微生物检验-070沙门氏菌

致病菌的食品卫生学意义食品卫生标准规定任何食品中不得检出致病菌致病菌对 健康的 是直接和肯定的根据不同食品被污染的特点重点检验某些细菌如蛋禽肉主检沙门氏菌，罐头检肉毒梭菌等微生物毒素也是重点，如金葡的肠毒素、黄曲霉毒素等微生物与食物概念：指摄入了含有生物性、化学性有害物质的食品或把 有害物质当作食品摄入后出现的非传染性的急性、亚急性疾病。特点：潜伏期短，来势急剧，短时多人同时发病；临床表现大致相同；与吃某种 食品有关；高，人与人之间并不传染。分类：微生物性（细菌性、真菌性），化学性，动、植物性，以细菌性最常见。细菌性食物概念：由于食入被病原菌或其毒素污染的食物后所引起的以急性肠胃炎为主的疾病。分类： 型、毒素型、不定型病原菌常见食品潜伏期病程症状沙门氏菌肉乳蛋6-8h3-7d腹痛发热冷汗头痛副溶血性弧菌水产品腌制品8-24h1-3d腹痛腹泻蜡样芽孢杆菌米饭肉乳淀粉类30-60min1d腹痛腹泻第一节食品中肠道致病杆菌的检验一、沙门氏菌检验沙门氏菌属是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科中的一个大属，也是肠杆菌科中最重要的病原菌属，它包括2000多个型。沙门氏菌病常在动物中广泛，人的沙门氏菌和带菌也非常普通。由于动物的生前或食品受到污染，均可使人发生食物。世界各地的食物中，沙门氏菌食物常占首位或第二位。沙门氏菌常作为食品和其他食品的致病菌指标。因此，检查食品中的沙门氏菌极为重要。(一)形态与染色沙门氏菌为革兰氏

较为细长的杆菌，(1-3)µm×(0.4-0.9)µm；不产生芽胞，一般无荚膜，但在粘液样变异时，可见菌体周围粘液层增厚。除鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌外，其余都具有周身鞭毛，能运动，但也偶尔出现无鞭毛的变种和不运动变株。除鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌及仙台、伤寒、甲型副伤寒等沙门氏菌外，绝大多数都具有纤毛，能吸附于细胞表面和凝集红血球。(二)命名沙门氏菌属内各种菌型的名称，大致有：1．根据所致疾病命名如引起伤寒病的菌型，命名为伤寒沙门氏菌(S.typhi)；引起猪霍乱病的菌型，命名为猪霍乱沙门氏菌(S.cholerae-suis)，引起马的菌型，命名为马 沙门氏菌(S.abortus-equi)等。2．根据首先发现的地区命名如

沙门氏菌(S.shanghai)、自贡沙门氏菌(S.zigong)、仙台沙门氏菌(S.sendai)、维也纳沙门氏菌(S.wien)、伦敦沙门氏菌(S.london)等。3．根据人名命名如查理沙门氏菌（S.chailey）、阿德莱沙门氏菌(S.adelaide)，以发现者的名字命名。(三)培养特性沙门氏菌为需氧或兼性厌氧菌，一般在普通琼脂培养基上生长良好，经37℃培养24h后呈圆形、光滑、湿润、半透明、边缘整齐、直径2mm～3mm；粗糙型菌落，边缘不整齐，表面干燥。鸡白痢、鸡伤寒和甲型伤寒沙门氏菌等在普通琼脂培养基上生长贫瘠，形成侏儒型的菌落，乙型副伤寒沙门氏菌和霍乱沙门氏菌可呈粘液状生长，经37℃培养24h后再置室温

