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文档简介
第十章
工业发酵染菌的防止和灭菌江苏大学食品与生物工程学院张志才E.Mail:zhangzhicai2001@一、染菌的危害二、杂菌污染的原因与防治三、噬菌体污染的防止绝大多数工业发酵,无论是单菌发酵还是混合菌种发酵,都是纯种发酵,除菌种以外的微生物都被视为杂菌。所谓染菌,是指在发酵培养基中侵入了有碍生产的其它微生物。几乎所有的发酵工业都有可能遭受杂菌或噬菌体的污染。一、染菌的危害:对发酵本身的影响:轻者影响产量或质量,重者可能导致倒罐,甚至停产,造成原料、人力和设备力的浪费。因此,防止杂菌和噬菌体污染是保证发酵正常进行的关键之一。对产物提取和产品质量的影响
(1)对过滤的影响发酵液的粘度加大;菌体大多自溶;由于发酵不彻底,基质的残留浓度加度。造成过滤时间拉长,影响设备的周转使用,破坏生产平衡;大幅度降低过滤收率。(4)、染菌对三废处理的影响使过滤后的废菌体无法利用,发酵染菌的废液,生物需氧量(BOD)增高,增加三废治理费用和时间。染菌对三废处理的影响使过滤后的废菌体无法利用,发酵染菌的废液,生物需氧量(BOD)增高,增加三废治理费用和时间。
防重于治,事前防止胜于事后挽救。即使在发酵后期染菌,对产量无显著影响,也对提取不利,会降低产品质量及收率。染菌原因:菌种、空气、设备、原料等。除了需要采取措施确保菌种本身的纯度、不使接种物带入杂菌外,深层发酵中必需认真做好培养基及有关发酵设备的灭菌、空气除菌、无菌操作等工作,以确保发酵的顺利进行。一、杂菌污染的原因与防治从染菌的现象分析染菌原因:(1)从染菌时间来看,早期染菌(如接种后12h或24h),除了种子带菌外,主要是培养基或设备灭菌不彻底。相反,中、后期染菌则可能与中间补料、设备渗漏以及操作不合理等有关,也可能是空气过滤器不严所致。(2)从污染的杂菌类型看,污染耐热的芽孢杆菌,多数是因培养基灭菌不彻底或设备存在死角所致。污染无芽孢杆菌、球菌等不耐热菌,可能是从蒸气的冷却水中带来的,空气系统密封不严造成。感染浅绿色菌落(G-杆菌、球菌),来源是水,可熊是设备渗漏或冷却器穿孔。感染霉菌、酵母,一般是由于灭菌不彻底或无菌操作不严造成的。(3)大面积发酵罐染菌是指整个工厂各个产品的发酸罐都出现杂菌现象,而且染的是同一种菌,主要是空气过滤器除菌不净,空气带菌而造成。(4)部分发酵罐(或罐组)杂菌,例如生产同—产品的几个发酸罐都染菌,如果染菌出现在早期,可能是种子带杂菌;出现在中后期,则可能是补料或空气带菌所致。在使用连消的设备中,如果用连消进料的发酵罐都出现染菌,则可能是连消系统灭菌不彻底而引起的。(5)个别发酵罐连续染菌,较多地是由于设备问题而造成的。如阀门的渗漏或罐体被损,特别是蛇形管的穿孔,有时不易察觉。有时设备破损引起的染菌会出现每批染菌时间前移现象。(6)个别发酵罐偶然染菌的原因最为复杂,各种染菌途径都有可能引起。防治染菌要点:(1)空气系统防止空气带菌主要是提高空压机进口空气的洁净度、防止空气带油、水及过滤器失效。如提高空压机吸气口位置并加强压缩前的过滤,防止空气冷却器漏水顶进入空气系统;在空气过滤器灭菌时要防止冲翻介质而短路,防止考焦介质或着火;当突然停止进空气时,要防止发酵液倒流入过滤器内;装填纤维介质时要压紧;操作中要防止空气的压力剧变和流速激增等。(2)蒸汽重视饱和蒸汽的质量,严防蒸汽中夹带大量冷凝水,防止蒸汽压力大幅度波动,保证生产用汽压在0.3~0.35MPa以上。(3)设备a.连消设备的连消塔要简单,易拆装清理,操作时蒸汽能与物料均匀混合,并易控温度;维持罐在料液输送时培养基在罐中能均匀地缓慢上升,不走短路。b.发酵罐及其附属设备应注意严密和防止泄漏,避兔形成“死角”。与物料、空气、下水道连接的阀门皆需保证严密度。c.用超净工作台及净化室代替无菌室,以提高无菌程度。(4)工艺操作a.空罐准备放罐后应进行全面检查和清洗。要清理罐内残渣,去除罐壁污垢,清除空气分布管、温度计套管等处堆积的污垢及罐内的“死角”。要防止端面轴封漏气、搅拌填科箱及阀门渗漏等。蛇管和夹层要按设计规定的压力定期试压。空消时应先将罐内空气排尽,保持蒸汽畅通,阀门、管道均要彻底灭菌。
