生物催化手性药物制备

第十三章生物催化手性药物制备

手性药物的基本知识

用于手性药物制备的生物催化反应

立体选择性生物催化用于手性药物及其中间体的制备

生物催化的优势

生物转化过程实例

手性药物的基本知识手性是自然界的基本特征之一

手性（chirality，源于希腊文）即不对称性，是用于表达化合物分子结构不对称性的术语。

对映关系及对映体（enantiomer）人的手是不对称的，左手和右手不能相互叠合，彼此的关系如同实物与镜像，化学上将这种关系称为对映关系。具有对映关系的两个物体互为对映体。化合物分子中的原子排列是三维的，因而，有时候在平面上看起来相同的分子结构实际上代表不同的化合物。如乳酸的两种构型。在生命的产生和演变过程中，自然界往往对手性化合物的一种对映体有所偏爱，例如组成多糖和核酸的单糖都为D-构型，而构成蛋白质的20种天然氨基酸均为L-构型（甘氨酸除外）。对于化学、生物学、医学和药学的理论和实践，手性均具有重大的意义。

手性药物

严格地说，手性药物是指分子结构中存在手性因素的药物。通常所说的手性药物是指由具有药理活性的手性化合物组成的药物，其中只含有效对映体或者以有效对映体为主。

药物的药理作用是通过其与体内的大分子之间严格的手性识别和匹配而实现的，故不同对映体的药理活性有所差异。在许多情况下，化合物的一对对映体在生物体内的药理活性、代谢过程、代谢速率及毒性等方面均存在显著的差异，常出现以下几种不同的情况。一种对映体有药理活性，而另一种无活性或活性很弱。如左氧氟沙星[S-（-）-对映体]的体外抗菌活性是R-（+）-对映体的8～128倍。又如沙丁胺醇和特布他林是两个支气管扩张药物，它们的R-对映体之药效比S-对映体强80～200倍。

两种对映体具有完全不同的药理活性，都可作为治疗药物。例如右旋丙氧吩是一种镇痛剂，而左旋丙氧吩则是一种止咳剂，两者表现出完全不同的生理活性。又如噻吗心安的S-对映体是β-阻断剂，而其R-对映体则用于治疗青光眼。

两种对映体中一种有药理活性，另一种不但没有活性，反而有毒副作用。一个典型的例子是20世纪50年代末期发生在欧洲的“反应停”事件，即孕妇因服用酞胺哌啶酮（俗称反应停）而导致短肢畸胎的惨剧。后来研究发现，酞胺哌啶酮的两种对映体中，只有(R)-对映体具有镇吐作用，而(S)-对映体是一种强力致畸剂。

两种对映体的药理活性完全相反。如巴比妥类，DMBB[5-(1,3-二甲丁基)-5-乙基巴比妥]和MPPB[N-甲基-5-丙基-5-苯基巴比妥]，左旋体都具有麻醉活性，但右旋体却起促惊厥作用。

两种对映体的作用具有互补性。普萘洛尔的S-（－）-对映体的β受体阻断作用比R-（＋）-强约100倍，而R-对映体对钠通道有抑制作用，两者在治疗心律失常时有协同作用。故外消旋体用于治疗心律失常的效果比单一对映体好。两种对映体具有等同或相近的同一药理活性。如强心药SCH00013的两种对映体的药理作用相同。两种对映体中，一种对映体为另一对映体的竞争性拮抗剂。如左旋异丙肾上腺素是β受体激动剂，而右旋异丙肾上腺素则为其竞争性拮抗剂，且两者与β受体的亲和性相当。对映体纯手性药物的研制和生产具有十分重要的意义。

与手性药物有关的术语

立体异构体、对映异构体和非对映异构体立体异构体（stereoisomers）是指由于分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，可分为对映异构体和非对映异构体两大类。对映异构体(enantiomers)是指分子间互相为不可重合的实物和镜像关系的立体异构体，常简称为对映体。如（R）-乳酸和（S）-乳酸。非对映异构体（diastereoisomers）是指分子中具有两个或多个不对称中心，并且其分子间互相不为实物和镜像关系的立体异构体。例如，D-赤藓糖和D-苏力糖。

对映选择性和对映体过量对映选择性（enatioselectivity）是指一个化学反应所具有的能优先生成（或消耗）一对对映体中的某一种的特性。对映体过量（enantiomericexcess，e.e.）指样品中一个对映体对另一个对映体的过量，用于描述样品的对映体组成，通常用百分数来表示。

e.e.％＝[(S—R)/(S+R)]×100％可用手性色谱法、NMR法和旋光法等方法测定样品的对映体过量。

光学活性、光学异构体和光学纯度光学活性(opticalactivity)试验观察到的化合物将单色平面偏振光的平面向观察者的右边或左边旋转的性质。光学异构体(opticalisomers)对映体的同义词，现已不常用，因为有一些对映体在某些偏振光波长下并无光学活性。光学纯度(opticalpurity)根据试验测定的旋光度，计算而得的在两个对映体混合物中，一个对映体所占的百分数。现在常用对映体纯度来代替。外消旋体和外消旋化外消旋体(raceme)也称外消旋物或是指两种对映体的等量混合物，可用（D,L）、（R,S）或（±）表示。外消旋体也称外消旋物或外消旋混合物。外消旋化(racemization)一种对映体转化为两个对映体的等量混合物（即外消旋体）的过程。如果转化后两个对映体的量不相等，称为部分消旋化。

手性药物的发展概况年份19981999200020012002200320042005销售额(亿美元)9911150123313561460155816531785增长(%1全球手性药物市场销售情况

目前世界上正在开发的1200多种新药中约有三分之二是手性化合物，单一异构体占51％，2005年全球上市的新药中将有60％为单一对映体药物，估计在2010年手性药物销售额将超过2000亿美元。

