液相色谱培训教案

41/41液相色谱培训讲义(十)作者：

转载自：

公布日期：2007-5-22第十一章柱子的应用与维护色谱柱的液相色谱系统获得分离的中心部件，许多分离问题都归结于色谱柱。对柱注意适当的维护，则可缓解许多故障的发生。柱故障要紧是由机械、色谱或者化学方面的缘故引起的。维护色谱柱和排除故障，；需要明白得液相色谱的分离过程以及色谱柱本身的构造是特不重要的。色谱柱的价格昂贵，应幸免人为地损坏，并尽可能延长其寿命。一、色谱柱的种类与评价一般地讲，依照样品的性质决定采纳何种液相色谱方法，然后再选择不同类型的柱。即不同类型的柱则代表了不同的色谱方法。不同种类色谱柱的差异在于柱结构、柱填料和柱尺寸的不同。色谱柱有不同的尺寸(长度和内径)，分制备型、常规分析型和微型。不同类型柱的硬件也不同，(包括接头、柱管等方面)，还有径向加压柱和夹套加热柱等。不同液相色谱法的尺寸依照需要能够选取，一般分析3～30cm长，内径4～8mm。常用20cm长、4.6mm内径的柱。制备型柱内径一般为8mm、25cm长。微型柱内径l～3mm，长10～20cm。不同的填料分析的效果可能不同，这是因为生产过程不同所致。同一厂商生产的同种填料因批号不同也会有差异，这种差异可能从基质就开始(表面积、杂质、专门处理)，还有键合的化学物质(一氯或三氯硅烷反应剂)，不同厂家生产的填料还会因专利技术(预处理、键合过程、填装技术)等不同而呈现较大差异。由于种种差异、仅能假设同一批号的柱有差不多相同的性质。多数柱填料基质采纳多孔硅胶微粒，通常有球形和无定形两种，具有不同的粒度、孔径和表面积。多孔聚合物微粒也适用于反相色谱。聚合物柱的流淌相范围广，流淌相pH值可在1至13之间。而硅胶基质pH仅能在2.5和7之间。显然，聚合物柱要好一些，但目前仍是以硅胶基质的柱为主。原则上，聚合物柱能够克服硅胶基质柱的某些不足，但需要大量的实验来证实，要进一步考查聚合物基质填料的全面优越性。在实际工作中，选择性能良好的柱可得到好的结果，首先要注意柱径、长度、填料种类和填料粒度。评价柱的好坏不仅只是N数，还应考虑组分在柱上的保留、键合相表面的物性、柱压降以及峰不对称因子As等。每一根新柱都应标出详细参数，要紧内容包括公司名称、柱名称(商标)、柱填料、尺寸。附一张标准参考色谱图，并标出色谱条件、样品名称、流淌相组成、流速、柱温、进样体积、检测器、峰的保留时刻及峰名称等。评价一根色谱柱的要紧指标是：①塔板数N值；②峰不对称因子As；③柱压降；④键合相浓度。二、色谱柱预防性爱护与柱寿命的延长通常，一根色谱柱在分析数千个样品之后性能仍然保持良好，但也有的柱仅分析不多的样品后几乎就报废了。阻碍柱寿命和其它问题的因素专门多，而有些因素是操作者专门难操纵的，假如被分析的样品(如分析生物样品)，如何净化样品也是“脏”的，关于色谱柱的阻碍是特不大的。然而采取下列措施后，在多数情况下总能够人为地减少柱上故障，达到延长寿命的目的。1、加流路过滤器和爱护柱流路过滤器紧靠进样阀后面，位于分析柱前。0.5μm烧结不锈钢片夹在死体积专门小的套子中，挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒入柱。因为每个样品都过滤既费事又带来误差，样品量少过滤更困难，因此流路上装过滤器是比较省事的方法。也能够在流路加上爱护柱，放在流路过滤器和分析柱之间，或者代替流路过滤器。爱护柱的使命是收集堵塞柱进口的来自样品的化学“垃圾”。这种垃圾最终降低柱效能。爱护柱是消耗品，分析50～100个比较脏的样品之后就要调换新的。爱护柱应该是小体积，用分析柱的同种填料填装。爱护柱使用得当，对分离无阻碍，看起来未装爱护柱一样。有些厂商的商品将爱护柱和流路过滤器连在一个单元内，使用起来特不方便。自己填装爱护柱差不多上用短柱、不超过3cm长，内径2～3mm，用较大粒度的填粒(15～20μm)干法填装，会使分析柱效略微有所降低。2、幸免高压冲击一般色谱柱都能经得起高压，但经不起突然变化的高压冲击。引起高压突然冲击，要紧是因样品阀的缓慢转动、泵起动快、柱切换操作等。转动六通进样阀时从泵到柱的液流会瞬时切断。在阀的泵侧压力升高，在阀的柱侧压力降低(变化超过20％)。阀转到底后压力突然冲击一下恢复正常。手动进样阀的变化不大，自动进样阀比较慢，可能造成压力冲击，可用氦气代替空气驱动进样阀。因氮压缩系数小。另外泵起动不应过快，可分步操作。如用3mL／min流速，先从lmL／min到2mL／min，然后再3mL／min，每个间隔应大于20s。柱切换技术的应用也专门广泛，切换过程中在色谱柱的入口处压力在零到专门大数字之间变化，会专门快使柱报废。3、分离条件多数色谱柱有专门宽的试验条件范围，但具体应用又受到限制，要紧是pH值、柱和气流淌相的选择。硅胶为基质的键合相要求PH在2.5～7之间，极端pH的流淌相能“溶解”硅胶，使键合相流失。结果非碱性组分的保留不断减少，碱性组分的保留增加，引起碱性组分峰变宽。假如一定要用高或低pH的流淌相，可加预柱(饱和柱)。预柱装在泵和进样阀之间，用分析柱相同的填料填装，或者用一般硅胶。硅胶饱和了流淌相，减少了分析柱填料的损失。预柱不要求柱效高，用价格低的一般硅胶疏松地填装，按期检查硅胶的溶解情况。用预柱也有不利的阻碍，即新流淌相难以平衡，保留时刻不稳定或稳定慢。使用了预柱一定要加流路过滤器，以防止硅胶微粒引起的苦恼。以硅胶为基质的柱和阴离子交换柱超过60℃后，会增加对流淌相中化学物质的吸附。在高温下用小颗粒柱引起柱床塌陷，降低柱效，改变峰形。在40℃以上使用3μm柱，70℃以上使用5μm柱，会使值降低50％。有些流淌相中的溶剂不能用于某些柱，如小颗粒的聚苯乙烯填料不能用于非水的排阻色谱。另一方面，有些柱与某些溶剂(如四氢呋喃)一旦达到平衡，不要随意改用其它溶剂。有关这些专门填料，能够参见有关资料。水溶性流淌相会引起微生物生长而造成堵塞柱。色谱柱应存放在纯有机溶剂或加了50％有机溶剂的水中。凝胶柱可存放在水溶性缓冲液中，同时加0.01％叠氮钠以防止微生物的生长。4、净化样品用溶剂溶解的样品，多数组分在一定的时刻内能完全从柱中流出来，可不能造成危害。有些样品可能含有微粒物质，样品中的某种组分(如蛋白质)在柱头上沉积下来，组分在固定相上保留专门强，溶剂带走柱填料等，这些都会造成柱效能下降或对柱寿命的阻碍，有必要采取措施防止柱变坏。如在光线照耀下观看样品是浑浊的或带有乳白色，进样前必须要过滤．尽管流路上装有过滤器和爱护柱，但不能代替样品的前处理，样品中过多的微粒会使过滤器和爱护柱超载，专门快堵塞，或者微粒进入分析柱，因此在进样前必须过滤样品。若怀疑样品与流淌相混合有沉淀而对色谱柱有堵塞，应先试验一下，看样品溶液加入流淌相中有无变浑或乳白色出现。假如进样后压力突然增加而后又慢慢减小，表明样品中有微粒或发生沉淀。如有沉淀要设法改变分离条件，包括换样品溶剂和流淌相或处理样品去掉不溶物质。应尽量用小体积的样品。有些样品能专门强地吸附在柱填料上，如此会降低塔板数，改变样品的保留物质外，还要加爱护柱，定期清洗色谱柱。有时因为疏忽，用对柱有害的溶剂溶解样品，比如用6mol／L的氢氧化钠溶解样品，如此的样品只要进50～100μL到硅胶基质柱中，硅胶就专门快溶解而使柱报废。在这种情况下，应立即中和样品，或除去原溶剂中的有害成分。5、用强溶剂定期冲洗柱每次工作结束，用强溶剂冲洗柱是良好的适应。可用甲醇、乙腈冲反相柱，冲去留在柱上的强吸附组分。用甲醇水为流淌相时也应冲洗。冲洗的程序在以下章节中介绍。柱头的烧结不锈钢滤片，要求平坦，死体积小，孔径适当(2～5μm)。过滤片选择不行会改变色谱峰形，增加阻力或起不到阻挡污染物的作用(填料专门快变色)。此外，对柱硬件的保养也不可忽视．实际操作中应注意以下几点：①接头要配套，用同一厂商的组接件；②接头之间、柱压帽螺母与密封卡套之间无微粒(填料)，否则收紧时容易咬死；③密封卡套与柱管一次性卡紧后再也不能松动，因此拆开柱头再上紧时要小心，不能使卡套移动，原来柱端的不锈钢滤片和垫片的厚度和强度也不能改变(改变这些附件的性能就促使卡套移动；④接头等组接件不要拧得过紧，适当上紧后接上泵试验，分步拧紧，直到不漏为止．还有特不重要的是柱硬件的损坏往往会造成不可挽回的损失。