤：

称取过０.25mm筛风干土样1.00-5.00g，放入蒸馏瓶内，加入4mol/LNaOH液。同时在蒸馏器的承接口上放一盛有10ml硼酸指示剂溶液的三角瓶，使冷凝管下端浸入硼酸溶液中，然后进行蒸馏。硼酸溶液转绿色后计时，蒸馏10min后，取下三角瓶，同时作空白实验。将三角瓶的溶液用0.0lmol/L硫酸标准液来滴定，溶液的颜色由兰绿色变为紫红色达终点，记下标准酸的体积。操作步骤：

称取过０.25mm筛风干土样12）碱解扩散法：原理：

在扩散皿中，土壤在碱性条件及硫酸亚铁存在下进行水解还原，易水解态氮和硝态氮可转化为氨，并扩散，为硼酸溶液所吸收。硼酸溶液吸收液中的氨，用标准酸滴定，由此计算碱解氮的含量。2）碱解扩散法：试剂：氢氧化钠溶液：称40g氢氧化钠，溶于水，冷却后，稀释至1L。硼酸指示剂溶液：称取20g硼酸溶于水，稀释至lL。硫酸标准溶液：用10m1移液管吸取比重为1.84的浓H2S042.8ml，缓慢加入盛有200ml蒸馏水的烧杯中，冷却后移入1000ml容量瓶中定容至刻度。硫酸亚铁粉末：将硫酸亚铁(FeSO4.7H20)化学纯)磨细过0.25mm筛，存于棕色瓶中。试剂：操作步骤：

称取过lmm筛风干土样2.00g，放入扩散皿外室，加入0.2g硫酸亚铁粉末，轻轻旋转扩散皿，使土样均匀地铺平。吸取2ml硼酸指示剂放入扩散皿内室，然后在扩散皿外室边缘涂上碱性胶液，盖上毛玻璃，旋转数次，使皿边与毛玻璃完全粘合。再渐渐转开毛玻璃一边，使扩散皿外室皿边留一条狭缝，迅速加入10.0ml氢氧化钠溶液，立即盖严，用橡皮筋固定毛玻璃，轻轻摇动扩散皿，使碱液与土壤充分混合。随后将扩散皿放入40℃±1℃恒温箱中，碱解扩散24h±0.5h取出。用硫酸标准溶液滴定内室吸收液中的氨。溶液由兰绿色变为微红色为滴定终点，记下标准酸的用量，在样品测定同时进行空白实验，校正试剂和滴定误差。操作步骤：

称取过lmm筛风干土样2.00土壤有效磷的测定土壤有效磷指易被植物吸收利用的水溶性磷和弱酸溶性磷。通常含量很少，不同类型的土壤，不同的耕作措施，对土壤中速效磷的含量有很大影响。测定土壤有效磷含量可以帮助我们了解土壤供磷能力，对合理施肥以及提高作物产量和品质具有重要参考价值。不同土壤中磷的存在形态不同，各种形态的磷能被植物利用程度也不同。因此，土壤中速效磷的测定，要考虑到两方面因素，即土壤因素和操作方法。

土壤有效磷的测定原理

测定土壤速效磷的方法，酸性土壤一般采用盐酸—氟化铵或氢氧化钠—草酸钠法来提取，石灰性土壤或中性土壤采用碳酸氢钠来提取。用NaHCO3

溶液(pH8.5)提取土壤速效磷，在石灰性土壤中提取液中的HCO3-

可和土壤溶液中的Ca2+

形成CaCO3

沉淀，从而降低了Ca2+

的活度而使某些活性较大的Ca—p被提取出来。在酸性土壤中因pH提高而使Fe—p，Al—P水解而部分被提取。在浸提液中由于Ca、Fe、Al浓度较低，不会产生磷的再沉淀。

原理钼锑抗法测定磷含量实验原理：用钼锑抗分光光度法测定磷。在一定酸度和锑离子存在的情况下，磷酸根与钼酸铵形成锑磷钼混合杂多酸，它在常温下可迅速被抗坏血酸还原为钼蓝。钼酸氨的作用是与磷酸生成磷钼酸铵，抗坏血酸或者氯化亚锡作用是使磷钼酸铵还原生成蓝色的钼蓝；而酒石酸锑钾中的锑离子可以使磷钼酸铵在室温下较容易被还原性不强的还原剂较快还原。

