分子发光分析法优选ppt资料

分子(fēnzǐ)发光分析法第一页，共99页。第二页，共99页。§5-1概述(ɡàishù)一、分子(fēnzǐ)发光分析法及其分类某些物质的分子(fēnzǐ)吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子(fēnzǐ)发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子(fēnzǐ)发光分析法较高激发态基态吸收能量受激光辐射退激分子在退激过程(guòchéng)中以光辐射形式释放能量第三页，共99页。根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下(yǐxià)几类：光致发光：以光源来激发而发光

电致发光：以电能来激发而发光生物发光：以生物体释放的能量激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法荧光(yíngguāng)—荧光(yíngguāng)分析法磷光—磷光分析法第四页，共99页。二、分子发光(fāɡuānɡ)分析法的特点1.灵敏度高荧光强度随激发光强度增强(zēngqiáng)而增强(zēngqiáng)（提高激发光强度，可提高荧光强度）

采用高灵敏度的检测系统(xìtǒng)可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低2~4个数量级激发发射荧光强强激发光物质第五页，共99页。2.选择性好不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长比较容易排除其它物质的干扰，选择性好3.实验方法简单4.待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广具发光强度可定量(dìngliàng)测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。第六页，共99页。应用还不够广泛，尚待拓宽。荧光法比磷光(línɡuānɡ)法应用广泛，但均不如分光光度法广泛。许多物质自身不会发射荧光（需衍生），且荧光分析对环境极为敏感：温度、酸度、溶解氧、重金属等均会产生影响或干扰。第七页，共99页。§5-2分子荧光(yíngguāng)和分子磷光

molecularfluorescenceandphosphorescence一、荧光和磷光光谱的产生(chǎnshēng)（一）激发过程具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁产生(chǎnshēng)荧光和磷光

电子基态第一电子激发态转动能极跃迁振动能级跃迁电子能级跃迁第八页，共99页。在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子(diànzǐ)（、n电子(diànzǐ)）处于不同的自旋状态，通常用电子(diànzǐ)自旋状态的多重性来描述1、光谱项的多重型：M＝2S+1（1）单重态M=2S+1＝1（自旋相反）S＝0分子能级=电子能级(Ee)+振动(zhèndòng)能级(Ev)+转动能级(Er)。S0,S1,S2,S3分别代表基态(jītài),第一,二,三激发单重态（2）三重态M=2S+1＝3（自旋平行）S＝1T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态第九页，共99页。2、处于基态的分子吸收能量(néngliàng)后发生跃迁：第十页，共99页。当物质受光照射(zhàoshè)时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变（相反），净自旋=0，这种跃迁是符合光谱选律的允许跃迁，S0→S1若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变（平行），由基态(jītài)单重态→激发三重态，净自旋0。这种跃迁为禁阻跃迁，S0→T1第十一页，共99页。平行自旋比成对自旋稳定(wěndìng)(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；S0S2S1T1第十二页，共99页。第十三页，共99页。（二）去活过程(guòchéng)（去激过程(guòchéng))Deactivation）电子(diànzǐ)处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径(tújìng)，发生的几率大，发光强度相对大。第十四页，共99页。1、无辐射去激不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热的形式(xíngshì)释放（1）内部转换（IC，InternalConversion）当两个电子能级非常靠近以至(yǐzhì)其振动能级有重叠时，相同的多重态之间的转换，S2→S1、T2-T1（2）振动驰豫（VR，VibrationalRelaxation）同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程。速率(sùlǜ)极大，10-14~10-12s完成。无论分子被激发到哪个激发单重态，均通过内转换和振动弛豫，跃回第一激发单重态的最低振动能级。第十五页，共99页。（3）系间窜跃(ISC，IntersystemConversion)不同多重态,有重叠的转动能级,通过自旋(zìxuán)-轨道耦合改变电子自旋(zìxuán),不同的多重态之间的非辐射跃迁，禁阻跃迁.S1→T1（4）外部转移（ExternalConversion，EC）指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用而转移能量，使荧光或磷光强度减弱或消灭（猝灭）发生系间窜跃电子需转向，S1～T1间进行，比内部转换困难第十六页，共99页。T1S0ISCVRVRIC吸光吸光S0S1S2VR：振动驰豫IC：内部转换ISC：系间窜跃第十七页，共99页。2.辐射(fúshè)去激—产生荧光和磷光光谱（1）荧光(yíngguāng)当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级→基态S0各振动能级（多为S1→S0跃迁）所产生的辐射叫荧光荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭由于各种去活化(huóhuà)过程的存在，无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，荧光辐射能通常要比激发能量低，荧光波长比激发光波长长。荧激>第十八页，共99页。T1S0ISCVRVRIC吸光吸光荧光图5-1分子荧光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫IC：内部转换ISC：系间窜跃第十九页，共99页。（2）磷光(línɡuānɡ)由第一激发三重态的最低振动能级→基态(T1→S0跃迁(yuèqiān)）产生a.电子由S0→T1的可能过程：（禁阻跃迁(yuèqiān)）S0→激发→振动弛豫→内转移S→系间跨越T→振动弛豫→T1b.从T1S1要改变电子自旋，发光速度慢，约为10-4~10s，光照停止后，磷光仍可持续一段时间c.分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长磷>荧>激