全球手性药物开发与销售

各国对手性药物的相应规定

对于含有手性因素的药物倾向于发展单一对映体产品，鼓励把已上市的外消旋药物转化为手性药物（手性转换）。对于申请新的外消旋药物，则要求必须提供每个对映体各自的药理作用、毒性和临床效果，不得将不同对映体作为相同物质对待。这无疑大大增加了新药以外消旋体上市的难度。对已上市的外消旋体药物，可以单一立体异构体形式作为新药提出申请，并能得到专利保护。我国在不对称合成研究领域起步较晚，在手性科学研究领域，尤其是不对称合成和手性技术方面的总体水平与世界先进国家之间存在不小的差距。最近几年中，我国政府部门、研究机构及科研人员已经关注到手性科学及技术和手性药物的研究，特别是其中有关的基础研究。国家自然科学基金委分别在“九五”和“十五”期间支持了“手性药物的化学和生物学”及“手性和手性药物研究中的若干科学问题研究”的重大研究项目。中国科学院也将“手性药物的合成与拆分”列为重大项目。这对提升我国手性药物的开发和生产能力，直接面对国际竞争具有重要的现实意义。

国内手性药物的研究现状

手性药物的制备技术手性药物的制备技术由化学控制技术和生物控制技术两部分组成。该两者具有一定的互补性，在手性药物的生产过程中常交替使用。图2手性药物的制备技术分类根据原料的不同，制备手性药物的方法主要分为四大类，即外消旋体拆分、不对称合成、手性源合成和提取法。

外消旋体拆分对用一般的制备方法得到的外消旋体进行拆分，可获得单一对映体。拆分法尽管操作烦琐，但一直是制备光学纯异构体的重要方法之一，在很多手性药物的生产中得到应用。其主要可分为结晶法拆分、动力学拆分和色谱分离三大类。

结晶法拆分又分为直接结晶法拆分和非对映异构体拆分，分别适用于外消旋混合物和外消旋化合物的拆分。前者是在一种外消旋混合物的过饱和溶液中直接加入某一对映体的晶种，使该对映体优先析出；后者是外消旋化合物与另一手性化合物（拆分剂，通常是手性酸或手性碱）作用生成两种非对映异构体盐的混合物，然后利用两种盐的性质差异用结晶法分离之。色谱分离可分为直接法和间接法。直接法又分为手性固定相法和手性流动相添加剂法。其中手性固定相法应用较多，已发展成为吨级手性药物拆分的工艺方法。间接法又称为手性试剂衍生化法，是指外消旋体与一种手性试剂反应，形成一对非对映异构体，再用普通的正相或反相柱分离之。

动力学拆分法是利用两个对映体在手性试剂或手性催化剂作用下反应速度不同而使其分离的方法。依手性催化剂的不同，动力学拆分又可分为生物催化动力学拆分和化学催化动力学拆分。前者主要以酶或微生物细胞为催化剂，后者主要以手性酸、手性碱或手性配体过渡金属配合物为催化剂。不对称合成所谓不对称合成是指一个化合物（底物）中的非手性部分在反应剂作用下转化为手性单元，并产生不等量的立体异构体的过程。其中，反应剂可以是试剂、辅剂、催化剂等。

按照反应剂的影响方式和合成方法的演变和发展，可将不对称合成的方法粗略地划分为四代。

第一代方法，即底物控制方法，其通过手性底物中已经存在的手性单元进行分子内定向诱导而在底物中产生新的手性单元。

第二代方法也称辅基控制法。它通过连接在底物上的手性辅基进行分子内定向诱导而实现手性控制。与第一代不对称合成的不同点在于，起不对称诱导作用的辅基要事先连接到底物上，并在反应结束后除去。

第三代方法，即试剂控制法，是通过手性试剂直接与非手性底物作用，产生手性产物的方法。与前两代方法不同的是，其立体化学控制是依赖分子间的相互作用来实现的。

第四代方法为催化剂控制法，它使用催化剂诱导非手性底物与非手性试剂反应，向手性产物转化。其通过分子间的相互作用来实现立体化学控制。根据所用催化剂的不同，第四代方法又可分为化学催化法和生物催化法。迄今，用于不对称合成的最好的反应剂当属自然界中的酶，发展象酶催化体系一样有效的化学催化体系是不对称合成的重要发展方向。

手性源合成手性源合成指的是以廉价易得的天然或合成的手性源化合物为原料，通过化学修饰方法将其转化为手性产物的方法。产物构型既可能保持，也可能发生翻转或手性转移。用于制备手性药物的手性原料主要有三个来源，一是自然界中大量存在的手性化合物，如糖类、萜类、生物碱等；二是以大量廉价易得的糖类为原料经微生物发酵得到的手性化合物，如氨基酸、羟基酸等简单手性化合物和抗生素、维生素、激素等复杂的手性化合物；三是以手性或前手性化合物为原料化学合成得到的手性化合物。尽管合成一个手性化合物最简便的方法是挑选结构相近的手性源进行手性源合成，但手性源合成法仅适用于能找到与产物具有相似结构手性源的情况，故应用受到一定的限制。

提取法在天然产物中，存在大量可直接作为药物的手性化合物，如生物碱、维生素等。这些化合物可通过萃取、沉淀、层析、结晶等手段提取得到，如从红豆衫的树皮中提取对乳腺癌等有很好疗效的抗肿瘤手性药物紫杉醇。然而，该法也有其缺陷。首先，有些物质在自然界中的含量极低，其分离纯化十分困难；其次，自然界往往只给我们提供一种异构体，其他构型的异构体可能不存在；此外，还有很多手性化合物在自然界根本不存在或尚未被发现，无法通过提取法得到这些物质。

用于手性药物制备的生物催化反应

氧化反应氧化反应是向有机化合物分子中引入功能基团的重要反应之一，其在手性药物的合成中具有重要的作用。用于手性药物制备的催化氧化反应的酶主要有单加氧酶、双加氧酶和脱氢酶。

单加氧酶（mono-oxygenases）催化的氧化反应单加氧酶主要有细胞色素P450类单加氧酶以及黄素类单加氧酶，前者以铁卟啉为辅基，后者以黄素为辅基。单加氧酶催化氧分子中的一个氧原子加入到底物分子中，另一个氧原子使还原型辅酶NADH或NADPH氧化并产生水（图3）。