综上所述，如何爱护良好的柱性能与柱寿命：O认真阅读色谱柱使用讲明书；O使用填充良好的色谱柱；O尽量减少压力波动，幸免机械及热冲击；O使用爱护柱及在线过滤器；O经常以强溶剂冲洗色谱柱；O充分过滤样品及流淌相，尽量幸免杂质微粒与强保留成分；O用稳定的固定相(C18最稳定)：O在中等pH值操作时(6～8)，用有机缓冲溶液；O色谱柱使用温度最好小于40℃；O硅胶基质的色谱柱，应保持流淌相的pH值范围在3.0～8.0；O在水流淌相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠；O流淌相中含有缓冲溶液，应注意用95：5的水及有机溶剂过滤，有机溶剂不能低于5％；O过夜或贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流淌相保存(乙腈最好)。三、如何样选择色谱柱现代高效液相色谱中，分离效果好坏专门大程度上取决于色谱填料的选择。然而色谱填料的选择范围专门宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。1.硅胶基质填料（1）正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica)以及其他具有极性官能团，如胺基团(NH2APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流淌相极性相对比固定相低，如：正己烷(Hexane)、氯仿(Chloroform)、二氯甲烷(MethyleneChloride)等。（2）反相色谱反相色谱用的填料常是以硅胶为基质表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流淌相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱的顺序是极性较强的组份最先被冲洗出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS)、C4(butyl)、C6H5(Phenyl)等。2.聚合物填料聚合物填料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯等，其要紧优点是在pH值为1~14均可使用。相关于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离特不有效。现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。3.其它无机填料其它HPLC的无机填料色谱柱也差不多商品化。由于其专门的性质，一般仅限于专门的用途。如，石墨化碳正逐渐成为反相色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体，又由于在HPLC流淌相中可不能被溶解，这类柱可在任何pH与温度下使用。氧化铝也用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可制成稳定色谱柱柱床，其优点是可在pH高达12的流淌相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也专门强，应用范围受到一定的限制，因此未能广泛应用。新型氧化锆基质色谱填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用pH范围1~14，温度可达100℃。由于氧化铝填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。四、如何样选择填料粒度目前，商品化的色谱填料粒度从1μm到超过30μm均有售，而目前分析分离要紧用3、5和10μm填料，填料的粒度要紧阻碍填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填充柱的柱效越高；然而粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于3μm的填料应用。在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。假如固定相选择是正确，然而分离度不够，那么选用更小粒度的填料是专门有用的。3μm填料填充柱的柱效比相同条件下的5μm填料的的柱效提高近30％；然而，3μm的色谱柱的背压却是5μm的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下能够选用更短的色谱柱，以缩短分析时刻。另外，能够采纳低粘度的溶剂做流淌相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。名称不名功能基团正相反相离子对应用Silica√非极性和中等极性以及非离子性有机化合物SASC1-OH√在所有的烷基键合相中对非极性于中等极化合物保留最弱；典型用于中等极性和多官能团化合物。BμtylC4-(CH3)3√√分离肚和蛋白质，保留时刻比C8和C18短。MOSC8,Octyl-C4H9√√中等极性到强极性化合物，小肽和蛋白质，极性药物、甾族环境样品。ODSC18-C8H37√√烷基键合相中对中等极性化合物保留最强。广泛用于药物、甾族化合物、脂肪酸和环境样品。CPSCN,Cyano(Propylnitrile)-(CH2)3CN√√对极性化合物有独特的选择性，适合应用于正相分离。当用于反相系统时，其选择性与C8和C18不同。在药学领域和复杂混合物的分离中应用广泛。APSNH2(Aminopropy)-(CH2)3NH2√√反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交换，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性剂做流淌相。正相中与硅胶的选择性不同，分析芳香族效果专门好。Phenyl-(CH3)C3H5√√芳香族化合物Diol-(CH2)2OCH2(CH2OH)2√√反相时，分离肽和蛋白质。正相时，与硅选择性相似，但极性较弱SCX强阳离子次换-(CH2)2C6H4SO3H-√有机碱SAX强阴离子交换-(CH2)3N+（(CH3)3√有机酸、核苷和核苷酸五、如何选择爱护柱如何样选择爱护柱，但又不阻碍分离分析?这是色谱工作者经常提出的一个问题。通常，在选择爱护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁。关于大部分分析工作者来讲，一支lcm长的爱护柱便能提供对柱子的爱护，工作中发觉要经常更换1cm的爱护柱，那么应选择2cm或3cm长的爱护柱。爱护柱越长，自然所装填的色谱填料越多，则其越能幸免污染物进入分析色谱柱的机会。因此，随着爱护柱的长度加长，样品的保留时刻会比使用短爱护柱长。一般来讲，爱护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可。爱护柱的填料装填方式也专门重要。目前有薄膜装填法的爱护柱，使用过程专门简单方便，而且能够在实验室中进行干装。然而，其最大的缺点是不经济，特不是针对中国的具体情况，一次性使用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保扩性所装填的色谱填料有限，只能提供专门有限的爱护作用；只是也因为所装填的色谱填料较少，爱护柱的长度也较短，因此对分析样品的保留时刻的阻碍也专门小。另一种爱护柱结构事实上质是缩短了的色谱分析柱，设计方式上有直连式、手紧式或整体式。整体式设计是由色谱柱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的，必须与色谱分析柱一同订货，能够特不方便地使用，但不能够被修改。直连式结构设计可在任何时候由色谱工作者来安装连接，能够与任何品牌的色谱分析柱连接使用，而且还能够依照样品的相关情况选择不同的爱护柱一样，只是在连接时不需要借助扳手等工具，直接用手上紧即可。另外从爱护柱结构的角度看，爱护柱的结构又分为是否能够更换爱护柱柱芯。现在大多数的爱护柱均能够更换爱护柱柱芯，能够降低爱护柱的使用成本。大多数人是依照色谱分析柱的填料选择爱护柱的填料，正常情况下能够选择与分析色谱柱一样的色谱填料。