*易产生荧光n*易产生磷光第二十页，共99页。T1S0ISCVRVRIC吸光吸光荧光磷光图5-1分子荧光、磷光光谱(guāngpǔ)产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫IC：内部(nèibù)转换ISC：系间窜跃VR第二十一页，共99页。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫第二十二页，共99页。二、激发光谱和荧光、磷光(línɡuānɡ)光谱1、激发光谱荧光和磷光均为光致发光，合适(héshì)的激发光波长需根据激发光谱确定Iex固定em荧光波长固定测量(cèliáng)波长为荧光（或磷光）最大发射波长em，然后改变激发波长，根据激发光波长ex对荧光（磷光）强度I作图得激发光谱曲线。

激发：excitated发射：emission

激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大第二十三页，共99页。激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这是因为分子(fēnzǐ)吸收光能的过程就是分子(fēnzǐ)的激发过程。激发光谱曲线：I～ex吸收(xīshōu)曲线：A～两者在性质上是不同的Iex固定em荧光波长第二十四页，共99页。Iem固定(gùdìng)ex激发光波长固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系(guānxì)曲线，以I为纵坐标，em为横坐标得左图，即荧光物质的发射光谱从曲线上找出最大的em2.发射光谱(guāngpǔ)－荧光光谱(guāngpǔ)(或磷光光谱(guāngpǔ))由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质第二十五页，共99页。从图中看出(kànchū)磷＞荧＞激吸收峰荧光峰磷光峰第二十六页，共99页。第二十七页，共99页。3.激发光谱与发射光谱(fāshèɡuānɡpǔ)的关系a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关不管激发波长如何，分子受激后可到达(dàodá)不同能层的激发态，但通过去活化（内转换和振动弛豫），电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。第二十八页，共99页。三维荧光(yíngguāng)光谱图第二十九页，共99页。c.镜像规则(guīzé)基态(jītài)上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似。激发：基态→第一(dìyī)激发态各振动能级，振动能级越高，能级差越大，波长就越短。发射荧光：从第一(dìyī)激发态的最低振动能级→基态的各振动能级，基态的振动能级越高，其能量差越小，波长就越长。吸收光谱中能级越高波长越短，发射光谱中能级越高，波长越长。互为镜像第三十页，共99页。基态上的零振动能级与第一激发态的振动能级之间的跃迁几率(jīlǜ)最大，相反跃迁也然。第三十一页，共99页。第三十二页，共99页。二、荧光(yíngguāng)、磷光与分子结构的关系（内因）产生并可观察到荧光的条件：i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；ii）量子效率足够大：（一）荧光效率（荧光量子产率、量子效率）衡量物质(wùzhì)发射荧光的能力

荧光量子效率f=发荧光的分子数激发态分子总数f是一个物质荧光特性的重要参数，反映(fǎnyìng)了荧光物质发射荧光的能力，f越大，荧光越强，在0~1之间第三十三页，共99页。若以各种跃迁速率常数来表示Kf为荧光发射过程的速率常数——取决于物质的化学结构∑Ki为非辐射跃迁的速率常数之和——主要取决于化学环境，也与化学结构有关分析上有应用(yìngyòng)价值的荧光化合物的荧光效率在0.1~1之间第三十四页，共99页。（二）荧光与分子结构的关系(guānxì)（内因）1、跃迁类型通常，具有*和n*跃迁结构的分子才能吸收紫外可见光，产生荧光