钼锑抗法测定磷含量实验原理：试剂0.5mol/LNaHCO3

浸提液

溶解NaHCO342.0g于800ml水中，加0.5mol/LNaOH溶液调节pH至8.5。可于液面加一层矿物油保存防止pH增高。若贮存超过1个月，应检查pH值是否改变。无磷活性炭

活性炭常含有磷，须先用2mol/LHCL浸泡过夜，用蒸馏水冲洗多次后，再用0.5mol/LNaHCO3

浸泡过夜，在平瓷漏斗上抽气过滤，每次用少量蒸馏水淋洗多次，并检查到无磷为止。若含磷较少，则直接用NaHCO3

处理即可。试剂钼锑抗试剂的配制1、称取10.0g钼酸铵溶于250ml60℃水中，冷却定容至300ml；2、将181ml浓H2SO4(分析纯)缓缓注入800ml水中，冷却，然后将稀硫酸注入钼酸溶液中，搅匀；3、称取0.3g.酒石酸锑钾，加入钼酸铵稀硫酸溶液中，用水定容至2升，此溶液称钼锑抗试剂，贮于棕色瓶中，可长期保存。

钼锑抗试剂的配制操作步骤称取过筛风干土样2.5g于150ml三角瓶中，加入0.5mol/LNaHCO3

溶液50ml，再加一勺无磷活性炭，塞紧瓶塞，在振荡机上振荡30min，立即用无磷滤纸过滤，滤液转至100ml三角瓶中，吸取滤液10ml（含磷量高时吸取2.5—5.0ml，同时应补加0.5mol/LNaHCO3

溶液至10ml）于150ml三角瓶中，再用滴定管准确加入蒸馏水35ml，然后用移液管加入钼锑抗试剂5ml，摇匀。放置30min后，用660nm或700nm波长进行比色。以空白液的吸收值为0，读出待测液的吸收值（A）。操作步骤标准曲线绘制：

分别吸取5mg/LP磷标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于50ml容量瓶中，再加入0.5mol/LNaHCO310ml，加水使各瓶的总体积达到30ml，摇匀；最后加入钼锑抗试剂5ml混匀显色，定容。同待测液一样进行比色，绘成标准曲线。最后溶液中磷的浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ppm。

标准曲线绘制：3.土壤有机碳的测定采用重铬酸钾外加热氧化法测定，在加热条件下，用过量的0.8M重铬酸钾—硫酸溶液，氧化土壤有机碳，多余的重铬酸钾用硫酸亚铁（0.8M）溶液滴定，由消耗的重铬酸钾量计算出样品中的有机碳含量。反应式如下：2K2Cr2O7＋3C＋8H2SO4——2K2SO4＋2Cr2(SO4)3＋3CO2＋8H2OK2Cr2O7＋6FeSO4＋7H2SO4——K2SO4＋Cr2(SO4)3＋3Fe2(SO4)3＋7H2O3.土壤有机碳的测定药品和试剂的配制

10.008mol·L-1K2Cr2O7标准溶液：称取经130℃烘干的重铬酸钾39.2245g溶于水中，定容于1000ml容量瓶中。

2浓硫酸(H2SO4

)。

30.2mol·L-1FeSO4溶液：称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）56.0g溶于水中，加浓硫酸5mL，稀释至1L。

4邻啡罗啉指示剂：称取邻啡罗啉1.485g与硫酸亚铁0.695g，溶于100mL水中。

52-羧基代二苯胺（C13H11O2N）指示剂：称取0.25g试剂于小研钵中研细，倒入100mL小烧杯中，加入0.18mol·L-1NaOH溶液12mL，并用少量水将研钵中残留的试剂冲洗入小烧杯中，将烧杯放在水浴上加热使其溶解，冷却后定容到250mL。