可催化烷烃、芳香烃化合物的羟化、烯烃的环氧化、含杂原子化合物中杂原子的氧化以及酮的氧化等反应，且反应的立体选择性较高。

常采用完整细胞作为催化剂。例如，假丝酵母属、假单胞菌属微生物细胞均能催化异丁酸不对称羟化产生可用于合成维生素、抗生素的光学活性的β-羟基异丁酸。

双加氧酶(dioxygenases)催化的氧化反应

双加氧酶催化氧分子的两个氧原子加入到同一底物分子中（图4）。常见的双加氧酶有脂氧酶、过氧化物酶等，可催化烯烃的氢过氧化反应、芳烃的双羟基化反应等。脱氢酶催化的氧化反应脱氢酶可催化氧化和还原双向可逆反应。在底物为还原态、辅酶为氧化态NAD(P)＋时催化氧化反应为主。其机理是催化底物脱氢，脱下来的氢与NAD(P)＋结合。脱氢酶催化的氧化反应具有高度的立体选择性。例如，马肝醇脱氢酶（HLADH）可催化外消旋醇对映选择性地氧化而使之得以拆分(图5)。图5马肝醇脱氢酶催化氧化反应拆分二元醇

还原反应生物催化的还原反应在手性药物的合成中具有重要的应用。氧化还原酶类可以催化酮或者醛羰基以及潜手性烯烃的不对称还原，使潜手性底物转化为手性产物。在酶促底物加氢的同时，还原型辅酶转化为氧化型辅酶。由于辅酶一般不太稳定，且价格昂贵，能否将辅酶再生循环使用，即将氧化型辅酶转变为还原型辅酶就成为制约该反应工业应用的重要因素。目前主要通过在反应过程中添加辅助性底物（底物偶联法）、利用两个平行氧化还原酶系统（酶的偶联法）以及完整细胞还原体系等实现辅酶再生(图6)。图6

生物催化的还原反应

催化常用于手性药物制备的还原反应的酶主要有酵母醇脱氢酶(YADH)、马肝醇脱氢酶（HLADH）、布氏热厌氧菌醇脱氢酶和羟基甾体脱氢酶(HSDH)等。它们可立体选择性地催化酮还原为手性仲醇，其选择性一般遵循Prelog规则，即它们催化氢负离子从空间位阻较小方向进攻羰基，形成构象稳定的优势中间体。但也有一些微生物的醇脱氢酶催化还原反应时不遵循Prelog规则，如假单胞菌属的醇脱氢酶。

酵母细胞内含有可催化还原反应的多种酶和辅酶，用其作为生物催化剂可省去酶的分离纯化步骤，同时不需要添加昂贵的辅酶或额外的辅酶再生循环系统，因之，可大大降低生产成本。必须指出的是，酵母细胞催化的生物转化由于副反应而变得复杂，同时可能会使产物的分离纯化比较困难。另外，细胞和底物的理想的相互作用在实践中很少见。理想的相互作用包括底物和产物均能透过细胞膜，它们在发酵液中可溶，不使目标酶失活。且反应具有高转化率和高选择性。

游离酵母细胞和固定化酵母细胞均可用于催化还原反应。酵母细胞可催化单羰基化合物的还原、双羰基化合物的还原、硫羰基和硫取代的化台物的还原及含氮羰基化台物的还原。

酵母细胞还能催化非天然的有机硅酮的不对称还原。不同酵母细胞的底物专一性有一定的差异。如，面包酵母细胞催化含有芳香基团的有机硅酮的不对称还原时，产物的收率及对映体纯度均可达90%以上；若底物中不含芳香基团，该反应的产率及产物的对映体纯度均较低。而酿酒酵母细胞能催化不含芳香基团的三甲基硅乙酮（ATMS）的不对称还原(图7)，在最适的反应条件下，最高产率及对应的产物光学纯度分别为96.8％和95.7％(LouWY,ZongMH,etal.EnzymeandMicrobialTechnology,2004,35(2-3):190-196)。图7Saccharomycescerevisiae酿酒酵母细胞催化ATMS不对称还原反应

水解反应及其逆反应在手性药物及其中间体的制备中应用最为广泛的水解反应及其逆反应主要有酯水解、腈水解、环氧化合物水解、酰胺水解、酯化、酰胺化等（图8）。图8

生物催化的水解反应的主要类型

常用的脂肪酶主要有猪胰腺脂肪酶、假丝酵母属脂肪酶、假单胞菌属脂肪酶和毛酶属脂肪酶。不同来源的脂肪酶，其氨基酸残基的数量从270到641个不等，且疏水性氨基酸残基比亲水性氨基酸残基多。虽然这些脂肪酶的氨基酸序列大不相同，但都具有一个共同的结构特点，即含有β-折叠的核和被α-螺旋包围并指向酶的活性中心的三元复合物，这个复合物由Asp-His-Ser或His-Ser-Glu组成。研究表明，组氨酸（His）和丝氨酸（Ser）是酶活性部位的必需氨基酸残基。其活性部位的三元复合物与其它氨基酸在脂肪酶分子的中心形成的一个疏水性“套子”，表面是一个由疏水作用和静电作用所稳定的α-螺旋片段组成的“盖”或“罩”，它覆盖着脂肪酶的活性部位，不同脂肪酶其“盖”或“罩”的结构不同,导致其催化特性的不同。研究开发不同种类的脂肪酶可扩展其在手性合成中的应用。

近期的研究表明，许多脂肪酶在绿色反应介质离子液体中能催化酯的不对称水解，且选择性和稳定性高于其在水中的对应值。例如，Mohile等报道在离子液体-缓冲液混合反应介质中，皱落假丝酵母脂肪酶（CRL）能高效地催化2-(4-氯苯氧基)丙酸丁酯不对称水解，所得到的产物(R)-2-(4-氯苯氧基)丙酸的对映体纯度（99％e.e.以上）远远高于在水相中的相应值（47％e.e.），并且在离子液体中CRL的热稳定性也提高了。