具有π—π*跃迁的量子效率比n—π*跃迁的要大得多（前者ε大、寿命短）总之，跃迁(yuèqiān)是产生荧光的主要跃迁(yuèqiān)类型。第三十五页，共99页。常选用某些荧光分子作探针(tànzhēn)，通过探针(tànzhēn)分析荧光的变化研究DNA与小分子及药物的作用机理，从而探讨致病原因及筛选和设计新药。（5）荧光(yíngguāng)自猝灭具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越大，越易产生荧光(yíngguāng);环越多，共轭程度越大，产生荧光(yíngguāng)波长越长（红移），发射的荧光(yíngguāng)强度越强（2）磷光(línɡuānɡ)ii）量子效率足够大：（1）内部转换（IC，InternalConversion）由于系间跨越跃迁，分子由单重态跃迁至三重态，转入三重态的分子在室温下不发光，易与其它分子碰撞(pènɡzhuànɡ)而使荧光猝灭，若发射发射则为磷光。基态上的零振动能级与第一激发态的振动能级之间的跃迁几率(jīlǜ)最大，相反跃迁也然。在气相中O3能氧化NO、乙烯等产生化学发光，原子氧也能氧化NO、SO2、CO等产生化学发光。例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强f与荧光效率的影响因素相同，既取决于发光体本身的结构和性质，也受环境的影响第七十三页，共99页。自吸现象(xiànxiàng)：内滤光中的一种，化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；氧化剂（H2O2）ex/nmem/nm第六十四页，共99页。2、共轭效应具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越大，越易产生荧光(yíngguāng);环越多，共轭程度越大，产生荧光(yíngguāng)波长越长（红移），发射的荧光(yíngguāng)强度越强fex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲线状环结构(jiégòu)比非线状结构(jiégòu)的荧光波长长第三十六页，共99页。芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光多环芳烃是重要(zhòngyào)的环境污染物，可用荧光法测定3，4-苯并芘是强致癌物ex=386nm

em=430nm第三十七页，共99页。3、刚性平面结构(jiégòu)—较稳定的平面结构(jiégòu)具有强荧光(yíngguāng)的分子多数有刚性平面结构，可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也减少了碰撞去活的可能性，荧光(yíngguāng)强度大。荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面(píngmiàn)上，具有平面(píngmiàn)结构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质第三十八页，共99页。例1，2-二苯乙烯反式：平面(píngmiàn)构型强荧光体顺式：非平面(píngmiàn)构型非荧光体第三十九页，共99页。4、取代(qǔdài)基效应——取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：（1）增强荧光的取代基——有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等给电子基团由于基团的n电子（孤对电子）的电子云与苯环上的轨道平行，共享了共轭电子，扩大(kuòdà)了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强第四十页，共99页。（2）减弱荧光的取代基——-COOH、-NO2、-COOR、-NO、-SH吸电子基团,使荧光波长短移，荧光强度减弱芳环上被F、Cl、Br、I取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应(xiàoyìng)为重原子效应(xiàoyìng)。第四十一页，共99页。重原子(yuánzǐ)效应溶液中若含有原子序数较高的重原子的分子或离子，如溴化物、碘化物等，导致(dǎozhì)容易发生系间跨越效应称重原子效应。其原因是重原子的电子自旋和轨道运动间的相互作用变大，原子核附近产生磁场，使单重态向多重态系间跨越的几率增加。含重原子的化合物荧光很弱，甚至无荧光，但磷光增强。第四十二页，共99页。（3）影响不明显(míngxiǎn)的取代基——-NH3+、-R、-SO3H等第四十三页，共99页。（三）金属(jīnshǔ)螯合物的荧光大多数无机盐类金属离子，不能产生(chǎnshēng)荧光，但某些螯合物都能产生(chǎnshēng)很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定不少有机配体是弱荧光体或不发荧光，但与Mn+形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生(chǎnshēng)荧光例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强第四十四页，共99页。三、影响荧光强度的因素(yīnsù)（外因）1.溶剂的影响同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大