6硫酸银（Ag2SO4），研成粉末。

7二氧化硅（SiO2），粉末状。药品和试剂的配制操作步骤称取通过100目筛孔的风干土样0.1-1g，放入干燥试管中，用移液管准确加入0.8000mol/LK2Cr2O7

标准溶液5ml（如土壤中含有氯化物需先加Ag2SO40.1g），加入浓H2SO45ml充分摇匀，放入温度为185—190℃的石蜡或油浴锅中，要求放入后油浴锅温度下降至170—180℃左右，以后必须控制电炉，使油浴锅内温度始终维持在170—180℃，待试管内液体沸腾发生气泡时开始计时，煮沸5min，取出试管（用油浴法，稍冷，擦净试管外部油液）。操作步骤

冷却后，将试管内容物倒入250ml三角瓶中，用水洗净试管内部及小漏斗，三角瓶内溶液总体积为60—70ml，保持混合液中H2SO4

浓度为2-3mol/L，然后加入邻啡罗啉指示剂2-3滴，用标准的0.2mol/L硫酸亚铁滴定，滴定过程中不断摇动内容物，溶液的变色过程中有橙黄→蓝绿→砖红色即为终点。记取FeSO4

滴定毫升数（V）。每一批（即上述每铁丝笼或铝块中）样品测定的同时，进行2-3个空白实验，即取0.500g粉末二氧化硅代替土样，其他手续与试样测定相同。记取FeSO4

滴定ml数（V0

）,取其平均值。

冷却后，将试管内容物倒入250ml三角指示剂E0本身变色氧化—还原Fe2+滴定Cr2O72－时的变色氧化—还原特点二苯胺0.76V深蓝→无色深蓝→绿须加H3PO4；近终点须强烈摇动，较难掌握二苯胺磺酸钠0.85V红色→无色红紫→蓝紫→绿须加H3PO4；终点稍难掌握2-羧基代二苯胺1.08V紫红→无色棕→红紫→绿不必加H3PO4；终点易于掌握邻啡罗啉1.11V淡蓝→红色橙→灰绿→淡绿→砖红不必加H3PO4；终点易于掌握滴定过和中使用的氧化还原指剂有以下四种

指示剂E0本身变色Fe2+滴定Cr2O72－时的变色特点二苯有机碳的校正系数经典的干烧法或湿烧法，均为彻底氧化的方法。可将土壤中所有的有机碳均氧化为CO2，不需要一个校正系数。而加热重铬酸盐法，不能完全氧化土壤中的有机化合物，需要用一个校正系数去校正未反应的有机碳。一般来说，应用1.3校正系数（有机碳平均回收率为77%）在一定范围土壤上看来是最合适的，但应用于水稻土、沼泽土和长期渍水的各类土壤将会带来误差。

有机质含量的计算

我国目前多用“VanBenmmelen因数”1.724，即假定土壤有机质含碳58%计算的。但许多研究指出，对许多土壤此因数太低，低估了有机质的含量。

有机碳的校正系数土壤碳酸盐测定仪4.土壤无机碳的测定土壤碳酸盐测定仪4.土壤无机碳的测定五、植物组织中可溶性糖含量的测定

在作物的碳素营养中，作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。可溶性糖的作用：1、合成纤维素组成细胞壁或合成淀粉作为贮藏物质；2、转化并组成其他有机物如核酸、蛋白质、脂类物质等；3、分解释放能量，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。五、植物组织中可溶性糖含量的测定I苯酚法测定非结构性多糖测定原理：

糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10～100mg/L范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。

I苯酚法测定非结构性多糖试剂1.28％苯酚溶液：称取28g苯酚，加蒸馏水溶解并定容至100mL，在室温下可保存数月。2.浓硫酸（比重1.84）。3.1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，称取1.000g，加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。4.100μg/L蔗糖标准液：吸取1％蔗糖标准液lmL加入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容。

试剂1．标准液的制作向5mL离心管内加入1mL蔗糖标准液，0.5mL28％苯酚溶液，摇匀，再缓慢加入2.5mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为4mL，在室温下放置30min显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，调浓度旋钮使数字显示为标定值(100)。