b.实罐灭菌配制培养基时要防止原料结块。配料罐出口应有筛板过滤器(筛孔直径<0.5mm),以防块状物及异物进入罐内。灭菌时,要保证各路进气畅通及罐内料液翻腾激烈,控制好温度与压力;严防泡沫冒顶及料液倒流到空气系统中。
c.连消料液进入连消塔前需先预热。灭菌过程中,料液温度及其在维持罐停留的时间都必须符合要求,确保灭菌彻底。当冷却管开放冷水时,防止因突然冷却造成负压而吸入外界空气。为确保灭菌温度稳定,连消必须实现自动控制。
d.补料补入发酵罐内的料液一定要保证无菌。
e.种子有关种子操作的制度要严格遵守。摇瓶瓶塞要确保严密。种子培养基灭菌时要防止升温太快。
f.无菌试验无菌试验要严格取样操作,力求减少误差。应同时用肉汤和双碟作对照,以便迅速作出判断。当发现染菌时,要通过分辩菌型来探索菌源,并对杂菌作耐热试验考察。如果怀疑种子罐染菌,则种子不能轻率进发酵罐。种子带菌的原因及防止1、带菌的原因(1)无菌室的无菌条件不符合要求;(2)培养基灭菌不彻底;(3)操作不当。2、种子带菌的防止种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养,借以说明是否是种子中带杂菌。种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。(1)无菌室
接种、移种等无菌操作需要在无菌室内进行。无菌室面积不宜过大,一般约4~6米2高约2.6米。为了减少外界空气的侵入,无菌室要有1~3个套间(缓冲过道)。无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子,要求无裂缝,墙角最好做成圆弧形,便于揩擦清洗以减少空气中微生物的潜伏场所,室内布置应尽量简单,最好能安装空气调节装置,通入无菌空气并调节室内的温湿度。无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。通常用30瓦紫外线灭菌灯照射20~30分钟即可。紫外线杀菌的效率还与室内空气的性质有关;空气温度高杀菌效率高,空气中灰尘多杀菌效率低,而相对湿度高则紫外线灯的使用寿命长。紫外线能穿过石英但不能透过玻璃。无菌室的立视图配合使用的化学灭菌药剂有:用作喷洒或揩擦的(以揩擦为主)有75%酒精、0.25%新洁而灭(季胺盐)、0.6~1%漂白粉、0.5%石炭酸、0.5%过氧乙酸、1%煤酚皂(来苏尔)、0.5%高锰酸钾、300单位/毫升土霉素、50单位/毫升制霉菌素等;用作熏蒸的有甲醛(每立方米空间约用10毫升)或硫磺(每立方米空间约用2~3克)。要根据不同情况采用不同的灭菌剂。如检查出无菌室中潜伏的微生物中细菌较多,用石炭酸、土霉素等灭菌较好;如无菌室中霉菌多可以采用制霉菌素;如有噬菌体则用甲醛、双氧水或高锰酸钾等较好。无菌室内无菌度的要求是:把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30分钟,根据一般工厂的经验,长出的菌落在3个以下为好。(2)培养基灭菌不彻底时间:通入表压为1公斤/厘米2的蒸汽时,三角瓶中培养基的体积与升温时间的关系假压:(3)操作不当——摇瓶机摇瓶机(亦称摇床)是培养好气菌的小型试验设备或作为种子扩大培养之用,常用的摇瓶机有往复式和旋转式两种。死角所谓死角是指灭菌时因某些原因使灭菌温度达不到或不易达到的局部地区。发酵罐及其管路如有死角存在,则死角内潜伏的杂菌不易杀死,会造成连续染菌,影响生产的正常进行。法兰连接的死角渣滓在罐底与用环式空气分布管所形成的死角不锈钢衬里的死角接种管路的死角排气管的死角罐顶排气管弯头处如有堆积物,其中窝藏的杂菌不容易彻底消灭,而当发酵时受搅拌的震动和排气的冲击就会一点点地剥落下来造成污染。另外排气管的直径太大,灭菌时蒸汽流速小也会使管中部分耐热菌不能全部杀死。