然而，依照实际的分析工作，也可不必与分析色谱柱的填料完全相匹配。关于选择爱护柱的原则是：在满足分析分离要求的前提条件下，尽可能地选择较短的爱护柱结构，尽可能选择对分离样品小一些保留性的填料。六、故障与解决的方法选样了一根好的柱子，再加上有效的维护与预防，能够幸免许多意外故障的发生。因此谁也不能爱护色谱柱“永久”不出故障，任何一根色谱柱最终都会因为柱效下降直到报废。柱损坏的标志是：①塔板数下降；②峰形改变；③压力增加；④保留时刻变化。有时往往是几种情况伴随着同时发生。1、塔板数下降在色谱柱使用过程中，塔板数会不断下降．一般情况下，进2000个样品后柱效N值要降低50％，(但也不能一概而论)，而用C18，柱梯度分析氨基酸，进100个血清样品之后，柱效就下降50%。这两种情况的差不之因此这么大，关键在于处理样品的方法不同。假如柱效专门快下降，应考虑上节所提到的人为不利因素。N值突然下降(如一个工作日内)，应考虑柱头塌陷或进了不合格的样品。假如使用了不同系统的色谱柱造成柱效下降，是某系统中存在柱外效应。新建立的方法中柱效下降，可能是样品和其它内在因素引起，现在要采取相应措施，防止接着给柱造成危害。2、峰形变坏出现拖尾峰、分叉峰或非高斯峰的缘故专门多，但总是与塔板数突然下降联系在一起的。峰形变坏而保留时刻不变，多半是柱受到堵塞(不锈钢烧结片)，或者柱头有了空穴。3、压力增加和柱塔板数不断减少一样，在使用过程中柱压慢慢增加，可视为正常。假如压力一下子增加过高，应考虑两种可能，一是样品沉积在柱内，二是柱内硬件堵塞(未考虑系统其它部分的堵塞)。关于第一种情况，要用能溶解所用样品的溶剂冲洗。冲洗时拆开柱与检测器之间接头，正向冲洗或将柱出口接在泵上反向冲洗(假如柱条件许可)，使用大约30～50mL溶剂。不要让冲洗液通过检测器流淌池，以防污染。在冲洗过程中不断检查，直到压力恢复正常为止。如冲洗无效，应该考虑是第二种情况，先换烧结不锈钢过滤片，拆下柱，拧开柱头上的压帽，持垂直方向小心取出不锈钢过滤片，换上新的(不是洗过的旧滤片)。换滤片时尽量不要搅动柱头填料，如有塌陷，可用同种填料中乙醇调成糊状补平柱头，压紧，压平，柱性能可恢复如前。假如柱头填料己脏，可挖去2～3mm，用新填料补平。4、保留时刻的改变保留时刻的变化指两种类型的情况，第一种是同一根柱样品间的保留变化，第二种类型要紧是填料的差异造成的，许多实验都会碰到，现讨论如下。不同牌号的色谱柱分离的色谱峰保留时刻可在小范围内移动，但峰的顺序和分辨率不变，可改变流速或溶剂强度(反相色谱加水调节)进行校正。假如谱图中色谱顺序发生了变化，或者两峰重叠在一起，问题就比较严峻。保留时刻发生大的变化，要紧由柱填料硅酸相互作用所致，另外有次级保留因素的阻碍。硅胶为基质的填料表面含有硅醇，有的封尾填料可部分去掉硅醇、不封尾填料的硅胶表面硅醇基更多。酸性或碱性分子可与硅醇发生不同程度的相互作用。硅酸与样品分子作用的强弱，因不同批号的硅胶和不键合相填料而异。即使同批号的硅胶而不同批号的键合相也有差异。硅醇对阳离子或碱性样品阻碍最大。参照下列要求做能够减少色谱柱之间保留时刻的变化。(1)仅用同一厂商的柱。实际上不具可操作性，但最起码作某一专门分析方法时要用同一厂商的柱。(2)设计分离条件，使保留值变化最小(建立标准的方法)。(3)选用液相色谱系统或色谱柱对次级保留因素(外界)灵敏度最低。(4)换新柱时调整分析条件保持旧柱的保留值(改变条件)。这一步工作是必不可少的，在长期的常规分析中，可不能从头至尾用一根柱，中间总要换新柱，每换一次，都应认真地调整各组分的保留。在实际工作中，应考虑到可能会发生什么问题，如何样预防这些问题的发生。第一，前面提到的作某一专门分析尽量用同一批号的柱。也可与厂商接洽，提出专门的要求。第二，选择硅醇阻碍最小的分离条件，减少柱间的差异。如在流淌相中添加三乙胺抑制硅醇的作用。第三，许多色谱工作者认为，在流淌相中加入离子对试剂更能抗硅醇的干扰，使保留具有更好的重复性。不管什么情况下引起保留值的明显变化，都应该改善分离条件。改善特不差的峰的分离度，并使保留值稳定下来。例如用梯度洗脱分析体液中的氨基酸，这种复杂的样品有20多个组分，保留稍有变化可能对分离就产生灾难性的结果。一些极端组分，如偏向酸性或碱性的组分专门易发生保留值的改变，应用不同流淌相的组成、pH值和缓冲液的浓度，能够改善关键色谱峰间的分离。色谱峰分离度变差，可能会系统地改变保留值。塔板数降低、压力增高、峰形变差、保留值变化可能同时发生，可能差不多上由柱引起的。下表的内容可关心找到一些故障的缘故，有些内容将在后面的章节中详细讨论。表11-1由柱引起的故障故障现象解决方法过滤片堵塞柱头塌陷键合相流失样品堵塞强吸附的样品压力增高，N下降，峰形差峰分叉，N下降保留改变，峰形差，N下降高压N下降，保留减小倒柱冲洗或换过滤片修补柱头，可恢复80％以上换柱用能溶解样品的溶剂冲洗柱强溶剂反冲七、延长柱寿命的方法一根柱到了不可使用的时候应更换。“不可挽救”那个概念在许多色谱工作者的认识上不完全相同，有人认为只有当柱的压力增高到系统不可承受的地步才考虑报废，只要压力在可同意的范围内总要设法修补，以延长柱的寿命。．另外也能够从分析高要求的样品改作分析低要求的样品，从分离多组分的样品改作分离单组分的样品，从分离介质复杂的样品改为分离介质相对简单的样品。实验室最常用的延长柱寿命的方法是修补柱头、换不锈钢烧结片，冲洗、倒冲柱。修补柱头和换不锈钢结片常联系在一起，前面已简单作了叙述。去掉过滤片后发觉柱头塌陷或填料被污染，可用无水乙醇调成糊状的同种填料(挖去脏填料)填补柱头，用与柱内径相同的、顶端平而光滑的不锈钢或聚四氟乙烯棒压紧，再填平，再压紧，反复3～5次，最后用无水乙醇将柱头四周润湿几次，擦洁净柱外壁的填料、加上新过滤片，拧紧接头，接上泵冲洗，而后再接检测器。假如塌陷专门深，或者挖去的脏填料专门多，填平柱头后接上泵冲洗15min，再拆下柱填平，再接上泵冲洗，反复数次可恢复大部分柱效。有时还应该用比较高的流速才能有效。修补过的柱一般不能恢复到原先的柱效，刚开始修补数次效果不错，随着修补次数的增多，维持一个短时刻又要修补，到了后期，键合相随硅胶的溶蚀而流失，加上化学物质的腐蚀，现在再也无法修补了。对价格高的柱一定坚持自己动手修补。如排阻色谱柱不随时刻而改变保留，仅需比较低的分离条件，稍为修补就可解决问题。倒冲柱也是经常采纳的维护措施，不提倡新柱倒冲柱。色谱柱用到中后期，而且修补过多次后才考虑逆向反冲。可在倒冲柱前填平原柱头的塌陷现冲洗，也可倒向冲洗后再填平柱头(原柱出口)，后者效果好一些。柱逆向使用后柱效损失较大(约40％～60％)，常常能够倒过来再倒过去，只要不破坏柱床，效果还不错。倒冲柱前要检查柱两端的烧结过滤片情况，防止烧结过滤片(原柱头承受过度压力，填料被泵打出)。在采取以上措施时，冲洗过程应伴随始终。有少数实验室自己装柱，或请厂商装柱。柱硬件差不多上用过的旧柱，这可节约50％的经费，但有时也碰到一些苦恼。柱内壁未经再抛光处理，柱壁效应比较大，分辨率降低，或者拖尾峰。重装柱后卡套易松动，整个柱头渗漏。可借助于聚四氟乙烯软膜密封，但已不能承受较高的压力。对有些柱重新处理是值得的，但有些则无价值。除考虑价格外，还要考虑实际工作要求。任何柱都能够修补数次，样品处理好、流淌相和气、压力中下能够减少修补柱的次数。柱压升高超过系统所承受的限度就要报废柱。实验室内要备有不同类型的散装填料(C18、硅胶)，用同类型、同粒度的填料修补柱头效果好。假如手头没有所要求的填料，能够用其它填料代替，这比用柱头塌陷的柱要好得多。八、如何解决色谱柱使用过程出现的问题1.保留值与分离度重现性不行缘故分析问题缘故表现不同色谱柱间差异使用期间柱变化填料、键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解强保留组分堆积堵塞保留因子(k)，分离因子(α)柱效(N)保留因子(k)，分离因子(α)柱效(N)保留因子(k)，柱效(N)柱外效应系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。柱效（N)分离效果变差流淌相组分改变流速改变温度改变保留因子(k)，柱效变化专门小保留因子(k)，分离因子（α）保留因子(k)，柱效变化专门小柱平衡慢重新平衡时刻不够保留因子(k)，柱效变化专门小柱超载样品量太大保留因子(k)，柱效(N)液相色谱培训讲义(十一)作者：