1d～2d，则可看到菌落周围有一圈粘液堤。沙门氏菌最适生长温度为35℃～37℃，10h～42h能生长，最适生长pH为7.2～7.4。在培养基中若加入硫代硫酸钠、胱氨酸、血清、葡萄糖、淀粉、脑心浸液、胶体硫或甘油等，均有助于本菌的生长。沙门氏菌属按其生化特性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五个亚属，其中亚属Ⅲ又称为亚利桑那菌，它们在亚硫酸铅琼脂、DHL琼脂、HE琼脂和SS琼脂平板上培养特性各不相同。亚硫酸铋琼脂(BS)产硫化氢菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。1/5DHL琼脂无色半透明：产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色。亚利桑那菌乳糖阳性菌株是粉色。2/5HE琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色。亚利桑那菌乳糖阳性菌株是黄色。3/5SS琼脂无色半透明：产硫化氢菌株有的菌落中心带黑色，但不如以上培养基明显。亚利桑那菌乳糖阳性菌株是粉色。4/5XLD琼脂培养基多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色。(四)抗原结构沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般可分为四种：菌体抗原，又称为Ｏ抗原；鞭毛抗原，又称为H抗原；表面抗原又称K抗原；以及菌毛抗原。1、菌体抗原(O抗原)沙门氏菌的Ｏ抗原主要存在于细菌细胞壁的最外层，是多糖—类脂—蛋白质的复合物，简称脂多糖，也就是本属细菌的内毒素。O抗原很稳定，能耐热100℃达数小时。O抗原含有许多不同的多糖成分，分别以1，2，3…等

数字表示，例如：甲型伤寒

沙门氏菌的Ｏ抗原有1、2、12；猪霍乱沙门氏菌的O抗原有6、7。O抗原与抗Ｏ 混合后，在56℃经4h～12h或37℃过夜，出现颗粒状不易摇散的Ｏ凝集现象。2、鞭毛抗原(H抗原)沙门氏菌的H抗原存在于鞭毛上，化学成分为蛋白质，其特异性主要是由蛋白质多肽链上氨基酸的排列顺序及空间构型来决定的。H抗原对热不稳定，经加热60℃～70℃15min，或

及酸处理后即被破坏。要使H抗原完全破坏，必须将培养物煮沸2.5h，短时间的加热仅能破坏其可凝性凝集结合力，但不能破坏其凝集产生的能力。H抗原与抗H

经56℃2h后，可出现疏松易于摇散的絮状凝集，称为H凝集。具有鞭毛的细菌，经

固定后，其菌体抗原全部被遮盖，故不能与菌体抗体(O抗体)发生凝集。H抗原可分为两相，第1相为特异相，用英文小写字母表示；第2相为非特异性相，用

数字表示，但少数也有用英文字母来表示的。例如：猪伤寒沙门氏菌的H抗原第一相c，第二相1、5； 沙门氏菌的第一相e、h，第二相l、5。具有两相鞭毛抗原的细菌称为双相菌，仅具有一相鞭毛抗原的细菌称为单相菌。如甲型副伤寒沙门氏菌只具有1相抗原a。3、表面抗原(K抗原)主要包括Vi抗原和M抗原。Vi抗原（微荚膜抗原，virulence）K抗原中的Vi抗原很重要，少数沙门氏菌如伤寒沙门氏

菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌等具有Vi抗原。具有Vi抗原的细菌有抗吞噬作用和保护细菌避免相应抗体

