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文档简介

质粒DNA的提取与酶切电泳鉴定质粒提取关键：基因组DNA与质粒DNA的有效分离（碱裂解法）

高pH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白质。再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性成双链。而染色体DNA较大，不会复性，缠结成网状不溶物质，从而可以通过离心除去。注意事项:实验方法

碱裂解法

1、挑取携带目标DH5α单菌落于3-5mlLB（含Amp100μg/ml）,37℃振荡培养过夜（12-16h）；2、取2ml培养液倒入1.5mlEP管中（分次加入，离心），4℃12000rpm离心30s-1min，弃去上清；3、用涡旋混匀器使菌体沉淀重悬浮于250μl冰预冷的溶液Ⅰ。4、加入新配制的溶液Ⅱ250μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管5次，菌液变得透亮，以混匀内容物（千万不要振荡）。5、加入350μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒离心管5次，出现白色沉淀，使沉淀混匀，4℃

12000rpm离心10分钟。

6、上清液移入干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃下12000rpm离心2分钟。7、将上层水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后室温放置2分钟，然后4℃下12000rpm离心5分钟。8、彻底弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000rpm离心2分钟。9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温开盖放置10-15min，使乙醇挥发殆尽。10、将沉淀溶于30-50μlTE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。11、酶切鉴定并将没有酶切的质粒与酶切的质粒进行琼脂糖凝胶电泳。（酶切体系一般1-2ul提取

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