1．标准液的制作2．蔗糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取约0.5g,放入研钵中研磨（加入石英砂和液氮有助于快速研磨）。选取20mg放入1ml80％酒精中过夜抽提。然后10000rpm离心3分钟，吸取上清液至离心管中。残渣再加入酒精，离心后一并倒入5ml离心管，定容至5ml。2．蔗糖的提取淀粉的提取

取剩余残渣，加入1ml盐酸于沸水中煮1.5---3小时，然后10000rpm离心3分钟，吸取上清液定容至5mL。

4．测定吸取1mL样品液于试管中，按顺序分别加入0.5ml苯酚、2.5ml浓硫酸溶液，混匀显色30分钟，再将被测溶液置于光路，则可显示出相应的浓度值。淀粉的提取结果计算可溶性糖含量（％）=C*VT/V1*W式中：C——光度计显示的数值，μg。VT——提取液体积，mL。V1——吸取样品液体积，mL。W——选取的鲜叶重量，g。

结果计算II蒽酮硫酸法原理

蒽酮试剂与糠醛化合物反应的生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定(620nm)。

蒽酮法不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。II蒽酮硫酸法

在测定水溶性碳水化合物时，应注意勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，否则会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。在测定水溶性碳水化合物时，应注意勿将样品的试剂1.80％乙醇。2.葡萄糖标准溶液（100μg/mL）：称取100mg葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100mL，使用时再稀释10倍（100μg/mL）。3．蒽酮试剂：称取1.0g蒽酮，溶于80%浓硫酸1000mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2～3周。

试剂1样品提取

称取50～100mg过100目筛的烘干样品，置于15mL试管中，加入6～7mL80％乙醇，在80℃水浴中提取30min，取出离心（3000rpm）5min，收集上清液。重复提取两次（各10min）同样离心，收集三次上清液合并于烧杯，置于85℃恒温水浴，使乙醇蒸发至2～3mL，转移至50mL容量瓶，以蒸馏水定容，供可溶性糖的测定。

1样品提取

向沉淀中加蒸馏水3mL，搅拌均匀，放入沸水中水浴15min。冷却后，加入2mL冷的9.2mol/L高氯酸，不时搅拌，提取15min后加蒸馏水定容至10mL，离心10min，上清液倾入50mL容量瓶。再向沉淀中加入2mL4.6mol/L高氯酸，搅拌提取15min后加水至10mL，混匀后离心10min，收集上清于容量瓶。然后用水洗沉淀1～2次，离心，合并离心液于50mL容量瓶用蒸馏水定容供测淀粉用。

向沉淀中加蒸馏水3mL，搅拌均匀，放入2.测定取待测样品提取液1.0mL于试管中，再加蒽酮试剂5mL，快速摇匀，然后在沸水浴中煮10min，取出冷却，在620nm波长下，用空白调零测定光密度，从标准曲线查出糖含量（μg）。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为620nm，故在此波长下进行比色。2.测定III碘-淀粉比色法原理对于淀粉含量较少的植株样品，也可采用碘–淀粉比色法。淀粉在加热情况下能溶于硝酸钙溶液中，当碘化钾和硝酸钙共存时，碘能以碘–淀粉蓝色化合物沉淀全部淀粉。将此沉淀溶于碱液，并在酸性条件下与碘作用形成蓝色溶液进行比色。

III碘-淀粉比色法试剂1．80％硝酸钙溶液。2．0.5％碘液：称5.00g结晶碘和10.00g碘化钾，放入研钵混合干研，然后加10mL蒸馏水研至全部碘溶解，将溶液全部转入1000mL容量瓶定容后，贮于磨口试剂瓶。3．5％含碘硝酸钙溶液：取10mL80％的硝酸钙溶液，加入160mL水再加入3mL0.5％的碘液混匀，现用现配。

试剂4．标准淀粉溶液：称取纯淀粉50mg于研钵中，加3mL80％硝酸钙溶液，研细并转移到100mL的三角瓶中，用15mL80％的硝酸钙溶液冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中。将三角瓶置于沸水浴中煮沸5min，冷却后全部转入50mL容量瓶中并定容。此液为1mg/mL的淀粉标准液。5．0.1mol/LNaOH。6．0.1mol/LHCl。4．标准淀粉溶液：称取纯淀粉50mg于研钵中，加3实验步骤