酯水解反应

酯酶能较好地识别手性中心在水解反应位点附近的底物分子，但酯酶催化极性或高亲水性化合物水解反应的效率不高。常用于催化酯水解反应的酯酶主要有猪肝酯酶和各种微生物酯酶。催化酯水解反应的微生物酯酶既可以是离体酶，也可以是完整的微生物细胞。枯草杆菌、芽孢杆菌、产氨短杆菌和面包酵母等都是常用于催化酯水解的微生物。例如，芽孢杆菌细胞能立体选择性地催化一种羟基醛羧酸酯衍生物的水解，得到一种高对映体纯度的α-羟基醛缩丙二硫醇衍生物。又如，面包酵母细胞能能催化外消旋的乙酸-1-炔-3-醇酯的不对称水解，从而实现该外消旋体的拆分。许多蛋白酶，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、米曲霉蛋白酶等都能选择性地催化天然或者非天然的羧酸酯的水解。如α-胰凝乳蛋白酶能催化外消旋α-硝基丁酯不对称水解生成不稳定D-α-硝基羧酸，其自发脱羧生成仲硝基化合物，产率和产物对映体纯度都很高；在离子液体中，许多蛋白酶均能维持其催化活性构象，并表现出较高的选择性和稳定性。如娄文勇等在用木瓜蛋白酶催化对羟基苯甘氨酸甲酯不对称水解反应的研究中发现，以含12.5％离子液体（1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐）的磷酸缓冲液(50mM，pH7.0)作为反应介质,产率和产物对映体纯度均大大高于在水相、有机溶剂中进行该反应所获得的对应值（图9）(LouWY,ZongMH,WuH.BiocatalysisandBiotransformation,2004,22(3):171-176)。图9离子液体-缓冲液混合溶剂中酶促对羟基苯甘氨酸甲酯不对称水解反应

腈水解反应

在有机合成中，腈是一类重要的化合物，它可以方便地通过化学合成得到，而且可进一步转化成具有更高价值的酰胺和羧酸。但是利用化学手段将腈转变成酰胺或羧酸通常要求高温、昂贵的试剂，或者需要在强酸(6mo1/L盐酸)或强碱(2mol/L氢氧化钠溶液)条件下进行，在后续的中和反应中会产生大量盐。而酶促腈水解在实现节能的同时拥有以下优势：温和的反应条件，高选择性，产物纯度高，无副产物及盐、金属类废物。酶促腈水解有两条途径，其一，通过腈水合酶转化为酰胺，再由酰胺酶催化其水解为相应的羧酸；其二，由腈水解酶直接催化其水解为羧酸。酶催化腈水解反应不仅得到光学活性羧酸,而且还能合成光学活性酰胺化合物,后者可进一步转化为光学活性胺和其它含氮化合物。故腈的酶法水解已被广泛应用于光学活性氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成（图10）。

腈水合酶催化腈转化为相应酸的两步酶转化过程中的第一步，即腈化合物水合转化为酰胺的过程。这些酶是金属酶，酶分子中含有铁或钴，存在于多种革兰氏阳性和阴性细菌中。图10

酶法腈水解的途径

腈水解酶直接催化腈水解得到相应的羧酸。相对于腈水合酶而言，腈水解酶的立体选择性较高。它们主要以芳香腈为底物，较少以脂肪腈为底物。立体专一的腈水解酶可用于光学活性氨基酸、脂肪酸、羟基酸等的合成。

例如，固定化于海藻酸盐的Acinetobactersp．APN（不动杆菌）菌株的细胞产生的L专一的腈水解酶能催化α-氨基腈水解转变成有光学活性的L-氨基酸。

2-芳基丙酸是一类重要的抗炎药物，而且仅(S)-异构体具有生物活性。在这类化合物中，(S)-萘普生、(S)-布洛芬、(S)-酮洛芬是最成功的药物。现已发现能选择性地催化2-芳基丙腈水解为(S)-芳基丙酸的腈水解酶。例如，可用R.rhodochrousATCC21197菌株中的立体选择性腈水解酶转化2-芳基丙腈为相应的(S)-芳基丙酸。其中合成2-(4-甲氧基苯基)丙酸的化学收率和产物的对映体过量最高，分别为46％和99％。

腈水合酶一般对映体选择性较低，迄今，腈水合酶催化反应的产物e.e.高于75％的例子很少，但也有一些来源的腈水合酶具有较高的对映体选择性。如在Rhodococcussp．AJ270所产腈水合酶用于以腈为原料制备(R)-2-苯基丁酰胺，产物的对映体过量可达到80％以上，该反应不生成副产物酸。

环氧化物水解图11生物催化芳香族环氧化合物水解

环氧化物是一类重要的有机合成物，是许多生物活性物质合成的原料，因此，其在有机合成中被广泛地利用。一般可用化学法制备环氧化物，但反应的立体选择性不高。环氧化物水解酶能催化环氧化物进行区域和对映体选择性水解，从而能用于制备所需构型的环氧化物。

环氧化物水解酶广泛存在于哺乳动物、植物、昆虫、丝状真菌、细菌以及赤酵母中。在哺乳动物中，环氧化物水解酶在外源性化合物，尤其是芳香烃化合物的代谢中发挥重要作用。环氧化物水解酶将芳香烃经单加氧酶催化氧化得到的、具有致畸、致癌作用的芳烃环氧化物水解为生物惰性的反式1,2-二醇，后者可被生物体进一步分解代谢和排泄。

迄今为止已发现的哺乳动物环氧化物水解酶按酶活性和生化特征可分为5类，即可溶性环氧化物水解酶(sEHs，也称脆质环氧化物水解酶)、微粒体环氧化物水解酶(mEHs)、白三烯A4水解酶(LTA4H)、胆固醇环氧化物水解酶和hepoxilin水解酶。

环氧化物水解酶不仅能从哺乳动物肝细胞中，也能从微生物，如巨大芽孢杆菌、棒杆菌、假单胞菌属以及真菌如Ulocladiumatrum和Zopfiellakarachiensis中纯化得到。最近，从红球菌NCIMBll216株和诺卡氏菌TBl株中纯化并鉴定了两种环氧化物水解酶，它们具有高活性和高对映选择性。