有的单位曾作过试验,将排气管做成每节可拆卸的,灭菌后将各节拆下分别检查就发现某些末被杀死的耐热菌。所以排气管要与罐的尺寸有一定比例,不宜过大或过小不合理补料管配置造成的死角压力表安装不合理形成的死角A:不合理;B:合理无菌检查与染菌的处理:为了防止在种子培养或发酵过程中污染杂菌,在接种前后、种子培养及发酵过程中分别进行无菌检查,以便及时发现染菌,并在染菌后及时进行必要处理是很重要的。发酵过程的杂菌检查(1)无菌检查染菌通常通过3个途径发现:无菌试验,发酵液直接镜检,发酵液的生化分析。其中无菌试验是判断染菌的主要依据。无菌试验方法有双碟培养、斜面培养、肉汤培养、镜检等,其中以双碟和肉汤培养为主。(2)染菌的判断以肉汤和双碟培养的反应为主,镜检为辅。每8h一次的无菌检查,至少用2只酚红肉汤及1只双碟同时取样。无菌试验时,如果肉汤连续3次变色(红黄)或产生浑浊,或双碟培养连续3次有杂菌菌落,即判断为染茵。(3)染菌率的统计以发酵罐染菌批(次)为基准,染菌罐批(次)应包括染菌重消后的重复染菌批(次)在内。整个发酵周期中,无论前期或后期染菌,均作“染菌”论处。染菌率(%)=发酵(罐)染菌批(次)/总数罐批(次)*100%1)总染菌率:指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比乘以100得到的百分率。2)设备染菌率:统计发酵罐或其他设备的染菌率,有利于查找因设备缺陷而造成的染菌原因。3)不同品种发酵的染菌率:统计不同品种发酵的染菌率,有助于查找不同品种发酵染菌的原因。4)不同发酵阶段的染菌率:将整个发酵周期分成前期、中期和后期三个阶段,分别统计其染菌率。有助于查找染菌的原因。5)季节染菌率:统计不同季节的染菌率,可以采取相应的措施制服染菌。6)操作染菌率:统计操作工的染菌率,一方面可以分析染菌原因,另一方面可以考核操作工的灭菌操作技术水平。(4)染菌的处理发现染菌后,应立即根据染菌的种类及生产菌的菌龄等具体情况分别进行处理。二噬菌体污染的防止在国内外,发酵工业中噬菌体的危害是一个普遍的问题。对于丙酮丁醇、氨基酸、酶制剂和抗生素等发酵都有噬菌体的危害,所带来的经济损失是相当惊人的。因此,认识并研究噬菌体的感染,战胜噬菌体对发酵生产的危害是具有重要意义的。什么是噬菌体病毒是一类既具有化学大分子属性,又具有生物体基本特征;既具有细胞外的感染性颗粒形式,又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。病毒以其结构简单一、特殊的繁殖方式以及绝对的细胞内寄生,显著区别干其他生物。噬菌体:宿主是细菌或真菌的病毒。噬菌体的污染源:噬菌体广泛地存在于适合宿主菌生存的泥土、污水和空气中。发酵工业生产菌的噬菌体可以从异常发酸液和工厂环境中分离出来,溶源性细菌也混杂在工厂周围环绰的细菌中。这样,噬菌体则极易污染发酵生产,导致发酵异常,造成严重损失。—个新的发酵工厂往往在产不久便出现噬菌体污染,造成生产混乱。研究认为,当有许多细菌存在时,相应的噬菌体就会马上出现,其浓度在自然条件下很容易增高。还有人认为,溶源性细菌的一部分菌体细胞中噬菌体DNA在自然因素诱导下,与细菌染色体和其它附着处分离、增殖,演变为感染性噬菌体。噬菌体污染与发酵异常:噬菌体污染后的情况因发酵工业的种类、污染的噬菌体特性、污染时间、感染复度(即培养物内的噬菌体与细菌的比率)、培养基成分、发酵罐内的物理和化学条件不同而异。即使同样的噬菌体并不一定引起同样的异常发酵情况。一般来说,噬菌体污染引起的异常发酵有以下几种表现:(1)污染较轻,或在发酵末期污染,则使发酵过程减慢或降低发酵产率。也有的行业在这种情况下产率反而增高;(2)在细菌对数生长期污染,而且污染量大,就会造成细菌溶解,发酵终止。噬菌体污染后可以观察到糖消耗减慢,pH异常变化,产气减少,发酵液稀薄,继之活的生
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