1．称取1～3g叶片，剪碎放入研钵，加5mL80％的硝酸钙溶液，研磨成糊状移入100mL的三角瓶中，用10mL80％的硝酸钙冲洗研钵，收集于三角瓶中，在沸水浴上煮沸3～5min，使样品中淀粉转变为胶体溶液。2．向三角瓶中加20mL蒸馏水，混合液转入离心管中离心(2000～3000rpm)2～3min，将离心后的淀粉溶液移入100mL容量瓶，三角瓶及离心沉淀物用5～10mL热蒸馏水冲洗并同样离心，离心液并入容量瓶中（共洗2～3次）定容，即为淀粉提取液。实验步骤3．取5～10mL淀粉待测液，加入到盛有2mL0.5％碘液的离心管中，混匀静置15min后离心（3000rpm）5min，弃上清液。沉淀用5％的含碘硝酸钙溶液冲洗两次，向冲洗后的沉淀中加入10mL0.1mol/L的NaOH混匀，将离心管浸入沸水内5min，使沉淀溶解。将溶液转入50mL容量瓶中，加入0.3mL0.5％碘液，用30mL左右的水冲洗并入容量瓶，加入2mL1mol/L的盐酸，用水定容并显色，在590nm波长处测定光密度。

3．取5～10mL淀粉待测液，加入到盛有2m4．绘制标准曲线取标准淀粉溶液（1mg/mL）0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6个离心管中，用80％硝酸钙溶液将各管的体积补足至5mL，再向各管加入2mL0.5％碘液，混匀静置15min后离心，其他操作同样品测定步骤，显色后在590nm波长下测定光密度。此系列溶液的淀粉含量分别为0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg，然后以光密度为横坐标，以淀粉含量为纵坐标绘制标准曲线。4．绘制标准曲线IV3,5–二硝基水杨酸比色法测定还原糖原理

3,5–二硝基水杨酸溶液与还原糖（各种单糖和麦芽糖）溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅的程度成一定比例关系。在540nm波长下测定棕红色物质的消光度值，查标准曲线，便可求出样品中还原糖的含量。

IV3,5–二硝基水杨酸比色法测定还原糖试剂1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取100mg葡萄糖（预先在80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，置冰箱保存备用。3,5-二硝基水杨酸试剂：

3,5-二硝基水杨酸6.3g，2mol/L的NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。

试剂实验步骤制作葡萄糖标准曲线

在7个管中分别精确加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,加水补至6.0mL，加入4.5mL3,5–二硝基水杨酸试剂，将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，以蒸馏水定容至25mL刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀(如用大试管，则向每管加入14.5mL蒸馏水，混匀)。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1～6号管的吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线，求得直线方程。实验步骤2.样品中还原糖的测定

（1）样品中还原糖的提取

准确称取3g食用面粉，放在烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。离心或过滤，用20mL蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在l00mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。

（2）显色和比色

向试管分别加入还原糖待测液2mL，3,5–二硝基水杨酸试剂1.5mL，与540nm波长下测定各管的吸光值。分别在标准曲线上查出相应还原糖毫克数，计算还原糖百分含量。

2.样品中还原糖的测定V斐林试剂比色法测定还原糖

原理植物组织中的可溶性糖可分为还原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非还原糖（主要是蔗糖）两类。还原糖具有醛基和酮基，在碱性溶液中煮沸，能把斐林试剂中的Cu2+

还原成Cu+

，使蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比，在590nm波长下比色测定吸光度，查标准曲线，即可计算出所测样品中还原糖的含量。本方法也可用于测定蔗糖及总糖含量。V斐林试剂比色法测定还原糖试剂1.斐林试剂A液：40gCuSO4·5H2O溶解于蒸馏水定容至1000mL。2.斐林试剂B液：200g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·5H2O）与150gNaOH溶于蒸馏水中，并定容至1000mL。

A、B两液分别贮存，使用前等体积混合。3.0.1％葡萄糖标准液：取80℃下烘至恒重的葡萄糖100mg，加蒸馏水溶解，定容至100mL。4.0.1mol/LNaOH。5.甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于250mL60％乙醇中。

6.10％Pb(Ac)2。7.饱和Na2SO4。试剂1.

