实验十模式植物拟南芥TDNA插入突变体的鉴定课件

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定西南大学模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定西南大学目录拟南芥的栽培拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定实验设计思路和原理目录拟南芥的栽培拟南芥T-DNA插入突变体实验设计思路和原理2实验设计的思路和原理经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。一般是随机突变基因，从表型变化入手去研究和确定基因的遗传规律、结构特征、在染色体上的位置，并克隆基因的序列。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行特定的加工和修饰，如定点突变、插入、缺失、置换等，再研究这些修饰对生物体的表型、性状可能有何种影响，从而了解基因和其编码蛋白质在生物体内的功能。实验设计的思路和原理经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传3

拟南芥（Arabidopsisthaliana）又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。该植物具有以下特点：植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；基因组小，只有5对染色体。拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，基因高度纯合。易获通过理化处理

获得各种功能的突变体。模式植物拟南芥拟南芥（Arabidopsisthaliana）又称4生长周期形态结构模式植物拟南芥生长周期形态结构模式植物拟南芥5突变体的获得插入突变（insertionalmutagenesis），即将外源DNA随机插入到拟南芥基因组中而获得其突变体。植物中最常见的插入突变方法是T-DNA插入突变。农杆菌转化法：Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。突变体的获得插入突变（insertionalmutagen6模式植物拟南芥

2000年，拟南芥全部基因组测序已经完成，是人类首次完成了一种高等植物的基因组全序列测定。每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科学家就可以准确定位插入DNA的位置。现在，特异性敲除基因的拟南芥种子库已经创建，向全世界的科研人员开放。研究一个特定基因的研究人员可以迅速、便利地在种子文库中搜索该基因被关闭的拟南芥品系，然后向拟南芥生物资源中心订购。模式植物拟南芥2000年，拟南芥全部基因组测序已7T-DNA方向PCR鉴定T-DNA插入突变体的原理T-DNA的长度在10kb左右，一般PCR反应不能跨T-DNA扩出条带。WT：两个等位基因上都能被LP+RP扩出，而BP+RP不能扩出条带。HM(纯合子)：两个等位基因上都有T-DNA插入，能被BP+RP扩出，而不能LP+RP扩出条带。HZ(杂合子)：两个等位基因中的一个有T-DNA插入，能被BP+RP和LP+RP扩出条带。T-DNA方向PCR鉴定T-DNA插入突变体的原理T-DNA8实验目的1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法；2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突变体的方法。实验目的1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法；9野生型（Col）、ibm1突变体（SALK_023533）拟南芥植株IBM1(AT3G07610)是拟南芥中组蛋白修饰酶的编码基因，能影响植物的诸多的发育和生殖过程。实验材料ibm1突变体：开花延迟叶片卷曲果荚短小花粉粒败育野生型（Col）、ibm1突变体（SALK_023533）拟10ibm1是一个隐性突变：只有纯和的突变体植株才有与野生型的性状差异；杂合的植株表型与野生型一致。如何确定F2代中基因型的分离比是1：2：1？传统遗传方法：F2代做测交或者自交；现代分子遗传方法：PCR鉴定。ibm1是一个隐性突变：只有纯和的突变体植株才有与野生型的性11试剂：1.CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇=24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE2.PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP）、DNA模版、TaqDNA聚合酶3.电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫外成像仪实验器具和试剂试剂：实验器具和试剂12实验步骤-拟南芥的栽培一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使种子在湿润条件下春化2至3天。二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的培养皿中，置于培养室内培养。三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置于培养室内培养。实验步骤-拟南芥的栽培一.在播种前将种子进行消毒，然后置于413实验十模式植物拟南芥TDNA插入突变体的鉴定课件14实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法一.提取植物DNA；二.PCR反应；三.琼脂糖凝胶电泳；实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法一.提取植物15一.提取植物DNA的步骤(略)一.提取植物DNA的步骤(略)16二.PCR鉴定试剂单管I（μl）混合I单管II（μl）混合IIddH2O161601616010×Tapbuffer(Mg2+free)2.5252.525模板DNA（30-50ng/ul）2-2-引物LP（10um）110NO引物RP（10um）110110引物BP（10um）NO110dNTP(各2.5mM)220220Tap酶（5U/ul）0.550.55反应体系总体积25251.制作反应体系（先混合在分装最后单独加模板）二.PCR鉴定试剂单管I（μl）混合I单管II（μl）混合I172.反应程序过程温度/℃时间预变性945min变性9430s