环氧化物水解酶不仅能从哺乳动物肝细胞中，也能从微生物细胞，如巨大芽孢杆菌、棒杆菌、假单胞菌属以及真菌如Ulocladiumatrum和Zopfiellakarachiensis中纯化得到。最近，从红球菌NCIMBll216株和诺卡氏菌TBl株中纯化并鉴定了两种环氧化物水解酶，它们具有高活性和高对映选择微生物环氧化物水解酶在手性合成中的应用尚不多，主要用于催化单取代环氧乙烷、2,2-双取代环氧化物、2,3-双取代环氧乙烷、环状2,3-二取代环氧化物、三取代环氧化台物等的水解。

由于可用于制备多种光学纯的环氧化合物和1,2-二醇，微生物来源的环氧化物水解酶近期备受重视。细菌环氧化物水解酶具有许多优点，例如，不需辅助因子、可采用冻干细胞和粗酶制剂代替纯酶、稳定性好等。可以预言，在不久的将来，微生物环氧化物水解酶将广泛应用于光学纯环氧化物和邻二醇的制备。

酰胺水解

酰胺水解是制备广泛用于手性药物合成的光学活性氨基酸的重要途径。常用于催化酰胺水解的酶主要有氨基酰胺酶、氨基酰化酶、乙内酰脲酶等。图12氨基酰胺酶催化氨基酰胺水解拆分

氨基酰胺酶又称氨肽酶，存在于动物肾脏、胰腺和多种微生物，尤其是假单胞菌、红球菌、分支杆菌和曲霉属的微生物中。它能催化外消旋氨基酸酰胺不对称水解生产L-氨基酸，L-氨基酸和未水解的D-氨基酸酰胺的溶解度不同，可据此将它们分离，得到光学纯度较高的L-氨基酸。通过氨基酰胺酶催化酰胺水解制备光学活性的氨基酸具有许多优势，如前体物很容易得到；可用微生物细胞作催化剂，价格便宜，且避免很复杂的分离纯化酶的过程；可制备高对映体纯度的L-α-氨基酸和D-α-氨基酸。图13酰化酶催化消旋体L-N-酰基氨基酸水解拆分

氨基酰化酶能选择性地催化L-N-酯酰氨基酸水解，生成L-氨基酸。霉菌、细菌、放线菌等微生物细胞菌产氨基酰化酶，该酶也能以猪肾为原料提取。氨基酰化酶催化的酰胺水解反应不但可用于多种光学活性氨基酸，如L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸等的生产，还能用于半合成抗生素，如氨苄青霉素的合成。1969年，日本田边制药公司首次采用固定化氨基酰化酶进行DL-氨基酸的工业规模的拆分，连续生产L-氨基酸，生产成本仅为采用游离酶生产成本的60%左右,开创了固定化酶工业化生产的先河。

乙内酰脲酶也称海因酶，能催化5-取代乙内酰脲水解得到的N-氨甲酰基-α-氨基酸可通过亚硝酸或氨甲酰酶催化水解转变为α-氨基酸。由于既有L-氨甲酰酶，又有D-氨甲酰酶,且乙内酰脲酶和氨甲酰酶的底物范围均很广，通过这些酶的作用，可将许多不同结构的5-取代乙内酰脲转化为光学纯的氨基酸。该法已在光学活性的非天然L-α-氨基酸和D-α-氨基酸的生产中得到广泛应用。如图14所示。例如，D-苯甘氨酸、D-对羟基苯甘氨酸、L-对氯苯丙氨酸等均可采用该法制备。图14海因酶催化海因水解制备氨基酸

氨解反应

近年来的研究表明,许多水解酶类,如脂肪酶、蛋白酶等,不仅可以催化水解反应,而且能够在非水介质中催化其逆反应，例如，它们能催化以氨、胺或者肼为非天然酰基受体的酯或酸的氨解反应，形成酰胺。与传统的化学法相比,通过酶促酯或酸氨解的途径使之酰胺化具有条件温和、专一性强、催化效率高的优点。

酶促酯氨解反应的机理为：酶活性中心丝氨酸残基中的羟基亲核进攻酯中的羰基碳，形成酶-酰基中间体,之后亲核试剂氨、胺或者肼进攻酶-酰基中间体，形成产物酰胺，酶同时恢复其原形。所形成的产物酰胺广泛应用手性药物的合成。近年来，人们对有机介质中酶促酯的氨解反应进行了广泛研究。来自CandidaantarcticatypeB(Novozym435)的脂肪酶因具有耐高浓度氨的能力而能有效地催化酯的不对称氨解,在有机溶剂中生成稳定的酰胺。由于许多酰胺在有机溶剂中溶解度低,因此在氨解反应过程中易于从反应体系析出,这不但能实现产物的在线分离,而且有利于平衡向产物形成的方向移动。

酶促酯氨解反应可用于外消旋氨基酸的动力学拆分。例如，Ｄ-苯甘氨酸是氨苄青霉素、头孢氨苄和头孢拉定等药物的重要侧链，利用脂肪酶催化外消旋苯甘氨酸甲酯对映体选择性氨解反应可制备高光学纯度的Ｄ-苯甘氨酸。研究发现。在反应体系中添加一些盐或表面活性剂能有效地提高酶的氨解活性和对映体选择性。

在离子液-叔丁醇混和反应介质中，Novozym435能高效地催化对羟基苯甘氨酸甲酯与氨基甲酸铵不对称氨解反应，其反应速度和对映体选择性均显著高于不含离子液体反应体系中的相应值（图15）(LouWY,ZongMH,WuH,etal.Greenchemistry,2005,7(7):500-506)。图15含离子液体介质中脂肪酶促对羟基苯甘氨酸酯不对称氨解反应

酯化反应

酯化，这一受热力学限制不可能在水介质中发生的反应，可在非水介质中被多种酶，如脂肪酶、蛋白酶等催化。该反应在有机合成中特别有用，因为这些酶可催化大量不同类型的有机化合物的酯化，并具有高度立体选择性。图16脂肪酶PSL催化外消旋醇不对称酯化（或酰化）

酶促酯化反应在手性合成中已有许多应用。例如,C.rugosa脂肪酶能高对映选择性地催化外消旋-2-羟基壬酸与正丁醇在甲苯中发生酯化反应，所获产物的光学纯度很高，可用于合成抗微生物制剂(4R,7S)-7-甲氧基十四烷-4-烯酸。

