WesternBlot实验实用技术手册

WesternBlot试验技术手册WesternBlot是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白依据分子量大小分开，然后转移到固相载体〔杂交膜WesternBlot已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一.一、WesternBlot根本操作流程图

细胞/组织蛋白提取↓蛋白定量、蛋白变性上样、电泳↓一转膜↓封闭↓孵育一抗↓洗膜孵育二抗↓洗膜底物孵育↓曝光或显色二.WesternBlot操作步骤1.蛋白提取、处理蛋白提取的质量直接打算着WB结果的好坏，因此，依据样本类型和检测类型选择适宜的蛋白制备方法是至关重要的。使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品.对于贴壁培育的细胞，PBS2次，裂解液中参与蛋白酶和磷酸酶抑制剂，然后吸净PBSmin〔根椐细胞种类不同调整离心力.对于组织样品，组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，参与液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期-80C，每约5mg参与约300μ预冷的裂解液lysisbuffe，冰浴匀浆后置于4℃摇动2〔最终的蛋白浓度至少到达0.1mg/ml,理1-5mg/ml).，412,000rpm，20min，轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀提取蛋白后进展蛋白的定量，蛋白的快速定量方法主要蛋白本身的发色基团，或者与其他显色剂反响产生的紫外吸取来进展定量.目前常用的主要有直接紫外吸取法，Bradford法、LorryBCA法，一般推举用BCA法.BCA测定方法如下:A．酶标板操作1. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表参与试剂孔号12345678蛋白标准溶液〔μL〕01248121620去离子水〔μL〕2019181612840对应蛋白含量〔μg〕00.51.02.04.06.08.010.0250体积BCA试剂A1体积BCA试剂B〔50:1〕配制适量BCA工作液，充分混匀；3200μLBCA工作液；4、把酶标板放在振荡器上振荡30sec，3730分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量〔μg〕为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；5、稀释待测样品至适宜浓度，使样品稀释液总体积为20μL，参与BCA工作液200μL，充分混匀，37300562nm波长下比色，记录吸光值；6、依据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量〔μg〕，除以样品稀释液总体积〔20μL〕，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度〔单位：μg/ul〕。三、样品处理一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列构造〔表位一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列构造〔表位SDSbuffer〔loadingbuffer〕，95-100°C5分钟，对于屡次70°C加热5-10分钟，标准的上样buffer2XLaemmlibuffer4X6X的上样缓冲液，假设上样buffer2XLaemmlibuffer1：1混合后变性上样即可.SDS的阴离子围绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此SDS-电泳可将不同分子量的蛋白分别开。四、电泳分别蛋白和转膜、封闭、电泳聚丙酰胺凝胶电泳根椐蛋白分子量进展分别蛋白，胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺〔acr〕和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).，聚合需参与过硫酸铵及DMAP或TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状构造。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量〔%T)〕和交联度〔%C〕，T%=(a+b)/m*100%;和C%=a/(a+b)*100%,其中:a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)。丙烯酰胺总量增加，则孔径减小，5%C构成最小的孔径，任何的%C增加或降低，孔径都增加，凝胶的百分浓度组成需两个参数，丙烯酰胺〔acr〕和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).的总量百分浓度〔w/v〕。不同分子量的蛋白〔度胶分别。蛋白分子量(kDa)凝胶浓度(%)4-402012-451510-7012.515-10010、阳性比照目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率。建议使用该比照。可查阅文献或抗体说明书选择购置或自提该比照样本、蛋白分子量Marker蛋白质分子量Marker的使用，是坚持电泳效果和确定待测靶蛋白分子量大小和正确与否的保证，、内参比照管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB试验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准比照。必需设立。内参Beta-actin抗体at1/5000dilution,Lysates/proteinsat20ugperlaneLane1:HeLanuclearLane2:HeLawholecelllysateLane3:A431celllysateLane4:JurkatcelllysateLane5:HEK293celllysate.、上样于电泳每孔上样量为20-40μg蛋白，使用专用枪头或注射针头，勿溢出加样孔，电泳时间按电流仪说明书推举方法使用,(1小时或过夜，取决于电压大小〕，当染料到达胶的底部，关电源停顿电泳，胶不能存放，应马上进展下一步的转膜。、转膜杂交膜是WB进展的介质，选择适宜的、高质量的杂交膜对整个WB的使用是格外的重要和关键的。可依据不同的检测目的和待测蛋白的特性选择适宜的膜，常用的转移膜有:PVDF膜、NC膜，现在使用频率最高的是PVDF膜。膜的使用请参考生产商的推举使用步骤，通常假设使用标准湿式转膜装置，可以设定300-400mA30-6015-20mA转膜过夜，具体的转白的分子量越小，需要的转膜时间越短，在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有格外严峻的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进展转膜。湿式转膜三明治排列为：海绵/纸/胶/膜/纸/海绵，全部严密排列，特别是胶/膜之间不能〔膜电迁移。转膜的效果可以观看所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进展染色，以观看实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-胶进展染色，以观看蛋白的残留状况。、封闭杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点1-5%BSA般选择TBST或者PBST。Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,60分钟。对于一些背景较高的抗体，可4℃封闭过夜。五、一抗孵育1-2小时。假设一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。孵育完毕后，吸尽洗涤液后，再参与洗涤液〔TBST/PBST〕洗涤5-10分钟，共洗涤3次。假设结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。六、二抗孵育(HRP)抗需依据一抗进展选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗，小时。吸尽洗涤液后，再参与洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。假设结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。七、底物孵育和检测显色分为酶促底物发光和化学发光法或荧光法，而现在最常用的是化学发光法：HRP化学发光底物Luminol〔ECL法chemiluminescence〕及其改进法，对于HRP偶联的二抗，一般传统上使用ECLECL+，推举使用后者，更灵敏。八、常见问题及分析问题 可能缘由封闭不充分一抗浓度过高抗体孵育温度过高二抗非特异性结合