在补体参与下的溶菌作用，故毒力较强。Vi抗原由多糖所组成，很不稳定，不耐热，60℃

30min、100℃

5min、石炭酸处理或人工培养后易

。含有Vi抗

原的细菌悬浮液于无水乙醇或甘油中比较稳定，加热亦不

易破坏。经

处理后，Vi抗原含量虽然减少，但不完全。Vi抗原位于菌体的最表层，罩在O抗原的表面。因此具有Vi抗原的细菌，由于O抗原被Vi抗原所包围，可O抗原与抗O

发生凝集，O抗原不凝集，必须加热60℃30min或100℃5min破坏Vi抗原后，O抗原才能与抗O

发生凝集。Vi抗原对鉴定伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌很重要。凡初步生化反应符合沙门氏菌，而不与A～F群（组）O多价 或各单价 凝集者，均应作Vi凝集试验。（2）M抗原黏多糖成分，大多数沙门氏菌在某种状态下放置（如室温放置）或培养基中含甘油、高浓度盐时产生。M抗原能耐热60℃1h，加热100℃2h后，其可凝集性及抗体产生能力即被破坏，而凝集素结合能力仍然保存。用50％乙醇及1mol/L盐酸处理后，其抗原被灭活。经 处理或60℃处理1h后的活菌抗原，能刺激机体产生M凝集素。除乙型副伤寒沙门氏菌外，M抗原也可见于其他某些沙门氏菌，如鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、幕尼黑沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌，故在菌型鉴定上无特殊意义。4、菌毛抗原（F抗原）沙门氏菌的菌毛有抗原性，用其免疫能获得高效价的

。60℃加热不能改变培养物的菌毛状态，这样处理的菌毛在相应的抗 中仍能发生凝集，并能产生血细胞凝集反应。100℃lh或120℃30min处理后，几乎全部细菌失去菌毛，离心后重新混悬于盐水中，不能再被抗原 凝集。菌毛凝集发生较迅速，呈云絮状，故易与鞭毛凝集

。但不同之处是菌毛凝集不因0.005mol/L盐酸或。以1mol/L盐酸处理20h，凝集，并丧失其血细胞50％

处理而能使它不再与抗菌毛凝集性。(五)抗原变异1、H-O变异H－O变异指有动力的菌株(H型)丧失H抗原而成为无动力的变种(O型)，这些变种性质十分稳定，一般不能逆转。2、S-T-R变异这是指丧失O抗原，由光滑型(S型)过渡到T

(transient)型或粗糙型(R型)的一种变异。T型菌含有一种新的对热稳定的抗原，称为T抗原。T型菌不含有正常的O抗原，是介于S—R型间的过渡形体，其形态光滑，与S型无法鉴别，但不被O

凝集。3、型体变异型体变异指菌体抗原含量的改变，包括O型变异和V－W型变异。O变异沙门氏菌以O抗原分群，其中某些次要抗原1、6和12可出现在一个以上的 群内;例如某些含有O－1

抗原的菌株平板，取单个菌落用特异的O－1

分别鉴定则可发现：有的菌落可能

O－l抗原，结果与O－l

出现了明显凝集(+++)；而另一些菌株可能含

有少量的O－1抗原，所以呈弱凝集反应(+)，甚至

。（2）V－W变异这是指失去Vi抗原的变异。初次从患者分离到的具有Vi抗原的菌株称V菌株。V菌株在人工培养基上多次移种后，逐渐失去Vi抗原而变成W型菌株，但其O及H抗原不受影响，也就是说仍可与相应的O

中发生凝集。4、位相变异位相变异是鞭毛抗原的一种质的改变。这种变异在沙门氏菌中的双相菌中常有，而单相菌不发生这种变异，因而在双相菌鉴定时非常重要。通常在一个培养物内二相并存，一株双相菌移种至平板，l相与2相的菌落各占半数，但挑取单个菌落（第1相或2相)在培养基上多次移种后，其后代又可出现第1相与第2相菌落各半的情况，这种由一相变为另一相的变异，称为位相变异。一株双相菌，如果分离H抗原为单相时，大多是因一相掩盖另一相抗原。此时可用诱导法促使另一相抗原出现，一般都可恢复为双相菌。(六)抵抗力沙门氏菌对热及外界环境的抵抗力属于中等。60℃20min～30min即被杀死；在普通水中虽不易繁殖，但可存活2周～3周；在自然环境的粪便可生存1～2个月；在冰箱中可生存3～4个月；在-25℃可存活10个月左右；在干燥的垫草中可存活8周～20周。当水煮或油炸大块鱼、肉、香肠、肉饼时，若食品 温度达不到足以杀死细菌的情况下，就会有细菌残留。对化学药品的抵抗力较弱。如以5％苯酚或1︰500升处理，5min可杀死；胆盐、煌绿及孔雀绿等对本属细菌的抑制作用较大肠杆菌为小。常可用以