2.温度的影响——低温下测定，提高灵敏度因为辐射跃迁的速率基本(jīběn)不随温度变，而非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。温度对磷光影响更大第四十五页，共99页。3.pH的影响(yǐngxiǎng)大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光(yíngguāng)性质受溶液pH的影响很大共轭酸碱对是具有不同荧光(yíngguāng)性质的两种型体，具有各自的荧光(yíngguāng)效率和荧光(yíngguāng)波长例：苯酚(běnfēn)离子化后，荧光消失pH≈1有荧光pH≈13无荧光第四十六页，共99页。但两个苯环相连(xiānɡlián)的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光例：—苯酚(běnfēn)有荧光(yíngguāng)无荧光另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性第四十七页，共99页。4.内滤光作用(zuòyòng)和自吸现象自吸现象(xiànxiàng)：内滤光中的一种，化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射(fāshè)的荧光，如色氨酸中的重铬酸钾；第四十八页，共99页。5、溶解氧的影响(yǐngxiǎng)溶液中的氧分子可使荧光溶液发射的荧光强度降低甚至熄灭。其原因较为复杂(fùzá)。溶解氧几乎对所有的有机荧光物质均有不同程度的熄灭作用，对芳香烃尤为显著。第四十九页，共99页。6、荧光(yíngguāng)猝灭——荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞(pènɡzhuànɡ)后使荧光强度下降或荧光效率f下降称为荧光猝灭。使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂猝灭类型有：第五十页，共99页。（1）碰撞猝灭（动态(dòngtài)猝灭）处于单重态的荧光分子M*与猝灭剂分子Q碰撞(pènɡzhuànɡ)，使M*以无辐射跃迁方式回到基态，产生猝灭。M非辐射跃迁M+热碰撞猝灭第五十一页，共99页。（2）静态(jìngtài)猝灭（组成化合物的猝灭）部分荧光物质与猝灭剂生成非荧光的配合物。这一过程往往还会引起(yǐnqǐ)物质吸收光谱的改变。第五十二页，共99页。（3）转入(zhuǎnrù)三重态的猝灭由于系间跨越跃迁，分子由单重态跃迁至三重态，转入三重态的分子在室温下不发光，易与其它分子碰撞(pènɡzhuànɡ)而使荧光猝灭，若发射发射则为磷光。第五十三页，共99页。（4）发生电子(diànzǐ)转移反应的猝灭猝灭剂与荧光分子相互作用时发生了电子转移引起的猝灭。如：甲基蓝溶液的荧光被Fe2+离子猝灭I-、Br-，S2O32-等易于(yìyú)给出电子的阴离子，使奎宁、罗丹明等荧光猝灭。第五十四页，共99页。（5）荧光(yíngguāng)自猝灭单重态激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质碰撞，浓度(nóngdù)较高时常发生。第五十五页，共99页。四、荧光强度与荧光物质浓度(nóngdù)的关系用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀(A<0.05)时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面(xiàmian)的关系If=fIa=f（I0-I）Ia为吸收(xīshōu)的辐射强度I0为入射光强度荧光池I0IIf荧光强度检测器If=f（I0-I010-A

）

=fI0

（1-10-A

）I=I010-A将上式展开第五十六页，共99页。当A﹤0.05时，方括号中其它(qítā)各项与第一项相比可忽略不计，上式简化If=2.3fI0A=2.3fI0εbc当A﹤0.05时，If与f、I0、和c有关(yǒuguān)，对一给定物质，当激发光波长和强度一定时，f、I0、ε和b为常数，合并为KIf=KC

定量分析(dìngliàngfēnxī)依据第五十七页，共99页。荧光强度与物质浓度呈线性关系，If=KC只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高浓度高时，If与C不呈线形关系，有时C增大，If反而降低(jiàngdī)因为公式[]中后面影响，有时发生荧光猝灭效应If=