标准曲线的制作取7支试管，按下表分别加入各溶液。将以上各管混合后于沸水浴中加热15min。取出后自来水冷却，1500r/min离心15min。取上清液，用分光光度计在590nm波长下比色，以蒸馏水作对照，读取吸光度。绘制标准曲线。

1.标准曲线的制作取7支试管，按下表分别加入各溶液。2.

样品中还原糖的提取

取新鲜的植物样品洗净、擦干、剪碎，称取3.00g放入研钵中研磨至糊状，用水洗入大试管中。体积为10～15mL时，加2～3滴甲基红指示剂，如呈红色，可用0.1mol/L的NaOH中和至微黄色。若用风干样品，可称取干粉3.00g，先在烧杯中用少量水湿润，然后用水洗入250mL容量瓶中，如显酸性，可用上法中和。

80℃恒温水浴中保温30min，其间摇动数次，以便将还原糖充分提取出来。对含蛋白质较多的样品，此间可加10％Pb(Ac)2

，除去蛋白质，至不再产生白色絮状沉淀时，加饱和Na2SO4

除去多余的铅离子。30min后取出冷却，将提取液全部转入100mL容量瓶中。定容，摇匀后过滤待测。

2.样品中还原糖的提取3.样品测定

吸取6mL待测液，加4mL斐林试剂，其他操作与标准曲线相同，在590nm波长下读取吸光度。以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度，在标准曲线上查出糖含量。

3.样品测定

第五讲生态化学计量学实验技术

生态化学计量学是研究生物系统能量平衡和多种化学元素（主要是C、N、P）平衡的科学。

生态化学计量学结合了生物学、化学和物理学等基本原理，通过研究生态过程中化学元素的比例关系，将复杂的生命现象简化为元素之间的配比和动态平衡，为研究C、N、P等元素在生态系统过程中的耦合关系提供了一种综合方法。第五讲生态化学计量学实验技术

生态化学计背景

生物科学研究方向出现窄化现象，阻碍了把整个生物界作为一个功能整体来进行研究，使得不同领域的联系变得更加困难。

窄化现象主要体现在两个方面：1、在生物组织的不同水平上（如分子、个体、种群和生态系统）。2、在特定的模式生物范围内（如线虫、水蚤、拟南芥、果蝇）或特定的生境中（如湖泊、森林、海洋和草地）。背景生物学科不同层次的研究在元素水平可统一起来生态化学计量学主要研究生态过程中化学元素的比例关系，将复杂的生命现象简化为元素之间的配比和动态平衡，使生物体（分子、细胞器、细胞和有机体）能够根据它们的元素组成加以明显区分。生态化学计量学能够将生物学科不同层次（分子、细胞、有机体、种群、生态系统和全球尺度）的研究理论在元素水平上统一起来，成为近年来新兴的一个生态学研究领域。生物学科不同层次的研究在元素水平可统一起来生态化学计量学主要研究元素陆地生态系统中的生态化学计量学主要关注碳、氮、磷三种元素的比率关系。

N、P作为植物生长的必需矿质营养元素和生态系统常见的限制性元素，一般植物蛋白质的16%是N，

核酸的9.5%是P，

这两个比例在不同来源的生物中相对稳定。因而氮磷含量的差异可以反映生物体中蛋白质和核酸含量的差异。C约占植物有机体干物质的50%左右,这一比例在生物的不同类群中随细胞的结构组成发生变化。生态化学计量学主要研究元素在植物个体水平，C、N、P的组成及分配是相互联系、不可分割的一个整体，它们的相互作用及与外界环境的关系共同决定着植物的营养水平和生长发育过程。如植物要获得C首先需要投资N到同化器官。同样,为了获得N，植物要投资同化的有机物到根系。

近年来由于人类活动的强烈影响，这三种元素的循环在速度和规模上都发生了前所