选择性培养基；对氯霉素敏感(目前发现，许多菌株都能抵抗一定浓度的硫胺类、土霉素和链霉素等药品)。（七）沙门氏菌食物沙门氏菌能引起人和动物的疾病，主要是通过消化道传染。沙门氏菌食物 的症状是：急性胃肠炎，如

、腹痛、腹泻和因细菌毒素引起的中枢神经系统症状（如发烧、头痛、有时有痉挛）。少量沙门氏菌一般不会引起

。 发生跟菌量、菌型、毒力大小以及 差异有关。由沙门氏菌所引起的病统称为沙门氏菌病。沙门氏菌病是我国及世界各地常见病及多发病，是现代微生物学、流行病学和传染病学中的重要内容之一。沙门氏菌属的细菌都有致病性。有的

型专对人致病，如伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌为人类的伤寒和副伤寒病原菌；有些

型专对动物致病，如马 和羊

沙门型为宿主特异性较强氏菌为马和羊的病原菌。专对人或专对动物致病的的沙门氏菌。有些

型的沙门氏菌对人和动物都有致病性，它们的宿主特异性较弱。如乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌为人类副伤寒病原菌；鼠伤寒沙门氏菌为鼠伤寒的病原菌；肠炎沙门氏菌、都柏林沙门氏菌为牛伤寒的病原菌等，这些沙门氏菌既为动物的病原菌又是人的致病菌。1、流行病学沙门氏菌是引起食物 的常见病原菌。常见食物中毒沙门氏菌的主要来源见表。2.沙门氏菌污染食物的原因很多，其主要原因为①病畜或病禽

制成食品；②病畜或病禽的粪便污染了食物；③带菌人在制作食物的过程中污染了食物；④生熟食品未分开而造成的交叉污染。当很多人共进同一种染菌食物时，并非所有进食者都得病，而患病类型也常不一致，这与机体反应状态和致病菌的数量有关。中以儿童及其青壮年为多见。病后的免疫力不强，可反复，甚至同一血清型细菌而发病。3、预防①加强食品卫生管理，防止污染：主要应采取积极措施控制沙门氏菌的病畜肉类流入市场。②控制繁殖：沙门氏菌的最适繁殖温度为37℃，但在

20℃以上即能大量繁殖。因此低温食品是一项重要预防措施。③杀灭病原菌：加热杀灭病原微生物也是预防食物中毒的重要措施。（八）沙门氏菌检验程序GB

4789.4-2010GB

4789.4-2010沙门氏菌检验流程前增菌：用无选择性的培养基使处于濒死状态的细菌恢力;BPW选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，其它细菌受到抑制;SC+TTB选择性平板分离培养：BS+XLD/HE/显色培基生化试验：鉴定分离出来的细菌是否符合沙门氏菌的生化谱，可采用API20E等成套生化试剂学鉴定：特异性鉴定到种。BS→XLDDHLHE前增菌BPW（碱性蛋白胨水）：用于修复受损伤的沙门氏菌，但由于其不具有选择性，因此增菌时间过长会导致杂菌生长过多干扰鉴定结果，故建议最好控制在4h为好。增菌后的样品与选择性培养基按1：10加入，例如1mL样品加入10mL

SC中前增菌而直接进行选择性增菌的样品最好与增菌液按1：1稀释，而不可按1：10稀释，因为食品中沙门氏菌数量较少，1：10稀释将降低检出率。常用选择性培养基比较SC

（

酸盐胱氨酸增菌液）TTB（四硫磺酸钠煌绿增菌液）MM酸盐抑菌胱氨酸促生长四硫酸钠和煌绿抑菌氯化镁和孔雀绿抑菌适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长，37℃适合其他沙门菌生长，42℃，18-24h为防漏检宜SC+TTB/MM主要杂菌为大肠埃希氏菌，而两者区别在于是否发酵乳糖，故加入乳糖、酸碱指示剂两个指针来判断可疑菌落加入硫化氢是因为第III属产硫化氢而缓慢发酵乳糖