fI0

（1-10-A

）=fI0

（1-10-εbc

）第五十八页，共99页。（一）荧光分析仪器——主要(zhǔyào)由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成与分光光度计有两点不同①两个单色器②检测器与激发(jīfā)光互成直角光源第一单色器激发单色器液池检测器第二单色器发射单色器检测器放大器及记录器exemI0I五、荧光(yíngguāng)和磷光分析仪器第五十九页，共99页。第六十页，共99页。1、光源(guāngyuán)激发光源(guāngyuán)一般要求比吸收测量中的光源(guāngyuán)有更大的发射强度；适用波长范围宽荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用(chánɡyònɡ)其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250~800nm很强的连续光源第六十一页，共99页。激光(jīguāng)诱导荧光LIF，laserinductivefluorescence第六十二页，共99页。2、单色器大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱第一(dìyī)单色器作用：激发单色器，分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长ex。第二单色器作用：发射单色器，滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长em。在选定的em下测定荧光强度，定量分析第六十三页，共99页。3、样品(yàngpǐn)池盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能(zhīnénɡ)用手拿棱或最上边4、检测器荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可大大提高荧光强度5、读出装置记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱第六十四页，共99页。同步荧光(yíngguāng)光谱1971年Lloyd首先提出(tíchū)用同步扫描技术来绘制光谱图，即同时扫描激发单色器和发射单色器波长的条件下测绘光谱图。所得的荧光强度I和波长曲线为同步荧光光谱。第六十五页，共99页。同步扫描(sǎomiáo)技术根据激发(jīfā)和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种：1、固定波长差同步扫描荧光法＝ex-em＝常数2、固定能量差同步扫描荧光法使发射单色器与激发(jīfā)单色器之间保持一个恒定的波数差3、可变波长同步扫描荧光法使两单色器在扫描过程中以不同的速率同时进行扫描第六十六页，共99页。同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠(chóngdié)，提高分辨率。

合适的可减少光谱重叠(chóngdié)：酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠(chóngdié)，但<15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱；>60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。第六十七页，共99页。六、荧光(yíngguāng)光谱法与紫外-可见分光光度法比较（一）相同点（二）不同点第六十八页，共99页。磷光分析法phosphorescence与荧光相比，磷光的特点：1、磷光寿命比荧光长2、磷光辐射的波长(bōcháng)比荧光长（一）磷光强度：Ip＝KC（二）温度对磷光强度的影响试样需在液氮温度（77K）或液氦（4K）下测定第六十九页，共99页。（三）磷光分析仪器(yíqì)与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1.试样室试样需在液氮温度（77K）或液氦（4K）下测定－低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）固体表面室温磷光分析需特制试样室2.磷光镜有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械(jīxiè)切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。第七十页，共99页。磷光仪器在荧光仪样品池上增加磷光配件：低温杜瓦瓶和斩光片。如右图所示。斩光片的作用是利用(lìyòng)其分子受激所产生的荧光与磷光的寿命不同获取磷光辐射第七十一页，共99页。（四）室温磷光低温荧光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制，1974年后发展了室温磷光（RTP）。1）固体基质室温磷光在室温下以固体基质（如纤维素等）吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。2）胶束增稳室温磷光利用表面(biǎomiàn)活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。3）敏化溶液室温磷光第七十二页，共99页。（二）荧光(yíngguāng)分析法的应用1.无机化合物的分析无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定(cèdìng)的为数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达70多种，其中较常采用荧光法测定(cèdìng)的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素能够同金属离子形成荧光(yíngguāng)配合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物，形成五元环或六元环的螯合物，分子的刚性平面结构增大，变为强荧光(yíngguāng)体荧光(yíngguāng)猝灭法也是荧光(yíngguāng)分析中经常采用的方法。可采用荧光(yíngguāng)猝灭法间接测定的离子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等第七十三页，共99页。2.有机(yǒujī)化合物的分析脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应(fǎnyìng)后才能进行荧光分析芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃——荧光分析法是最主要的测定方法可测定结构复杂的大量有机物质(wùzhì)，如：各种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等第七十四页，共99页。3、基因(jīyīn)研究及检测遗传物质DNA自身的荧光效率很低，一般检测不到其荧光。常选用某些荧光分子作探针(tànzhēn)，通过探针(tànzhēn)分析荧光的变化研究DNA与小分子及药物的作用机理，从而探讨致病原因及筛选和设计新药。典型的荧光探针(tànzhēn)分子：溴化乙锭（EB）、吖啶类染料。第七十五页，共99页。例：3，4–

