基因工程基本原理及操作方法介绍 改课件

基因工程基本原理及操作方法2016.7.30在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接从生物体的哪些结构中提取？药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。传统生产方法的缺点由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。可利用什么方法来解决上述问题？利用基因工程方法高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。基因工程药物异军突起基因工程药物优点1、概念：基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是把A生物的特定基因提取或人工合成，加以修饰改造后转化到B生物的细胞里，通过B生物表达A生物的蛋白。

例如，将合成的人胰岛素基因转化到毕赤酵母中，通过毕赤酵母表达人胰岛素蛋白。经提纯后用于糖尿病患者。

一、基因工程的概念与流程2、步骤：(1)重组质粒构建；(2)重组质粒鉴定;(3)转化表达菌；(4)筛选高表达菌种；

上游操作的基本流程可简化为：切、接、转、增、检。一、基因工程的概念与流程3、整体流程：

一、基因工程的概念与流程重组质粒构建（酶切与连接）

二、基因工程构建步骤4、高表达菌种的筛选(1)常规表达筛选：一般为摇床法，通过挑取不同单克隆培养后，取样电泳确定表达量，缺点是效率低，优点是比较可靠；(2)高通量筛选法：采用Elisa法，基于免疫反应。优点是效率高，可迅速筛选到高表达菌株，缺点是与实际表达量可能有一点偏差，需将筛选到的高表达菌种进一步进行摇床验证。

二、基因工程构建步骤2.基因的针线──DNA连接酶连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来（磷酸二脂键），使之成为一个完整的DNA分子。三、基因工程常用技术与原理3.基因的针线──基因的运输工具——运载体三、基因工程常用技术与原理4.基因的获取──全基因人工合成或PCR扩增(1)全基因人工合成：委托外公司进行全基因人工合成获得目的基因序列；(2)PCR扩增：PCR扩增3个基本条件包括模板基因序列、引物和原料（DNA聚合酶、4种碱基等原材料）三、基因工程常用技术与原理a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。其中，退火温度比较关键，可能会影响特异性及效率氢键单链DNA双链DNA链5.PCR技术扩增目的基因步骤;6.将目的基因导入微生物细胞大肠杆菌系统：三、基因工程常用技术与原理6.将目的基因导入微生物细胞酵母系统：三、基因工程常用技术与原理(2)PCR法如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增，若能得到预期长度的PCR产物，则该转化细胞可能含有目的基因。(3)DNA限制性内切酶图谱分析用重组时的限制性内切酶切割重组子DNA，凝胶电泳后获得与目的基因一致的片段，即证明重组子中有插入序列。(4)免疫学法利用特定抗体与目的基因表达产物特异性结合作用进行筛选。(5)核苷酸序列测定宿主细胞的基本要求宿主细胞的分类：酵母优点：产物类似与天然产物，容易分离纯化缺点：动物细胞生长缓慢，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较小。上游常用载体、克隆菌及表达菌类型大肠系统常用载体：PET-3C、30a克隆菌：Top10表达菌：BL