验证或解决方法延长封闭时间，更换适宜的封闭剂〔脱脂奶粉，BSA，血清等〕增加一抗稀释倍数,4℃孵育设置二抗比照(不加一抗),降低二抗浓度背景高

或与封闭剂穿插反响一抗或二抗与封闭剂有穿插反响洗膜不充分膜不适宜膜枯燥一抗、二抗等不匹配一抗或/和二抗浓度低

在孵育和洗涤液中参与Tween-20以削减穿插反响.增加洗涤次数NC膜比PVDF膜背景低保证充分的反响液，避开消灭干膜现象订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或/内参可以验证二级检测系统的有效性。增加抗体浓度，延长孵育时间封闭剂与一抗或二抗有穿插反封闭时使用温存的去污剂，如TWEEN20，或更换封闭应 剂〔常用的脱脂奶、BSA、血清或明胶一抗不识别目的物种的靶蛋白检查说明书，或做ClustalW比对，设阳性比照设置阳性比照，假设阳性比照有结果，但标本没有则可没有阳性条带过低〔抗原无效〕或很弱转膜不充分,或洗膜过度过度封闭一抗失效二抗受叠氮钠抑制酶和底物失效

标本上样量至少每孔20-30ug蛋白,样本制备时使用蛋白酶抑制剂,或分级提取目的蛋白。使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,需正确的转膜操作,勿过度洗膜使用含0.5%脱脂奶或无脱脂奶的抗体稀释液,或更换封闭剂,削减封闭时间使用有效期内抗体,分装保存,避开反复冻融取用,工作液现配现用所用溶液和容器中避开含有叠氮钠(HRP的抑制剂)直接将酶和底物进展混合，假设不显色则说明酶失活,使用颖的底物.曝光时间过短 延长曝光时间细胞传代次数过多使其蛋白表达模式的分化体内表达的蛋白样本具有多种

使用原始或传代少的细胞株，或平行试验修饰形式：乙酰化、磷酸化、甲查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小基化、烷基化、糖基化等蛋白样本降解 使用颖制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂多非特异性条带蛋白或同族蛋白的共享同种查其它文献报导，或BLAST搜寻，使用说明书报导的或条带位置不对表位的不同剪接方式一抗浓度过高二抗浓度过高产生非特异性结合抗体未纯化蛋白存在二聚体或多聚体

细胞株或组织降低抗体浓度，可以削减非特异性条带降低抗体浓度，增加二抗比照选择特异性更强，只针对重链的二抗使用单克隆或亲和纯化的抗体，削减非特异条带SDS-10min，以增加蛋白质解聚变性背景有白色/黑色转膜时有气泡或抗体分布不均尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动斑点 抗体与封闭剂结合 过滤封闭剂暗片现白条带一抗或二抗参与过多 稀释抗体的浓度目的条带过低/过 调整胶浓度，分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的SDS-胶浓度选择不适宜高 蛋白用高浓度胶迁移过快“微笑”条带

电泳温