以酸酐为酰基供体进行醇的酰化反应具有很多优点，如避免逆反应、有利于反应体系中水含量的控制。在有机介质中，当脂肪酶催化酸酐与外消旋醇进行酯化反应时，后者可被拆分。酶催化醇与外消旋环状酸酐或内消旋环状酸酐的酯化反应，能对映选择性地打开环状酸酐的环，是制备高光学纯度酯的好方法。乙烯基酰化物作酰基供体。在这个反应中，由于反应产物乙烯醇发生异构作用，生成乙醛，且该异构反应是不可逆的，因此阻止了逆反应的发生。但是乙醛在有机介质中易与某些脂肪酶如C.rugosa脂肪酶分子中的赖氨酸残基形成Schiff碱，使酶的活性降低甚至失活。最近，我们通过将反应置于离子液体中进行，有效地解除了乙醛对脂肪酶的失活作用(图17)(LouWY,ZongMH.Chirality,2006,18(10):814-821)。

图17离子液体或有机溶剂中脂肪酶促(R,S)-1-三甲基硅乙醇与乙酸乙烯酯不对称酰化反应

裂合反应

裂合酶能够催化含有C-C、C-N、C-O等键的化合物裂解为两种化合物及其逆反应,常用的有醛缩酶、脱羧酶、水合酶、氰醇裂解酶（又名醇腈酶）等。醛缩酶能不对称催化作为供体的亲核性酮与作为受体的亲电性醛的不对称加成，形成C-C键，并能使醛的碳链延长2-3个碳单位，该反应可逆并且立体选择性可控，在有机合成中很有用，常用于糖，如氨基糖等的合成。绝大多数醛缩酶对底物醛结构的要求很高（常为乙醛），但对底物酮的结构特异性不高。现已研究过40多种醛缩酶，这些酶的天然底物是碳水化合物，因此醛缩酶催化碳水化合物合成的研究较多。根据供体底物的类型，可以将醛缩反应分为四组,见表2。

用于催化C-C键形成的醛缩酶对于具有生物活性的复杂多官能团分子的不对称合成特别有用，且专一性高，近年来，其在手性合成中的应用发展很快。例如，兔肌肉醛缩酶可以催化其天然底物的结构类似物如含氮或含硫糖以及脱氧糖的合成；又如L-苏氨酸醛缩酶很够催化β-羟基-α-氨基酸的合成。

光学活性氰醇是一类重要的手性合成子，它可以很容易地转化为α-羟基醛、α-氨基醇、β-羟基-α-氨基酸和α-羟基酸等许多光学活性化合物，因而广泛应用于医药、农药和精细化工等行业。醇腈酶（oxynitrilaseorhydroxynitrilelyase,HNL）催化醛或酮与HCN的不对称加成是制备手性氰醇的重要途径。根据存在FAD辅酶与否，可将醇腈酶分成两类，其特性如表3所示。不含FAD的各种醇腈酶在底物专一性、分子量及其基因序列上均有较大的差异；含FAD的醇腈酶（FAD-醇腈酶）是一种单链糖基化的蛋白，其天然底物是(R)-(+)-扁桃腈，可水解(R)-(+)-扁桃腈生成HCN和苯甲醛。EnzymesourceCo-enzymeNaturalsubstrateOptimumpHR/SselectivityPrunusamygdalus(almonds)FAD(R)-mandelonitrile5-6RLinumusitatissimum(seedlings)NoAcetonecyanohydrin,(R)-2-butanonecyanohydrin5.5RSorgumbilolor(gramineae)No(S)-4-hydroxy-mandelonitrile-SManihotesculenta(leaves)NoAcetonecyanohydrin,(S)-2-butanonecyanohydrin5.4SHeveabrasiliensis(leaves)NoAcetonecyanohydrin5.5-6S表3常见醇腈酶的特性

已知三叶胶树和木薯醇腈酶的三维结构，它们属于α/β类水解酶，不含有FAD辅酶。根据产物的构型，醇腈酶可分为(R)-醇腈酶和(S)-醇腈酶两种类型。

(R)-醇腈酶催化的底物特征如下：(1)芳香醛是最好的底物，其取代基可以在邻位或对位；杂环芳烃如呋喃、噻吩类衍生物也是较好的底物；(2)链长不超过6个碳原子的直链脂肪醛和α,β-不饱和醛以及α-位甲基取代的醛也可作为底物；(3)甲基酮可被转化为氰醇，然而乙基酮的转化率很低。而(S)-醇腈酶底物特异性高，但催化反应的速度不及(R)-醇腈酶，产物的光学纯度也不高。

醇腈酶还能以非天然的有机硅酮为底物。例如，不同来源的醇腈酶均能在水/有机溶剂组成的两相反应介质中催化有机硅酮与丙酮氰醇的不对称转氰反应，制备光学活性的有机硅氰醇，该反应具有高效性和高选择性，在优化的反应条件下，产率和产物的光学纯度均高达99%以上(XuR,ZongMH,etal.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2004,66(1):27-33)。该酶在离子液体中也能保持一定的活性和较高的对映体选择性(Lou

WY,XuR,ZongMH.BiotechnologyLetters,2005,27(18):1387-1390)。近年来，人们对HCN或三甲基硅腈与醛不对称加成获得手性醛氰醇进行了广泛的研究，并取得相当好的结果。例如，早在1908年，人们就研究了杏仁醇腈酶催化苯甲醛与HCN加成生成扁桃腈的反应，这是利用酶进行不对称合成的最早尝试。由于在水相中同时发生非对映体选择性的化学加成反应，产物的对映体纯度不高，故该反应当时未能应用于有机合成中。在有机介质中，化学加成反应能被有效地抑制，故能获得高对映体纯的产物。该发现极大地促进了醇腈酶催化手性氰醇合成的研究和实际应用。