转载自：

公布日期：2007-5-22八、如何解决色谱柱使用过程出现的问题1.保留值与分离度重现性不行缘故分析问题缘故表现不同色谱柱间差异使用期间柱变化填料、键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解强保留组分堆积堵塞保留因子(k)，分离因子(α)柱效(N)保留因子(k)，分离因子(α)柱效(N)保留因子(k)，柱效(N)柱外效应系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。柱效（N)分离效果变差流淌相组分改变流速改变温度改变保留因子(k)，柱效变化专门小保留因子(k)，分离因子（α）保留因子(k)，柱效变化专门小柱平衡慢重新平衡时刻不够保留因子(k)，柱效变化专门小柱超载样品量太大保留因子(k)，柱效(N)2.造成色谱峰(不对称)拖尾的缘故(1)色谱柱本身填装问题，筛板堵塞或填料塌陷(2)柱头有污染(3)样品超载(4)样品溶剂不合适(5)柱外效应(6)化学或二次保留(硅羟基)效应(7)缓冲容量不足或不合适(8)重金属污染3.如何解决峰形拖尾的问题A、与化学有关的拖尾问题(1)流淌相中，加入30mM的三乙胺(用于碱性化合物)或醋酸胺(用于酸性化合物)，未知化合物加醋酸三乙胺；(2)如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲辛胺）；(3)降低进样量到<1μg。B、与色谱柱有关的拖尾问题(l)如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96％的二氯甲烷与4％甲醇，加l％氢氧化铵混合液冲洗；正向柱可用甲醇冲洗；(2)使用爱护柱；C、与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽(1)进样体积过大，(通常≤25μL)：(2)进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大(最佳连接管应<20cm，内径为0.007″)；(3)检测器流通池的体积过大。4.如何贮存色谱柱(1)防止缓冲溶液和水溶液流淌相产生微生物，做到流淌相用多少配多少，或在水流淌相中加20ppm叠氮钠以抑制细菌生长(一定当心其毒性和潜在的爆炸性)；或在流淌相中加20％的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流淌相脱气。(2)尽可能将色谱柱贮存于100％有机溶剂(乙腈最好)中，幸免在缓冲液中保存。(3)使用缓冲液后的色谱柱，应用15～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水-有机溶剂流淌相冲洗色谱柱换成100％有机溶剂贮存。(4)幸免用纯水冲洗键合致密的C18柱。(5)将色谱柱两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。九、谱图问题液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来，其中有一些问题能够通过改变设备参数得到解决，而其他的问题必须通过修改操作程序来解决，关于色谱柱和流淌相的正确选择是得到好的色谱图的关键。A、峰拖尾缘故解决方法1、筛板堵塞1、a、反冲色谱柱b、更换进口筛板c、更换色谱柱2、色谱柱塌陷2、填充色谱柱3、干扰峰3、a、使用更长的色谱柱b、改变流淌相或更换色谱柱4、流淌相pH选择错误4、调整pH值。关于碱性化合物，低pH值更有利于得到对称峰5、样品与填料表面的活性点发生反应5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰b、更改色谱柱B、峰前延缘故解决方法1、柱温低1、升高柱温2、样品溶剂选择不恰当2、使用流淌相作为样品溶剂3、样品过载3、降低样品含量4、色谱柱损坏4、见A1、A2C、峰分叉缘故解决方法1、爱护柱或分析柱污染1、取下爱护柱再分析。也可更换爱护柱。拆下来清洗。假如问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，可运用适当的再生措施。若还不行，可能是入口处堵，能够更换筛板或色谱柱。2、样品溶剂不溶于流淌相2、改变样品溶剂，假如可能，采取流淌相作为样品溶剂D、含量高的成分峰缘故解决方法1、样品溶剂选择不恰当1、减少样品载量E、早出的峰变形缘故解决方法1、样品溶剂选择不恰当1、a、减少进样体积b、运用低极性样品溶剂F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰缘故解决方法1、柱外效应1、a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）b、使用小体积的流通池G、K′增加时，脱尾更严峻缘故解决方法1、二级保留效应，反相模式2、a、加入三乙胺b、加入乙酸c、加入盐或缓冲剂d、更换一支柱子2、二级保留效应，正相模2、a、加入三乙胺b、加入乙酸c、加入水d、试用另一种方法3、二级保留效应，离子对3、加入三乙胺H、酸性或碱性化合物的峰拖尾缘故解决方法1、缓冲不合适1、a、使用浓度50-100mmol/L的缓冲液b、使用Pka等于流淌相PH值的缓冲液I、额外的峰缘故解决方法1、样品中有其他组分1、正常2、前一次进样的洗脱峰2、a、增加运行时刻或梯度b、使用pH等于流淌相pH的缓冲液3、空位或鬼峰3、a、检查流淌相否纯净b、使用流淌相作为样品溶剂c、减少进样体积J、保留时刻波动缘故解决方法1、温控不当1、重新设定柱温2、流淌相组分变化2、防止变化（蒸发、反应等）3、色谱柱没有平衡3在每一次运行之前给予足够的时刻平衡色谱柱K、保留时刻不断变化缘故解决方法1、流速变化1、重新设定流速2、泵中有气泡2、从泵中除去气泡3、流淌相选择不恰当3、a、更换合适的流淌相b、选择合适的混合流淌相L、差不多漂移缘故解决方法1、柱温波动（即使是专门小的温度变化都会引起基线的波动。通常阻碍示差检测器、电导检测器较高灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）1、操纵好柱子和流淌相的温度，在检测器之前使用热交换器。2、流淌相不均匀。（基线向上漂移，流淌相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移）。2、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流淌相在使用前进行脱气，使用过程中用氦气3、检测器内流通池被污染或有气体3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池，如有需要，能够用1mol的硝酸（不要用盐酸）。4、检测器出口堵塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）4、取出堵塞物或更换管子。参考检测器手册换流通池窗。5、流淌相配比不当或流速变化5、更改配比或流速。为幸免那个问题可定期检查流淌相组成及流速。6、柱平衡慢，物不是流淌相发生变化时6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流淌相时，在分析前用10-20倍体积的新流淌相对柱子进行冲洗。7、流淌相污染、变质或由低质量溶剂配成7、检查流淌相的组成。使用高质的化学试剂及HPLC级的溶剂。8、样品中有强保留的物质（高K′值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。8、使用爱护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。9、使用循环溶剂，但检测器未调整。9、重新设定基线。如循环溶剂已超阶级出检测器动力学范围，使用新的流行动相。10、检测器没有设定在最大汲取波长。10、将波长调整至最大汲取波长处。M、基线噪音（规则的）缘故解决方法1、在流淌相、检测器或泵有空气1、流淌相脱气，冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。2、漏液2、见第三节。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。3、流淌相混合不完全3、用手摇动使混合均匀合均匀或使用低粘度的溶剂4、温度阻碍（柱温过高，检测器未加热）4、减少差异或加上热交换器5、在同一地线上有其他电子设备5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。6、泵脉冲6、在系统中加入脉冲阻尼器液相色谱培训讲义(十二)作者：