苯并芘为强致癌物质煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧垃圾都会产生3，4–苯并芘，汽车尾气也是主要来源食品加工过程也会产生3，4–苯并芘，尤其(yóuqí)是烟熏、油炸、烘烤食品第七十六页，共99页。例：VB2——又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物(dòngwù)肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和海藻中。在低浓度情况下，I=KC，I与C呈线性关系，在pH6~7荧光最强在430~440nm蓝光照射下，发出绿色荧光，em=535nm下测I，用标准曲线法测定缺VB2会得口角炎、舌炎(shéyán)、唇炎、脂溢性皮炎维生素B2第七十七页，共99页。（三）磷光分析法应用(yìngyòng)能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧光(yíngguāng)分析普遍，但磷光分析法已在药物分析、临床及环境分析领域得到一定的应用。低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳烃及含O、S、N的杂环化合物分析固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。农药、生物碱、植物生长激素的分析烟碱、降烟碱、新烟碱等分析第七十八页，共99页。第七十九页，共99页。§5-3化学发光分析法

Chemiluminescence,CL一、概述化学发光是吸收化学反应所释放化学能而使分子发光所建立的分析方法化学发光与荧光(yíngguāng)的主要区别：受激发时所需的能量来源不同，需要化学反应过程中所提供的化学能第八十页，共99页。化学发光分析具有(jùyǒu)以下特点灵敏度高——例：用荧光素酶和三磷酸腺苷ATP的化学发光反应，可测定低至2×10-17mol·L-1ATP线性范围宽——一般(yībān)有5~6个数量级仪器设备简单，成本低廉分析速度快，易实现自动化局限性：可供发光用的试剂有限发光机理有待进一步研究第八十一页，共99页。二、化学发光分析(fēnxī)的基本原理（一）化学发光反应的基本条件发光反应必须满足以下条件1.化学反应必须产生足够的化学能化学发光基于化学反应提供足够的能量A+B→C*+D产物接受反应能被激发(jīfā)C*→C+h在可见光区观察化学发光，需170~300kJ·mol-1激发(jīfā)能。具有过氧化物中间产物的氧化还原反应可满足要求。化学反应多是在有O3、H2O2等参加的氧化还原反应中2.要有有利的化学反应历程。3.处于激发(jīfā)态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态第八十二页，共99页。（二）化学发光效率(xiàolǜ)和发光强度1、化学发光效率(xiàolǜ)CL激发态分子(fēnzǐ)的化学效率激发态分子的发光效率r取决于发光所依据的化学反应本身f与荧光效率的影响因素相同，既取决于发光体本身的结构和性质，也受环境的影响第八十三页，共99页。2、化学(huàxué)发光强度具有高效率的化学发光是生物体中，亦称生物发光。如：萤火虫发光反应的效率几乎(jīhū)接近100%，非生物体的化学发光效率一般不超过1%。化学发光强度ICL（t）与反应速度、化学发光效率有如下关系对下列(xiàliè)化学发光反应A+B→C*+D

C+hICL随时间和反应物消耗的变化逐渐减小第八十四页，共99页。A+B→C*+DA为待测物质，C为发光物质，当反应物B的浓度远远过量于待测物浓度时，B的浓度可认为是常数。因此(yīncǐ)，发光反应可视为一级反应t时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度(nóngdù)成正比化学发光总强度与分析物浓度(nóngdù)呈线性关系。常用发光总强度来定量分析发光(fāɡuānɡ)总强度第八十五页，共99页。三、化学发光反应(fǎnyìng)的类型1.液相化学发光——研究和应用的比较广泛的有：鲁米诺、光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。鲁米诺是最常用的发光试剂，它可以测定Cl2、HClO、ClO-、H2O2、O2和NO2，产生化学发光反应时量子效率为0.01~0.05鲁米诺（3–氨基苯二甲酰环肼）在碱性(jiǎnxìnɡ)溶液中和H2O2等氧化剂反应生成最大波长为425nm的光辐射第八十六页，共99页。氧化剂（H2O2

）425nm反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于激发状态，返回基态时发射(fāshè)荧光可检测低至10-9mol·L-1的H2O2第八十七页，共99页。鲁米诺H2O2的化学反应，可以被一些(yīxiē)痕量的过渡金属元素所催化，使发出的光大大增强，由此可测定Co（Ⅱ）,Cu（Ⅱ）,Ni（Ⅱ）,Cr（Ⅲ），Fe（ⅡⅢ），Ag（Ⅰ），Au（Ⅲ），Mn(Ⅱ)，Hg（Ⅱ）Os（ⅢⅣⅤ），Ru（Ⅵ），V（Ⅳ），Ir（Ⅳ）等金属离子，检测限由0.01~40