立体选择性生物催化用于手性药物及其中间体的制备

生物催化剂为高度手性的催化剂，其催化反应有许多优点，如，能在温和的条件下发挥催化作用，减少在化学过程中常出现的异构化、外消旋化等问题；且催化效率高；具有高度的立体选择性,反应产物的对映体过量（e.e.）有时可达100％；环境污染小。因此生物催化法是制备手性药物的有效途径之一。由于酶的底物谱通常较窄，应用酶法合成一些非天然产物尚存在一定困难和局限性。目前,手性新药的开发,通常采用化学-酶法(chemo-enzymaticmethod)，即利用酶或微生物细胞作为催化剂对化学合成路线中某一个手性中间体进行不对称合成或拆分,再用其合成光学纯的手性药物。

生物催化外消旋手性药物及其中间体的拆分利用酶对对映体的识别作用，可有效地拆分外消旋药物及其中间体的不同对映体。其主要特点是拆分效率和立体选择性高、反应条件温和。

外消旋药物的拆分当外消旋药物分子中含有手性羟基、羧基或酯基时，可直接利用酶进行拆分,获得具有所需构型的光学活性药物。

非甾体抗炎类药物

非甾体抗炎类药物(nonsteroidalanti-inflammatoryagents)临床上广泛用于治疗关节炎等人结缔组织疾病。其活性成分是2-芳基丙酸衍生物CH3CHArCOOH,如萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、酮基布洛芬(ketoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)等(图18)。研究表明，该类药物的的(S)-对映体具有较高活性，如(S)-萘普生在体内的抗炎活性是(R)-对映体的28倍。目前，只有萘普生是以单一对映体的形式上市，其余均以外消旋体供药，因此，近年来用酶法拆分2-芳基丙酸衍生物引起了人们的广泛重视。图182-芳基丙酸类非甾体消炎药

萘普生

萘普生是用量较大的一种非甾体消炎药，世界年销售额在十亿美元以上。目前使用的光学纯(S)-萘普生主要采用不对称化学合成或合成消旋体再拆分法制备。近年来，用酶法拆分外消旋萘普生的研究报道甚多。意大利的Battistel等将柱状假丝酵母脂肪酶CCL(Candidacylindracealipase)固定化在离子交换树脂AmberliteXAD-7上，并装填于500mL柱式反应器中，连续水解外消旋体萘普生的乙氧基乙酯，在35℃下反应1200h，得到18kg的光学纯(S)-萘普生，且酶活几乎无损失，该工艺极具工业生产价值(图19)。英国Chirtech公司通过筛选和分子进化对一种酯酶进行改造,提高了酶的立体选择性。该酶只水解(S)-萘普生酯,底物浓度可达到150g/L,反应残留的(R)-萘普生酯可通过碱催化消旋化再拆分。产物可通过结晶分离,操作简单。该工艺目前在印度的ShasunChemicals公司进行中试。图19固定化CCL催化外消旋萘普生酯水解

布洛芬用马肝酯酶选择性水解拆分外消旋布洛芬乙酯可制备(S)-布洛芬(图20)，当反应进行11h,转化率达40％时,布洛芬的e.e.值为88％,残留酯的e.e.值为60％，而当反应进行到18h,转化率为58％时,布洛芬的e.e.值为66％，而残留酯的e.e.值＞96％。酶法拆分布洛芬的另一途径是采用选择性酯化反应。在有机溶剂中对布洛芬进行酶促酯化反应时加入少量的极性溶剂,可明显提高酶的立体选择性。例如在酯化反应体系中加入二甲基甲酰胺后,产物(S)-布洛芬的e.e.值从57.5％增加到91％。布洛芬的酶法拆分目前已达到克级规模。

图20布洛芬的酶法拆分5-羟色胺拮抗剂类药物5-羟色胺(5-HT)是一种与精神疾病有关的重要的神经递质。现有一些药物的毒性就在于其不能选择性地与5-HT受体反应。目前至少已发现7种5-HT受体。药物与受体结合的亲和力和选择性在很大程度上受药物的立体化学结构影响。目前，一种新的5-HT拮抗物MDL的活性(其中R异构体的活性是S异构体的100倍以上)是以前知名的5-HT拮抗物酮色林的活性的150倍，其原因在于(R)-MDL能够高选择性地与5-HT受体相结合。MDL的拆分可在有机相中进行，选择性酯化反应的产物是(R,R)-酯,残留的为(S,S)-醇，反应过程如图21所示。图21脂肪酶拆分5-HT拮抗物MDL

粘多糖类药物

粘多糖类药物索布瑞醇（sobrerol）是一种粘液溶解药，其活性成分是(1S,5R)-反式索布瑞醇。将Pseudomonascepacialipase（PCL)吸附在硅藻土上，催化外消旋反式索布瑞醇酰化可将其拆分，制备(1S,5R)酯，再经简单的化学水解得到(1S,5R)-反式索布瑞醇，产物的e.e.＞98％，产率25％（图22）。图22BCL催化外消旋反式索布瑞醇酰化反应手性药物中间体的拆分

β-阻断剂β-阻断剂是一类重要的心血管药，临床上用于治疗高血压和心肌梗死类疾病。结构通式为：ArOCH2CH(OH)CH2NHR，有普萘洛尔(propranolol，俗名“心得安”)、阿替洛尔(atenolol)和倍他洛尔(betaxolol)等二十多个品种。该类药物的(S)-对映体活性显著高于(R)-对映体，如(S)-心得安和(S)-美多心安的活性分别是其(R)-对映体的100、270～380倍。(S)-普萘洛尔是一类重要的β-阻断剂，而其(R)-对映体则具有避孕作用。化学法只能获得外消旋的普萘洛尔。在现有的合成(S)-普萘洛尔的各种方法中，以图23所示的途径较为经济合理。从萘酚出发，采用PCL拆分萘氧氯丙醇酯，成功制备了(S)-普萘洛尔和(R)-普萘洛尔，产物的e.e.＞95％，产率48％。图23化学-酶法合成普萘洛尔