转载自：

公布日期：2007-5-22N、基线噪音（不规则的）缘故解决方法1、漏液1、见第三节。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查检测器流通池是否漏液。2、流淌相污染、变质或由低质溶剂配成2、检查流淌相的组成。3、流淌相各溶剂不相溶3、选择互溶的流淌相4、检测器内有气泡4、断开检测器的记录仪的电源，检查并更正。5、系统内有气泡5、用强极性溶液冲冼系统6、检测器内有气泡6、冲洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流淌池8、检测器灯能量不足8、更换灯9、色谱柱填料流失或堵塞9、更换色谱柱10、流淌相混合不均匀或混合器工作不正常10、维修或更换混合器，在流淌相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置。O、峰变宽缘故解决方法1、流淌相组成变化1、重新制备新的流淌相2、流淌相流速太低2、调节流速3、漏液（特不是在柱子和检测器之间）3见第三节。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及正常的噪音。假如必要更换密封。4、检测器设定错误4、更改检测器参数设置5、a、柱子过载b、检测器响应时刻过长或池体积过大c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径大d、模数转换频率过低5、a、小体积进样，稀释样品b、减少响应时刻或使用更小的流通池c、使用内径为0.007-0.01”的管路d、将模数转换频率增大6、缓冲液离子强度太低6、增加离子强度7、爱护柱污染或失效7、更换爱护柱8、色谱柱污染或失效，塔板数降低8、更换同样类型的色谱柱。9、柱头污染或塌陷9、更换柱子10、呈现两个或多个未被完全分离的峰10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果11、柱温过低或柱温不均匀11、选择设计合理的柱温设备,提高柱温。12、检测器响应时刻太大12、使用较小的响应时刻P、分离度降低缘故解决方法1、流淌相污染或变质（引起保留时刻变化）1、重新配制流淌相2、爱护柱或分析柱2、取下爱护柱再分析，也可更换爱护柱，若问题仍然存在，可能是柱子被强留物质污染，再生色谱柱，若问题仍然存在,更换色谱柱。Q、所有的峰面积都变小/变大缘故解决方法1、检测器衰减设定过高/低1、减少/增加衰减的设定2、检测器响应时刻太大2、设定较小的响应时刻3、进样量太少/过多3、增大/减小进样量4、输出连接不当4、使用正确的连接十、色谱柱工作程序1.1新购的色谱柱（分析柱）须建立档案才能启用。1.2柱子的选用，原则上一根色谱柱只能用于同类物质的分析。1.3使用色谱柱时，应在色谱柱前加同种填料和规格的爱护柱（预柱）1.4色谱柱与预柱一经使用，就应该标明方向，不可倒过来使用。1.5柱子（预柱或分析柱）的连接1.5.1预柱、分析柱与管路的连接，总的原则是要尽量幸免死体积的增大。因而，在拧紧螺丝前一定要把不连接管尽量往柱子里塞。在使用通用接头时，即使在拧紧的过程中也要注意边塞边拧，以免在拧动的过程中，管子松开。预柱与分析柱的连接管应尽量短。1.5.2在使用不锈钢固定接头时，要注意不能拧得太紧，以免螺丝尖端的一截管子和金属刃环变形。不同公司的柱子的柱头不一样，插到里面去的管子的深度、刃环的角度也不一样，因而不锈钢接头不能通用。1.6色谱柱的使用1.6.1流淌相流速一般应在1.5mL/min以内，柱内径越大，可用的流速越大；填料颗粒越细，可用的流速越小。1.6.2流淌相的pH值：以硅胶为载体的色谱柱，应在2～7.5之间，最好在2.5～7.0之间，其它色谱柱参照讲明书的规定。1.6.3使用含盐或缓冲液的流淌相时，使用前一般先用10.0mL以上的水（或用无盐流淌相）过渡。1.7色谱柱的清洗1.7.1关于无盐流淌相,样品分析完成后,一般应用流淌相接着冲洗60mL以上，再依照样品成分的溶解性质，选用合适的纯有机溶剂或水冲洗，必要时测定柱效。1.7.2假如流淌相含有盐或者缓冲液，先用相应的无盐流淌相冲洗60mL以上，再用水冲洗100mL以上，再依照样品成分的溶解性质，选用合适的纯有机溶剂冲洗，必要时测定柱效。1.7.3色谱柱冲洗洁净的确认：假如没有时刻测定柱效，应保证柱压恢复正常；而且，在254nm处检测基线，20分钟内保持平稳。1.7.4预柱的冲洗：假如预柱太脏，应该单独冲洗，以免污染分析柱，国产的预柱必要时能够用长时刻的倒冲的方法把脏物冲洗：Phenomenex公司的预柱不能倒冲，假如预柱洗不洁净，交由仪器治理人员处理，新预柱的柱压一般在100psi以下，假如柱压变得专门大，应考虑预柱差不多变脏、被堵塞了。1.7.5柱效及分离度的测定使用完毕，必要时用稠环芳烃测定柱效（不带预柱），假如发觉柱效下降，或分离度变差，必须查找缘故，采纳合适的溶剂进一步冲洗柱子，直到差不多恢复正常。测定方法：样品：100mL（含苯0.35ml+联苯3mg+萘20mg+菲30mg）测定波长：254nm；流淌相：85%甲醇水；进样量：5μL。1.8色谱柱的封存：反相色谱柱应保存在50%以上的甲醇/乙腈中，正相色谱柱应保存在正已烷中，存放达半年时要重新冲洗，以免溶剂挥发，柱床变形。1.9记录：分析完成后应作记录。1.10正反相的转换：由反相到正相，依次用水、甲醇-异丙醇-正已烷冲洗；由正相到反相的转换，依次用正已烷-异丙醇-甲醇-水冲洗。1.11柱压及色谱柱压（不带预柱）上升，应查找缘故，采纳合适的溶剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃、氯仿、异丙醇、乙醚等）进一步冲洗柱子，直到柱效、柱压恢复正常。假如还不行，能够把柱子倒过来冲洗，只是须冲洗比较长的时刻，因为柱床重新平衡需要一定的时刻，倒过来冲洗，应倒着使用，不用再倒回去使用，以免又需再次平衡柱床（因此，倒着用一段时刻后，假如柱压又上升了，还能够倒回去冲洗、使用）。每倒转一次，应重新测定柱效。1.12色谱柱的报废：色谱柱的报废没有具体的时刻，有些色谱柱已不能用于测定某一物质了，但用于测另外的物质却可能还专门好。一般通过多次维修，柱压仍太高时，能够报废。用稠环芳烃测得柱效测得柱效和分离度达不到，通过冲洗、修理仍无改善时，也能够报废。注意事项：反相柱不能用纯水冲洗，流淌相中有机相的比例必须在5%以上。液相色谱培训讲义(十三)作者：

转载自：

公布日期：2007-5-22第十二章液相色谱仪器故障及排除方法第一节故障分类、识不与排除表本书中故障排除表的编排按照故障现象的分类（包括整机、部件、色谱图、引起缘故等）加以整理，在许多情况下可能有重复描述的，这是因为一种故障症状的出现，往往是由许多缘故造成，能够从色谱图中得到信息，也能够从各部件的运转情况推测，直至操作者应运用自己的全部知识与经验进行综合分析、推断、并通过各种可能的尝试，作出正确的推断。为了更加直观地快速推断问题所在。本章中，尽量用各种图表形式。表12-1系统流路问题造成的基线故障排除方法症状可能缘故解决方法不规则的噪声(产生于系统流路)检测器流通池内有较大气泡排气泡，清洗检测池或在检测器废液排放口加适当的回压调节器；在检测器废液排放回压不规则的噪声(产生于系统流路)流路中有少量气泡排气泡（为预防气泡，流淌相要脱气或通氦气）系统不稳定或没达到化学平衡使系统所有部件（如柱和检测器）有适当时刻获得稳定和化学平衡；假如使用自动梯度洗脱，要有足够的平衡时刻获得好的再现性；如使用离子对试剂，在首次使用时需要足够的时刻和溶剂体积，色谱柱才能达到足够的平衡。流淌相被污染不使用这些流淌相同时：（1）清洗贮液器，过滤器（6mol/LHNO3）水（重复三次）。甲醇/换溶剂入口过滤器（2）建议用HPLC级试剂（3）冲洗并重新平衡系统检测器流通池漏移开检测器盖子检查泄漏，假如看不到，按下面步聚进行：（1）用可溶性好的非缓冲液溶剂清洗检测器，然后用甲醇清洗（2）通氦气或氦气，慢慢将检测池吹干检测器流通池漏监测基线噪声，假如噪声消逝，表明检测池内部漏，需修理/更检测池规则的噪声(产生于系统流路)检测器流通池漏监测基线噪声，假如噪声消逝，表明检测池内部漏，需修理/更换检测池色谱柱被污染为证明可能的缘故更换系统的色谱柱或使用一根同类的被证明性能好的色谱柱换流淌相监测基线假如问题仍然存在可能由于：（1）