BS选择性最强，可延长时间以免沙门菌生长亦被抑制多采用BS搭配DHL/SS/HE/WS，互补防漏检指示系统指示效果及可疑菌落特点BS葡萄糖+H2S黑色有金属光泽、棕褐或灰色，周围培基黑或棕色，或不产硫化氢而呈灰绿色DHL乳糖+H2S乳糖（+）：粉红色，（-）：无色半透明无色半透明，产硫化氢者中心黑色SS乳糖+H2SHE乳糖+H2S乳糖（+）：黄色，（-）：蓝色蓝绿色或蓝色，产硫化氢者中心黑色WS乳糖+H2S三糖铁（TSI）试验原理葡萄糖（1g/L）蔗糖（10g/L）乳糖（10g/L）原理：三糖利用培养基：干粉或生化管接种方法：穿刺划线结果：产酸／碱，产气，硫化氢注意：

斜面三糖铁培养基成分除牛肉膏、蛋白胨外，主要有葡萄糖(1g/L)、乳糖(10g/L)、蔗糖(10g/L)、二价铁盐、酚红等，pH为7.4。培养基做好后，摆成斜面，培养基颜色为砖红色。使用时先将待检菌株穿刺接种，然后再将待检菌株划线接种于斜面上，36℃培养18～24h。三糖铁（TSI）反应模式及意义葡萄糖乳糖蔗糖说

明+++分解糖类产酸→pH↓→指示剂变黄→斜面底层均产酸变黄记为A/A模式+--斜面因葡糖含量少故分解完后利用蛋白胨产碱且大于酸量故由黄而深红，记为K，底层无氧故缓慢分解葡糖而产酸变黄记为A，K/A模式++-由于乳糖或蔗糖量大故斜面和底层均产酸变黄，亦为A/A模式+-+若分解硫化氢则产生黑色FeS沉淀，若分解糖类产气则可见气泡或裂缝只有斜面和底层均产酸，且赖氨酸脱羧酶

者才可排除为沙门菌的可能性其余情况既可能是也可能不是沙门氏菌属的细菌化钾和赖氨国标中采用靛基质、尿素、酸四项生化试验。若硫化氢＋、靛基质－、尿素－、

化钾－、赖氨酸＋，可判断为沙门氏菌属，这是典型沙门氏菌的反应。商品化的成套生化试剂盒API生化鉴定系统是法国梅里埃生物公司 的微生物生化检测系列产品，原理是利用细菌对于各类化学物质（碳水化合物、氨基酸及蛋白质、无机盐类等）的代谢能力以及酶类的存在与否等生化特性来鉴定细菌的 法，当反应能够导致反应体系的PH值变化或产生显色物质，加入合适的酸碱指示剂或显色剂就可以反映出来。API试验的本质就是利用生化试验的方法，检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物，常用于细菌的鉴别。1.分离单个菌落2.调制菌液3.将菌液接种到小杯中4.试条放进孵育

箱内，35–37度，18-24h5.附加试剂加进适当小孔内7.将反应结果输入数据库

中得到生化谱代码8.

自动查询报告最符合的菌名6.根据标准色卡判读反应结果梅里埃Vitek-2和其它国产成套试剂玻片凝集法原理单价

：含单一抗体的多价

：含多种抗体的

如A~F多价步骤：先多价后单价，先常见的后不常见的，先O后H，根据结果查表得到鉴定菌种抗原准备：多采用15g/L琼脂斜面培养物若O

不凝集可转种至高含量（2.5

~3%）琼脂培基上，干燥利于O-Ag发育玻片凝集法操作先应在玻片上滴加1滴生理盐水，加入菌苔做对照并观察是否自凝，若有则