环氧丙醇及其衍生物

手性环氧丙醇及其衍生物具有简单的甘油骨架和特殊的结构及官能团，其作为光学活性化合物的重要中间体，具有很大的应用潜力，被称为通用型的多功能手性合成子。例如：手性环氧丙醇可作为前体，合成β-阻断剂如普萘洛尔和阿替洛尔、治疗爱滋病的HIV蛋白酶抑制剂、抗病毒药物等。日本田边制药成功地用脂肪酶拆分了外消旋的甲基-3-(4-甲氧基苯基)环氧丙酯，制备了(-)-(2R,3S)-3-(4-甲氧基苯基)环氧丙酰胺(图24),它是生产硫氮卓酮(一种心血管药物)的手性前体，目前利用该技术可以达到年产数百吨规模。美国的Sepracor公司采用相似的技术在生物膜反应器中制备手性环氧丙酯，规模达到数公斤。另外，荷兰的DSM-Andeno公司开发了采用猪胰脂肪酶(Porcinepancreaticlipase，PPL)拆分外消旋丁酸环氧丙酯制备(R)-丁酸环氧丙酯的技术(图25)，目前已达到工业水平，年产(R)-丁酸环氧丙酯数吨。图25脂肪酶催化外消旋丁酸环氧丙酯的拆分图24脂肪酶催化外消旋3-甲基-(4-甲氧基苯基)环氧丙酯的拆分

α-酮基醇α-酮基醇是合成许多生物活性物质的重要中间体，以前也曾尝试过利用酵母催化α-酮基的还原反应进行拆分，但效果不理想。德国Adam等用脂肪酶对其进行选择性酯化(图26)，取得了较好的效果：反应转化率为58%，(S)-醇的e.e.值为98%。图26α-酮基醇的酶法拆分

生物催化手性药物及其中间体的不对称合成

不对称合成是直接将潜手性底物转化为所需的手性化合物，产物光学纯度高，转化率可接近100％。因此该法更简单，更具有工业化价值。手性药物及其中间体合成中涉及的酶或微生物催化的反应类型主要有氧化反应、还原反应、转移和裂合反应等。

不对称还原反应

用于不对称还原反应的氧化还原酶须有辅酶的参与，所需的辅酶绝大多数是NAD(H)及其相应的磷酸酯NADP(H)，辅酶的价格昂贵且难以回收循环使用，而微生物细胞中不仅存在多种脱氢酶，具有广泛的底物适应性，而且所需的辅酶循环可由细胞自动完成，同时酶和辅酶均保护于细胞的天然环境中，稳定性较好，所以一般利用微生物细胞进行反应。Broxatherol临床上用作支气管扩张剂治疗哮喘。其(S)-对映体活性至少是(R)-对映体的100倍。从一株高温厌氧菌(Themoanerobiumbrockii)中分离的醇脱氢酶(TbADH)可催化其合成(图27)。由于反应过程消耗辅酶NADPH，需要在反应体系中加入2-丙醇，作为电子供体在醇脱氢酶作用下将产生的NADP+还原为NADPH。图27TbADH促不对称合成(S)-Broxatherol(S)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸甲酯是一种通过抑制羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶而起作用的胆固醇抑制剂1的关键手性合成子,可由前手性酮经GeotrichumcandidumSC5469悬浮细胞催化还原合成。也可采用相同的方法合成具有类似作用的胆固醇抑制剂2的手性合成子(图28)。图28微生物细胞催化还原反应合成胆固醇抑制剂2S-(-)-4-氨基-2-羟基丁酸(S-AHBA)是半合成糖苷类抗生素丁氨卡那霉素的结构单元,亦为神经递质4-氨基丁酸最强的抑制剂,可由两个酵母菌还原前手性酮合成(图29)。图29酵母细胞催化前手性酮不对称还原制S-AHBA

不对称氧化反应

2001年,抗胆固醇药物普伐他汀(Pravastatin)在全球的销售量为3.6亿美元。目前生产方法是两步酶法：第一步是使用枯青霉菌(Penicilliumcitrinum)发酵生产前体compactin，第二步是利用放线菌S.caebophilus中的细胞色素氧化酶(cytochromeP450)区域和立体选择性氧化compactin的C-3。最近Ykema等利用基因工程技术,使细胞色素氧化酶P450的基因在枯青霉菌(Penicilliumcitrinum)中很好地表达，这样可以使两步法变成一步，可望大大节约成本，但目前发酵水平很低,仍需进一步改进。(+)-4-羟基-1,2-(R)-环氧丁烷是合成降压药(-)-γ-氨基-β-(R)-羟基丁酸(GABOB)的手性合成子，可由诺卡氏菌（Nocardia1P1）细胞催化4-羟基-1-丁烯环氧化制备(图30)。图30诺卡氏菌细胞催化4-羟基-1-丁烯环氧化反应

光学活性的缩水甘油(GLD)可合成手性药物如β-肾上腺素抑制剂、心血管药等。现已发现有几种微生物乙醇氧化还原酶能立体选择性氧化GLD。用绿脓杆菌、恶臭假单胞杆菌、食油假单胞杆菌、诺卡氏菌等细胞可将烯丙基醚不对称氧化为(S)-(+)-芳基缩水甘油醚,e.e.值达100%，并以此手性中间体合成了两个β-阻断剂(S)-氨酰心安和(S)-美多心安(图31)。图31合成(S)-氨酰心安和(S)-美多心安

转移与裂合反应L-多巴是L-酪氨酸的衍生物3,4-二羟基-L-苯丙氨酸，临床上用于治疗帕金森氏病。草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)ATCC21433)的酪氨酸-苯酚裂合酶（tyrosine-phenollyase），又称β-酪氨酸酶(β-tyrosinase,EC4.1.99.2)可将邻苯二酚(儿茶酚)、丙酮酸和氨缩合生成L-多巴。生产中采用静态细胞生物转化法，即将发酵培养得到的草生欧文氏菌细胞悬浮于缓冲液中，催化邻苯二酚和丙酮酸铵生成L-多巴（图32）。图32L-多巴的生物合成

L-麻黄碱18是从中药麻黄中提取的生物碱，临床上可用于治疗哮喘。其活性成分为(1R，2S)-2-甲氨基-1-苯基丙醇。L-苯基乙酰基甲醇(L-Phenylacetylcarbinol,L-PAC)是其合成过程中的一个关键性中间体，可由丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.1)催化丙酮酸与苯甲醛缩合形成，然后再经甲胺还原胺化即可得到L-麻黄碱18(图33)。