溶剂的性质（如不互溶）（2）

流淌相被玷污（3）

爱护柱或管路过滤器被玷污表12-2检测器电路引起的基线噪声故障排除方法症状可能缘故解决方法无规则噪声(产生于检测器)检测器没有稳定检测器灯应有适当时刻稳定（直到基线稳定）灯故障(产生于检测器)检测器灯检测器平衡时刻的变化取决于使用的检测器种类和参数（如波长、灵敏度、电压/电流等）按检测器讲明书检查器能够调证灯能量以补偿量损失无规则噪声(产生于检测器)检测池被污染参见检测故障排除检测器电路问题检测器故障，与供应商联系检测器与数据处理系统信号线连接不行将连接线接好检测器接地不行使用专用的、有屏蔽的信号线周围使用设备的阻碍使用单独电源，远离有强电磁波、强磁场的设备数据处理装置灵敏度设置太灵敏调到灵敏度合适的位置有规则期（分或秒）噪声（产生于检测器）周围设备的阻碍周围使用设备的阻碍参见上述“不规则的噪声”解决方法检测器内部控温器不合适（开/关过于频繁）正确设置检测器内部控温参数长期（分或小时）有规则噪声(产生于检测器)室温波动稳定室温至系统完全平衡，假如问题接着存在，则：（1）将检测器置于无空气对流的恒温环境中（2）检测器幸免阳光直射周围使用设备的阻碍参见上述“不规则的噪声”解决方法基线漂移(产生于检测器)检测器不稳定参见上述“不规则的噪声”解决方法室温变化参见上述“长期有规则噪声”解决方法检测池被污染参见检测器故障排除出现脉冲式噪声(产生于检测器)检测器灯参见上述“不规则的噪声”解决方法周围使用设备的阻碍参见上述“不规则的噪声”解决方法检测器电路问题检测器故障，与供应商联系表12-3保留时刻改变/错误的故障排除方法症状可能缘故解决方法每次进样时的保留时刻不重复由于气泡，各部件磨损等原则引起泵故障或泵脉冲输液不稳定假如压力不稳接着存在，见泵故障排除法系统不稳或未达到化学平衡应有足够时刻使所有的部件（如检测器、柱等）达到平衡，注意使用的操作条件（如流淌相、检测器数设置、检测器类型等）假如进行的是梯度洗脱，在两次进样期间应有足够的时刻以保证再现性如使用离子对试剂应保证第一次使用时要有足够的时刻和足够的溶剂体积使色谱柱达到平衡每次进样时的保留时刻不重复进样体积太大或样品浓度太高（过载）平衡被破坏假如压力不稳接着存在，见泵故障排除法室温波动大稳定环境温度，假如问题接着存在，测：（1）用柱恒温箱，（室温5℃以上）（2）将系统置于恒温、空气对流小的环境溶剂配比不合适解决步骤如下：（1）流淌相预混合、过滤和脱气（2）用溶剂平衡色谱柱（3）至少进标准样三次，比较保留时刻的重现性，假如保留时刻重现性好，表明是溶剂配比的问题保留时刻变化--新的恒定值（重复但不正确）对样品来讲流淌相不正确或组成不对配制新的流淌相泵流速改变设置合适的流速由于泵不稳导致输液流速不正确用称重法测量流速的准确性，假如测得值与设置值不同，证明是泵的问题，参见泵故障的排除室温变化参见“保留时刻不重复”的解决方法柱恒温箱温度设备有误设置正确的温度使用的色谱柱类型或尺寸不正确用一新的相同的色谱柱作比较保留时刻变化至一新的恒定值（重复但不正确）流淌相中有稳定剂或稳定剂改变使用无防腐剂的溶剂柱被污染参见“保留时刻连续向一个方向增大或减小”的解决方法系统的梯度延迟时刻设置不正确流路系统有无变化（如梯度混合气的加入，假如有变化重新计算新的延迟时刻表12-4不正常峰形的故障排除方法症状可能缘故解决方法无峰检测器选择错误（如波长、灵敏度、自动回零等）设置正确的检测器参数检测器输出没回零检测器基线回零由于电源、电路检测池造成的检测器问题参见检测器故障排除检测器与数据处理装置线路连接错误检测器输出信号，正确连接使用错误的流淌相配制新的流淌相假如问题发生时系统压力专门高，则表明样品中有沉淀样品降解验证样品的完整性，检查样品处理过程，更换新的样品色谱峰比可能的小（灵敏度降低）进样体积错误；进样器样品定量环大小不合适改变到合适的进样体积；检查进样器样品定量环，如需要更换合适尺寸的样品定量环检测器设置不当（如波长、灵敏度等）设备正确的检测器参数检测器输出没回零检测器基线调零检测器信号与数据处理系统不匹配参见上述“无峰”故障排除法检测器灯故障用检测器诊断步聚检查灯能量，假如灯能量低于指标要求（与新灯比较）更换灯有些检测器能够调整灯能量以补偿能量损失进样问题（瓶号错、进样体积不适合、进样错误、针头堵塞）参见进样器故障排除法样品黏度太大稀释样品，慢速抽取样品峰变宽（保留时刻短的峰）进样体积太大或样品浓度太高（样品过载）平衡破坏；减小进样体积或用流淌相稀释样品：假如使用弱溶剂，进样体积可达柱死体积的10%；管路内径错误，管路切割时操作不当，接头套圈不合适见管路的故障排除内容过滤器、爱护入口、柱入口或连接管路有部分堵塞检查这些部件的情况，更换堵塞管路，清洗相关部件进样器问题（如阀漏、针头堵塞或损坏，进样孔被堵住）参见进样器故障排除法使用了错误的进样器样品定量环检查进样品定量环，如需要，更换合适尺寸的样品定量环检测器时刻常数设置错误设置正确的参数峰变宽（所有的峰）柱或爱护柱被污染清洗柱或爱护柱，假如问题接着存在，更换柱性能下降或失效检查柱数（N），假如柱效降低（与新柱比），更换爱护柱性能下降换爱护芯关于流淌相来讲样品溶剂太强解决方法如下：（1）用流淌相溶解样品（2）用弱溶剂稀释（3）减少进样量使用错误的色谱柱（类型或尺寸）用一新的相同规格的色谱柱作比较室温变化使用柱恒箱温度变化可导致保留时刻变化（再现性好，但值不正确）系统没稳定或未达到化学平衡应有足够时刻使所有的部件（如检测器、柱等）达到平衡，注意使用的操作条件（如流淌相、检测器参数设置、检测器类型等）；假如进行的是梯度洗脱，在两次进样期间应有足够的时刻以保证再现性；如使用离子对试剂，应保证第一次使用时要有的足够的时刻和足够的溶剂体积使色谱柱达到平衡。记录仪走纸速度不合格调整到合适的纸速出现双峰/肩峰爱护柱或柱入口处部分堵塞见上述“峰变宽”的故障排除方法柱或爱护柱被污染清洗柱或爱护柱，假如问题接着存在，更换柱性能下降见上述“峰变宽”的故障排除方法爱护柱失效换爱护芯进样体积太大或样品浓度太高（样品过载），平衡破坏见上述“峰变宽”的故障排除方法前沿峰进样体积太大或样品浓度太高（样品过载），平衡破坏见上述“峰变宽”的故障排除方法关于流淌相来讲样品溶剂太强见上述“峰变宽”的故障排除方法柱或爱护柱被污染清洗柱爱护柱，假如问题接着存在，更换柱性能下降见上述“峰变宽”的故障排除方法爱护柱失效换柱芯液相色谱培训讲义(十四)作者：

