植物检疫技术课件

第四章检疫性有害生物（病原菌）检验检测技术

病原真菌病原细菌病原病毒病原线虫目的：发现、检出和鉴定有害生物，作为出证或检疫处理的依据方式：现场检查、实验室检验对检疫检验技术的要求①准确可靠，灵敏高度，能检出低量有害生物；②快速、简单、方便易行；③有标准化的操作规程，检验结果重复性好④安全，不扩散有害生物。样品数量（容量）大小依据有害生物的带有率;检验方法的灵敏度;检验所要求的精度;货物种类与特点;检验所允许的时间和花费等许多因素确定。有害生物的带有率越低，检验方法的灵敏度越低，检验精度要求越高，所需样品数量就越多。第一节植物病原真菌的检疫检疫技术病原真菌的属、种主要依据其形态特征鉴定，有时形态相似的近似种类需接种寄主，测定其致病性。鉴定病原真菌专化型和小种，也需接种鉴别寄主。除洗涤检验法的检验结果用单位重量种子的孢子负载量表示外，其它检验方法都能获得带菌百分率或发病百分率。一、直接检验

二、过筛检验

检验粮谷、种子、油料、干果和生药材，检验病粒，菌婴、菌核、病残体等种子过筛后可检出夹杂的菌瘿、菌核、病株残屑和土壤，都需仔细鉴别。小麦矮腥黑穗病的菌婴四、染色检验法

某些植物或植物器官被病原感染后，或某些病原菌本身，常可用特殊的化学药品处理，使其染上特有颜色，利于检出和区分病虫种类

影响洗涤检验的因素种子或其他粮谷类产品表面所黏附的病菌孢子不一定能完全洗涤下来;离心管内容已形成一层极难沉降的孢子薄膜。管壁也可能黏附孢子;视野内孢子分布不均匀;操作不规范，不严格。

七、分离培养检验主要应用于检验潜伏于种子、苗木或其他之物产品内部，不易发现和鉴定的病原菌；当种子、苗木或其他植物产品上虽有病斑，但无特殊的病原菌可供鉴定的场合。第二节病原细菌的检疫检验技术

植物细菌病害有软腐、环腐、萎蔫、溃疡、疮痂、枝枯、叶斑、组织增生（瘿瘤、发根）等多种症状。叶片上病斑常呈水渍状，上有细菌溢脓。病部切片镜检可见细菌溢。田间诊断――了解病害和寄主的群体特征，即病害在田间发生的情况，以及当地的作物栽培及耕作情况。初步诊断――通过肉眼观察植株的症状、病原分泌物以及镜检观察。例如水稻细菌性条斑病－取一小块病叶组织，低倍镜下观察，微管束有喷菌现象。

进一步诊断

分离培养：选择新鲜的病斑或病键组织交界处――表面消毒――清水洗净――碾碎稀释――划线培养――观察致病性测定：目的是区分致病性细菌和腐生菌。

过敏性反应(Hypersensitivereaction,HR)是指病原细菌在非寄主植物上引起枯斑反应的现象，腐生性细菌则不表现典型的枯斑。操作：细菌溢脓或分离纯化细菌――自然或人工接种――观察针刺接种法接种甘蓝叶片中肋如确系该菌，则接种部位软腐、维管束褐变切片置于1.5％水琼脂平板上，在28℃和黑暗条件下培养3d生理生化及快速测定法生化测定试剂盒：Biolog测定：酶联免疫吸附技术(ELISA)--酶联免疫吸附测定(Enzymelinkedimmunologyassay,ELISA)是把抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起来的一种综合技术。血清学检测技术血清学检测技术ELISA的测定方法:直接法、间接法、竞争法、酶抗酶法、双夹心法、双抗体夹心法等6种。ELISA的特征:灵敏度高，特异性强，安全、快速并易观察。它可进行定性定量测定，适于大批量样品的检查、可用于病害普查，口岸检疫和产地检疫等。免疫荧光技术分子检测技术特异性基因或DNA序列用于检测病原菌分子检测试剂盒生物学检测技术

鉴别寄主检测--以鉴别寄主反应或指示植物为依据的方法。曾广泛运用，目前却由于其检测速度慢、受环境和季节影响较大等诸多因素限制，而运用较少。电了显微镜观察目前通常认为运用负染和超薄切片电镜观察能诊断和鉴别植物病毒，一般可诊断到属的水平。免疫学检测法快速免疫滤纸测定法(Rapidimmunoafterpaperassay,RIPA)免疫胶体金技术(Immune

colloidal

gold

technique)分子生物学检测方法

多聚酶链式反应(PCR)分子信标(Molecularbeacon)杂交诱捕PCR-ELISA原理实时荧光PCR原理

核酸斑点杂交技术分子生物学和免疫学相结合检测方法免疫捕获反转录PCR（ImmunocapturereversetranscriptPCR,IC-RT-PCR）第四节植物病原线虫的检疫检验技术植物病原线虫是躯体很小，而内部又有各种较复杂器官的低等动物，再加上其一些特殊的分布和生物学习性等，检测方法有所不同。罹病样品的采集及保存方法罹病植物――采集有明显症状的地上或地下部分土壤样本――20－30cm耕作层的土壤，定点或棋盘式多点采样。保存方法――所有材料均应装入塑料袋中保湿，及时分离或4度低温保存。植物寄生线虫的各种分离方法直接解剖法--内生线虫在体视显微镜下用解剖针直接解剖病组织简易贝尔曼漏斗法:分离少量植物材料中有活动能力的线虫。浸入漏斗12h清洗材料切成小段收集线虫裹纱布浅盘法卡勃过筛分离法――本法用于从大量土壤中分离各类线虫。检疫性线虫的一般检验程序及注意事项程序：根据习性进行分离杀死和固定制作玻片显微测量线虫的主要特征种内鉴定――查阅文献，结合主要特征鉴定。A幼虫B.幼虫头部C.幼虫侧区D.二龄幼虫体前部E.雄虫体前部F.雄虫尾部注意事项正确判别玻片种线虫的体位――前提群体的概念――同一种线虫，因寄主、营养及环境条件的变化，种内虫体间有一定的变异范围。因此，要仔细观察，测量较多的数量，防治把种内变异鉴定位不同的种。