退火5630s延伸7280s延伸后处理7210min35循环注意：1.每管分装多少ul2.标记清楚3.反应前混合、离心4.盖温，防蒸发2.反应程序过程温度/℃时间预变性945min变性94318从F1代杂合植株自交产生的后代分离群体，提取了群体中每个单株的基因组DNA，现在需通过PCR方法鉴定每一单株的基因型。LP:JDM17-1NR2RP:JDM17-1F2BP:LBb1.3理论的条带长度：LP+RP:~1200bpRP+BP:~900bpPCR安排：每小组按10倍准备混合体系；每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。从F1代杂合植株自交产生的后代分离群体，提取了群体中每个单株19三.琼脂糖凝胶电泳1.用TAE电泳缓冲液配置1％琼脂糖凝胶；溶胶后加入Goldview染料；2.25uLPCR产物，加5uL上样缓冲液(6x)混匀；点样8-10ul于1%琼脂糖胶上电泳,稳压150Ｖ（5Ｖ/cm）；3.电泳结束，在紫外成像仪下观察、拍照，然后分析条带。4.确定每一株拟南芥的基因型，统计全班的结果计算群体中的分离比例。三.琼脂糖凝胶电泳1.用TAE电泳缓冲液配置1％琼脂糖凝胶；20实验报告1.电泳图+分析，确定每个单株的基因型；2.全班基因型统计，计算比例，卡方检验。基因型野生型纯合子杂合子株数比例基因型植株编号+/++/ibm1ibm1/ibm1实验报告1.电泳图+分析，确定每个单株的基因型；基因型野生型21ThankYou!ThankYou!模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定西南大学模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定西南大学目录拟南芥的栽培拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定实验设计思路和原理目录拟南芥的栽培拟南芥T-DNA插入突变体实验设计思路和原理24实验设计的思路和原理经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。一般是随机突变基因，从表型变化入手去研究和确定基因的遗传规律、结构特征、在染色体上的位置，并克隆基因的序列。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行特定的加工和修饰，如定点突变、插入、缺失、置换等，再研究这些修饰对生物体的表型、性状可能有何种影响，从而了解基因和其编码蛋白质在生物体内的功能。实验设计的思路和原理经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传25

拟南芥（Arabidopsisthaliana）又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。该植物具有以下特点：植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；基因组小，只有5对染色体。拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，基因高度纯合。易获通过理化处理

获得各种功能的突变体。模式植物拟南芥拟南芥（Arabidopsisthaliana）又称26生长周期形态结构模式植物拟南芥生长周期形态结构模式植物拟南芥27突变体的获得插入突变（insertionalmutagenesis），即将外源DNA随机插入到拟南芥基因组中而获得其突变体。植物中最常见的插入突变方法是T-DNA插入突变。农杆菌转化法：Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。突变体的获得插入突变（insertionalmutagen28模式植物拟南芥

2000年，拟南芥全部基因组测序已经完成，是人类首次完成了一种高等植物的基因组全序列测定。每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科学家就可以准确定位插入DNA的位置。现在，特异性敲除基因的拟南芥种子库已经创建，向全世界的科研人员开放。研究一个特定基因的研究人员可以迅速、便利地在种子文库中搜索该基因被关闭的拟南芥品系，然后向拟南芥生物资源中心订购。模式植物拟南芥2000年，拟南芥全部基因组测序已29T-DNA方向PCR鉴定T-DNA插入突变体的原理T-DNA的长度在10kb左右，一般PCR反应不能跨T-DNA扩出条带。WT：两个等位基因上都能被LP+RP扩出，而BP+RP不能扩出条带。HM(纯合子)：两个等位基因上都有T-DNA插入，能被BP+RP扩出，而不能LP+RP扩出条带。HZ(杂合子)：两个等位基因中的一个有T-DNA插入，能被BP+RP和LP+RP扩出条带。T-DNA方向PCR鉴定T-DNA插入突变体的原理T-DNA30实验目的1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法；2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突变体的方法。实验目的1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法；31野生型（Col）、ibm1突变体（SALK_023533）拟南芥植株IBM1(AT3G07610)是拟南芥中组蛋白修饰酶的编码基因，能影响植物的诸多的发育和生殖过程。实验材料ibm1突变体：开花延迟叶片卷曲果荚短小花粉粒败育野生型（Col）、ibm1突变体（SALK_023533）拟32ibm1是一个隐性突变：只有纯和的突变体植株才有与野生型的性状差异；杂合的植株表型与野生型一致。如何确定F2代中基因型的分离比是1：2：1？传统遗传方法：F2代做测交或者自交；现代分子遗传方法：PCR鉴定。ibm1是一个隐性突变：只有纯和的突变体植株才有与野生型的性33试剂：1.CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇=24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE2.PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP）、DNA模版、TaqDNA聚合酶3.电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫外成像仪实验器具和试剂试剂：实验器具和试剂34实验步骤-拟南芥的栽培一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使种子在湿润条件下春化2至3天。二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的培养皿中，置于培养室内培养。三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置于培养室内培养。实验步骤-拟南芥的栽培一.在播种前将种子进行消毒，然后置于435实验十模式植物拟南芥TDNA插入突变体的鉴定课件36实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法一.提取植物DNA；二.PCR反应；三.琼脂糖凝胶电泳；实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法一.提取植物37一.提取植物DNA的步骤(略)一.提取植物DNA的步骤(略)38二.PCR鉴定试剂单管I（μl）混合I单管II（μl）混合IIddH2O161601616010×Tapbuffer(Mg2+free)2.5252.525模板DNA（30-50ng/ul）2-2-引物LP（10um）110NO引物RP（10um）110110引物BP（10um）NO110dNTP(各2.5mM)220220Tap酶（5U/ul）0.550.55反应体系总体积25251.制作反应体系（先混合在分装最后单独加模板）二.PCR鉴定试剂单管I（μl）混合I单管II（μl）混合I392.反应程序过程温度/℃时间预变性945min变性9430s

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