转载自：

公布日期：2007-5-22拖尾峰柱或爱护柱被污染清洗柱或爱护柱，假如问题接着存在，更方柱性能下降见上述“峰变宽”的故障排除方法爱护柱失效换柱芯进样器问题（如阀漏等）见进样器故障的排除方法检测器参数错误（如波长、灵敏度、自动回零）设置正确的参数记录仪输入电压错误调整记录仪输入电压进样体积太大或样品浓度过高风上述“峰变宽”的故障排除方法出现负峰（所有峰）连接数据处理系统信号线接反正确连接记录仪或检测信号极性相反改变极性设置光学系统没平衡（RI检测器）参见仪器使用手册出现一个或几个负峰离子对分离体系对峰的阻碍在流淌相中溶解样品样品中有比流淌相差的折指数低的组分（只限于RI检测器）检测负峰是否由于样品溶剂杂质所致；假如峰阻碍分析结果，改进方法；假如负峰是由于溶剂杂质所致，使用新处理的溶剂使用的流淌相汲取高使用流淌相稀释样品，假如问题接着存在，调整流淌相使负峰不干扰分析结果；使用紫外截止波长外的流淌相或改变溶剂自动进样器注射进空气参见上述进样器故障的排除方法表12-5定性、定量结果不正确的故障排除方法症状可能缘故解决方法（一）定性结果峰不能分辨数据处理装置输入了不正确的参数输入下列参数：（1）样品表：（2）校正表：（3）参考峰；（4）峰窗口；（5）峰临界值；（6）峰积分；（7）保留时刻经适当改变后重新进标准样，提高准确度改变保留时刻参见上述“保留时刻不正确/改变”的故障除方法无峰数据处理装置输入了不正确的参数参见上述“色谱不能分辨”的故障排除方法改变保留时刻参见上述“保留时刻不正确/改变”的故障排除方法色谱图中出现多个鬼峰流淌相被污染放弃使用被污染的流淌相并：（1）清洗溶剂贮液瓶，清洗/溶剂入口过滤器，用6mol/L硝酸，水（重复三次），甲醇超声清洗过滤器（2）使用HPLC级试剂（3）重新平衡系统样品预处理时产生降解或混入杂质用标准样比较验证样品的完整性，检查样品处理过程，换新样品先前进样的流出物增加分析时刻，假如问题接着存在，两次进样间用强溶剂冲洗色谱柱样品定量管清洗不当两次进样间冲洗样品定量管注射器脏使用洁净的注射器，冲洗进样口柱被污染清洗柱和更换柱进样装置被污染冲洗进样器和样品定量环，如需要，换密封垫和过滤器流淌相中含有稳定剂/稳定剂变化使用无防腐剂溶剂色谱图中出现个不鬼峰样品降解参见上述“色谱图中出现多个鬼峰”的故障排除方法分辨下降进行色谱仪性能试验使用了错误的流淌相确认流淌相对样品的合适情况，换新批号流淌相假如问题发生在高压系统，将会有样品沉淀（二）定量结果准确度降低峰高/峰面积分值不正确设下列参数：（1）样品量（2）换算比例（3）内标物量（4）保留时刻经适当变化后，重新进标样提高试验精度样品预处理时样品降解或样品不纯参见上述“色谱图中出现多个鬼峰”的故障排除方法样品蒸发样品密封保存在适当温度下样品前处理不当检查样品制备过程（浓度、溶剂过滤等）内标物配制不当验证内标物配制/混合过程（称量和适当稀释）；配制新内标物进样问题（只对外标法而言）随手动进样器的类型不同而异取决于以下各种情况：（1）假如使用全部定量环的手动进样器，在进样前需在“取样”（load）状态下清洗三次（2）假如使用部分定量环的手动进样器，进样量需少于定量环体积的50%（3）假如使用注射器的手动进样器，须确保进样操作重复（4）假如使用自动进样器能够确保正确的进样体积，须注射器不含空气，样品瓶有足够的样品，系统不泄漏（5）假如手动进样器，自动进样器都使用，应确保流路的平衡周密度下降峰积分为不正确参见上述“准确度下降”的故障排除方法进样问题参见上述“准确度下降”的故障排除方法样品预处理时样品降解或混入杂质参见上述“色谱图中出现多个鬼峰”的故障排除方法保留时刻改变，峰形不正常参见上述“峰形不正常”的故障排除方法检测器响应故障参见上述“检测器”的故障排除方法表12-6泵的故障排除方法症状可能缘故解决方法泵不工作（风扇不转，面板灯不亮）泵电源接不正确检查各种连线、电源是否正常保险线烧断换保险丝泵不能输送溶剂保险丝烧断抑保险丝泵与泵操纵系统接不当正确连接泵低压限设置值高于操作压力设置正确的压力限压力传感器故障流速设置为零，调至压力传感器为零，修理/更换排放阀打开或泄漏关闭排放阀，假如溶剂接着泄漏，更换密封垫泵头溶剂水互溶用合适的溶剂冲洗泵，改用互溶性好的溶剂阀的时宜出口有脏物/失效清清洗密封垫圈损坏检查，假如溶剂是由泵头后部泄漏或有盐结晶析出表明柱塞密封垫损坏，换密封垫泵头有气穴现象（高压泵才有此现象）（1）溶剂贮液器位置等于/低于泵的位置抬高高溶剂贮液器位置（高于泵）（2）泵入口管路松，弯典或堵塞—检查管路，旋紧调直，更换（3）溶剂脱气不适当——脱气/充氧气（4）溶剂贮液器入口过滤器脏——清洗溶剂贮液瓶，清洗/更换溶剂入口过滤器，用6mol/L硝酸，水（重复三次），甲醇超声清洗过滤器（5）管路内径太细——使用正确的管路脉冲阻尼器/高压噪声过滤器问题检查泄漏处，更换脉冲阻尼器/高压噪声过滤器溶剂比例阀或混合器故障清洗比例阀或混合器，若问题仍存在，更换泵马达问题与供应商联系线路板问题与供应商联系泵头泄漏泵柱塞密封垫磨损更换泵柱塞磨损修理或更换泵头太松旋紧泵有关当局两螺丝，注意力量的均衡，不要过紧阀进出口太松旋紧（不要太紧）排放阀泄漏排放阀打开或损坏关闭排放阀，如溶剂接着泄漏，更换密封垫溶剂管路损坏更换流速不稳/泵脉冲溶剂脱气、通气爱护不当溶剂脱气充氦气，重新平衡体系，注意氦气流量，幸免带出流淌相贮液器位置低/无溶剂抬高贮液器位置，加溶剂泵头有气泡排气泡，溶剂需脱气/通氦气，确保溶剂入口管路无气沟阀脏/失灵清洗阀，确认溶剂通过过滤器，无沉淀析出当使用水和有机溶剂混合流淌相浓度达到50%或更高时，缓冲液在阀上析出沉淀，沉淀量取决于溶剂和缓冲液的比例溶剂入口过滤/入口管路堵塞检查管路，如需要更换清洗溶剂入口过滤砂芯，用6mol/L硝酸，水（重复三次），甲醇超声清洗过滤器溶剂比例阀或混合器故障清洗溶剂比例阀或混合器，如需要，更换泵柱塞密封垫漏（在泵头）更换泵柱塞磨损更换泵头溶剂不互溶参见上述“泵不能输送溶剂的故障排除方法”泵电路故障与供应商联系溶剂混合不当（梯度洗脱体系）泵头溶剂不互溶参见上述“泵不能输送溶剂的故障排除方法”溶剂比例阀或混合器故障清洗溶剂比例阀或混合器，如需要更换泵后溶剂混合问题参见上述“短期规则噪声”的故障排除方法泵系统压力高泵流量设备太高设置正确流量泵传感器故障流速设置为零，调至压力传感器为零，修理/更换出现不正常机械噪声泵密封垫干化假如适用，重新洗柱塞；清洗系统；用适当的溶剂通过泵头的路径湿润柱塞泵柱塞密封垫硬化更换密封垫子不合适更换液相色谱培训讲义(十五)作者：

转载自：

公布日期：2007-5-22表12-7进样器的故障排除方法症状可能缘故解决方法（一）手动进样器故障排除进样泄漏进样口问题调整/更换密封垫进样针规格与进样口不一（大或小）使用合适的注射器注射器问题（如弯曲或尖端起毛刺检查注射器，假如损坏更换，另外更换进样口密封垫进样器子泄漏旋转转子螺丝重新拧紧用专用工具旋转子螺丝（不要过紧）；假如接着泄漏，更换旋转转子表面磨损更换受压螺丝处泄漏零部件太松/紧检查接头与垫圈，如需要，更换样品进样问题（如进样困难，出现不正常峰形进样口堵塞或管路弯曲检查堵塞情况清洗进样器，如愿问题信用证存在，修理注射器问题（如弯曲或尖端起毛刺）检查堵塞情况，如有损坏更换，另外更换进样口密封垫旋转密封垫问题更换注射器堵塞清洗样品遣留样品定量环冲洗不当两次进样间用流淌相冲洗样品定量环注射器脏或进样品脏使用清洁注射器，清洗进样口（二）自动进样器故障排除自动自进样器不能工作（风扇和前面板灯不亮）电源连接不正确，未与操纵系统连接正确连接气压问题（气体驱动自动进样器确认空气压力管路的正确连接，检查原空气压力调节器，设置在适当的工作范围样品架问题与供应商联系电路问题与供应商联系流路系统泄漏（针、进样器、密封部件、流路部件受压配件太松/紧检查接头与垫圈，如需要，更换密封垫问题更换流路部件问题更换进样针损坏冲洗自动进样器针头，如问题接着存在，更换进样针件和密封垫洗针系统泄漏受压配件太松/紧检查接头与垫圈，如需要，更换流路阀问题更换洗针泵问题更换自动进样器从针头清洗溶剂瓶吸溶剂降低针头清洗溶剂瓶位置样品进行问题（如不进样，出现不正常峰形）进样阀问题清洗自动进样器，如问题接着存在，修理/更换阀样品中有颗粒导致针头堵塞清洗自动进样器至针头不堵，如问题接着存在，更换部件注射器或样品定量环装置中有气泡清洗自动进样器，假如气泡不易排除，讲明当注射器针头刺穿样品垫时产生了真空（讲明密封垫太紧）从空的样品瓶中进样检查进样样品瓶的位置，从瓶号正确的样品瓶中进样样品瓶中药品不够查明同意进样的最小体积，进样最好要大于该体积样品瓶中顶端螺母太紧（产生真空）旋松样品黏度太大稀释样品或慢速抽取样品进样器密封垫问题更换进样器无溶剂流淌进样器未与泵连接正确连接进样阀位置错误按原来阀位重新操作，假如问题接着存在，修理/更换进样阀堵塞冲洗、假如问题接着存在，修理/更换自动进样器前段或内部泄漏检查泄漏处旋紧接头，假如有泄漏，要查明接头或垫圈的磨损情况，需要时，更换自动进样进样清洗时堵塞参见操作手册由于自动进样器产生的系统压力高样品有颗粒导致针头堵塞参见上述“样品进样（样如样品不进样，出现不正常峰形”故障排除方法进样阀堵塞冲洗进样器，假如问题接着存在、修理/更换自动进样器与柱之间管路堵塞检查边接管路，更换堵塞管路样品定量环节流阀堵塞用以下方法：将自动进样器进出口连接部件逆流冲洗，如此溶剂将由进样器出品管路进，进口管路排放；确认差不多流路是闭合的；逆流冲洗节流阀清除堵塞物；用以上方法后，假如问题接着存在，更换节流阀样品与流淌相不互溶为验证其溶解性，取样品和流淌相置于试管中观看溶解情况，假如需要，对样品进一步稀释或改变流淌相自动进样器过滤器堵塞清洗/更换样品遗留进样体积太大减少进样体积或安装一个体积更大的样品定量环样品进样问题样品进样分析后，再进溶剂空白样进行对比，假如样品遗留问题接着存在则可能是由于进样针清洗系统的问题（见下条）针头清洗系统问题更换清洗针头的溶剂重新接好针头清洗系统更换被污染的砂芯进样体积错误瓶中样品量不够查明同意进样的最小体积，进样量要大于该体识注射器泄漏修理/更换样品黏度太大稀释样品或慢速抽取样品样品瓶中产生真空从样品瓶中移去少许样品，或旋松样品瓶盖针头弯曲针头从样品瓶盖中不能拔出去掉样品瓶盖，更换新的隔膜垫盖更换弯曲针头隔膜垫阻力太大在同样位置从无盖样品中进样，以证明隔膜垫阻力太大，换稍薄一些的垫，注意隔膜垫是一次性使用，更换弯曲针头表12-9检测器的故障排除方法症状可能缘故解决方法检测器不工作（风扇不转和面板灯不亮）电源连接、保险线等问题检查各种连接线、保险丝外操纵器不能操纵检测器检测器与外操纵器没连接正确确认正确连接电路板问题与供应商联系电源灯不亮（或参比能量故障）保险丝烧断更换灯问题更换灯选择错误（检测器中有多个灯）检查开关设置，打开正确的灯参比池被污染清洗参比池：（1）用互溶性好的溶剂清洗参比池，最后用甲醇清洗（2）通氮气/氦气于检测器入口将参比池吹干电源灯连接烧坏灯电源部分问题与供应商联系安装氘灯时在灯上留下了污点或指纹认真按照检测器操作手册上给出的安装程序进行操作检测器无响应（基线笔直、无峰）灯烧坏更换检测器参数设置错误（如波长、灵敏度等）设置正确的参数检测器输出没回零检测器基线调零灯选择错误（检测器中有多个灯）检查开头设备，打开正确的灯光电二极管问题更换检测池/参比池脏或被污染清洗流通池：（1）卸柱，安装一段连接管（2）关于缓冲溶液用100%水，100%甲醇（假如与流通池中遗留溶剂互溶）冲洗，再用100%水冲洗（3）关于非极性溶剂用50/50四氢呋喃和水（假如与流通池中遗留溶剂互溶）冲洗，再用100%四氢呋喃冲洗假如问题接着存在，用强溶剂冲洗检测器无响应（基线笔直、无峰）溶剂漏进参比池修理/更换流通池参比池清洗不当（仅RI检测器）清洗参比池，确认流通池中参比和样品两路的流淌相达到平衡检测器光路未平衡RI检测器参见检测操作手册激发或发射波长设置错误或波长滤色器问题（仅荧光检测器）使用合适的滤色器，确认波长准确性，满足检测要求激发或发射色器使用老化（仅荧光检测器）更换滤色器溶解氧使样品响应淬灭（仅荧光检测器）对某些专门化合物溶解氧（10-3moI/L）能使荧光强度降低20%流淌相脱气/通氦气排除电路问题与供应商联系样品或标样灵敏度变化（仅UV检测器）检测/参比池脏或被污染参见上述“检测器无响应（基线笔直、无峰）”的故障排除方法流通池泄漏参见上述“流通池漏”的故障排除方法光电二极管问题更换流淌相被污染放弃使用被污染的流淌相同时：（1）清洗溶剂贮液瓶，清洗/更换溶剂入口过滤器，用6moI/L硝酸，水（重复三次），甲醇超声清洗过滤器（2）使用HPLC级试剂（3）重新平衡系统流通池附着大气泡排除气泡，清洗检测器、流通池或逆道清洗为预防气泡产生流淌相应充分脱气流淌相有强汲取杂质参见上述“检测器无响应（基线笔直、无峰）”的故障排除方法样品和标样灵敏度都改变光电二极管问题更换灯问题用检测器诊断程序检查灯能量，假如能量低于指标要求（与新灯比），更换灯有些检器能够调节灯能量以补偿能量损失流通池泄漏参见上述“流通池泄漏”的故障排除方法滤色器问题与供应商联系检测器过热脏物进入过滤器清洗过滤器清洁和散热不够检测器周围清洁、散热良好接头处泄漏流通池密封垫问题更换密封垫，假如泄漏接着存在，更换流通池流通池堵塞/损坏认真逆流清洗检测器流通池，假如流通池损坏或破裂，修理/更换液相色谱培训讲义(十六)作者：

转载自：

公布日期：2007-5-22第十三章蒸发光散射检测器的使用首先特不感谢您购置了SofTAModel200SELSD。在您开始使用Model200S进行分析工作往常，请您先阅读快速启动向导同时重新进行QC测试。假如QC测试结果在您的实验室中不能成功再现，那么将对我们辅助您获得最好的分析结果带来特不大的困难。一、启动向导1.打开包装同时安装(1).安装前的预备工作除Model200SELSD以外您还需要下列附件：气体供应设备：为喷雾需要使用一个调压至50psi的洁净、干燥的惰性气源（变化范围小于1psi）。建议使用氮气或者是氩气。排气设备：载气将带着挥发的流淌相和样品组份从ELSD流出，你应该提供一种方法将这些废气从实验室排出。因此ELSD应该放置在通风橱里或者只用其它的排气设备。流淌相：使用90/10的甲醇/水或者10/90的甲醇/水标准样：100ng苯甲酸盐用水稀释到1ulHPLC泵：为了使泵能稳定运行，请参考泵讲明书。使用管路、接头和工具将您的HPLC系统和ELSD连接起来。(2).开箱随Model200SELSD发货的附件清单见讲明书的附录1。小心开箱同时确认所有的附件都在。SofTA的ELSD带来的高质量运输包装壳被设计成在运输中可不能毁坏。保存同时装好运输包装壳，为今后的运输使用。(3).连接排气随ELSD附带有一个将隐藏在检测器后面板上的1’’废气排放口连接到1/2’’管路的连接器。连接管路到那个连接器同时在运行其间对准通风橱。或者能够连接管路同时对准一个被冷缺的容器。(4).通信在Model200SELSD的后面板上有一个输出接口，能够用来连接记录仪，积分仪或者是基于计算机的数据采集系统。最大信号输出为5V和10mV。(5).气体连接将一个调压为50±5psi的清洁、干燥、惰性的气源连接到前面板的GASINLET口（气压波动范围不能大于1psi）。确定气压不在60psi以上，那样的话，检测器可能会被永久毁坏。(6).电源连接Model200SELSD的工作电压为120V或240V，50或60Hz。在插入电源线往常请确认电压与SofTAModel200SELSD的配置是否正确。假如电源输入电压设置错误，请拔出电源线，用一个平的螺丝刀轻轻撬开电源保险盖，取出保险模块，用扁嘴钳或小钳子将电压配置卡从保险模块中拔出，转动塑料的电压选择块到正确电压选择口的对面，把电压配置卡和保险模块放回原处。确认透过安全盖前面的电压指示是正确的。插入电源线（注意：关于100Vac～120Vac的电压，配置模块选择120V。关于200Vac～240Vac的输入电压，配置模块选择240V。(7).液路连接将色谱柱出口与检测器前面板的LIQUIDINLET口通过一个仪器附件包自带的在线过滤器连接起来。在色谱柱出口和检测器入口之间尽量使用短管连接，以免带来峰展宽。(8).热分流出口：将附件包自带的一段弯曲的氟化管上的1/4″不锈钢螺母和卡套牢固地连接在Model200SELSD前面板的Drain口上。在一个100mL的玻璃烧杯里装大约80mL水，将出口管插入烧杯里面。（见图2）。注意烧杯里的液体，不要溢出来。尤其在运行时，雾化室（热分流室）的温度低于室温时，限制Drain口的液流对保证检测灵敏度是特不重要的。2.初识运行(1).确认所有连接：气体、液体、电源、通信、排气和出口与以上叙述相同。目前还不能打开气体。(2).开电源，等待系统运行自检并进入待机屏。(3).按ESC键进入主屏，按上、下箭头滚动设置操作条件，SC,DT,OC和ET的设置温度会持续显示5秒，假如你等待5秒将会显示它们的真实温度。(4).确认所有的参数设置与下面的QC测试条件是一致的，假如不正确，你能够修改当前输入或者从仪器经历体中装栽一个方法。详细讲明请查看Model200SELSD讲明书的仪器操纵章节。(5).启动HPLC泵并设定流速为1mL/min。当你看到液体从Drain口流出时（可能需要5分钟或更长时刻），停止泵同时将Drain口连接管的末端插入一个装有水的烧杯里（见图2）。现