生物pw微生物营养和培养基

第四章

微生物的营养和培养基第一节

微生物的六种营养要素第二节微生物的营养类型第三节营养物质的跨膜运输第四节培养基第一节

微生物的六种营养要素营养（或营养作用，nutrition）：是指生物体从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，以满足其生长和繁殖需要的一种生理功能。营养物（或营养，nutrient）：则指具有营养功能的物质。在微生物学中，常也包括光能这种非物质形式的能源。微生物细胞的化学组成：碳、氢、氧、氮、硫、磷、钙、镁、钾、氯及多种微量元素。营养物质：不论从元素水平还是从营养要素水平看，微生物的营养与摄食型的动物（包括人类）和光和自养型的植物非常相似，他们之间存在着“营养上的统一性”。也有六种营养要素。见表4-1。生物类型营养要素动物（异养）微生物绿色植物（自养）异养自养碳源糖类、脂肪糖、醇、有机酸等二氧化碳、碳酸盐等二氧化碳、碳酸盐等氮源蛋白质或其降解物蛋白质或其降解物、有机氮化合物、无机氮化合物、氮无机氮化合物、氮无机氮化合物能源与碳源相同与碳源相同氧化无机物或利用日光能利用日光能生长因子维生素部分需要维生素不需要不需要无机元素无机盐无机盐无机盐无机盐水分水水水水表4-1：微生物和动物、植物营养要素的比较一、碳源(carbonsource)碳源是一切能提供微生物营养所需的碳元素的营养源，兼作能源。碳源是需要量最大的营养物（大量营养物）。表4-2微生物的碳源谱类型元素水平化合物水平培养基原料水平有机碳C•H•O•N•X复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、蛋白胨、花生饼粉等C•H•O•N多数氨基酸，简单蛋白质一般氨基酸、明胶等C•H•O糖、有机酸、醇、脂等葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、糖蜜等C•H烃类天然气、石油及其不同馏分、石蜡油等无机碳C（？）————C•OCO2CO2C•O•XNaHCO3、CaCO3等NaHCO3、CaCO3、白垩等碳源主要功能：一是提供细胞物质中的碳素来源；二是提供微生物生长发育过程中所需的能量。“双功能营养物”。对碳源的分析：（1）把微生物作为一个整体来看，微生物的碳源谱很广，但对某一个具体的菌株来说，其碳源谱有其特殊性。（2）微生物所能利用的碳源有有机碳源和无机碳源，凡必须利用有机碳源的微生物，为异养微生物；凡能利用无机碳源的微生物是自养微生物。（3）多数微生物以有机化合物作为碳源和能源，对异养微生物来说最适碳源是CHO型，糖类是最好的碳源，尤其是葡萄糖；其次是醇类；有机酸、脂类等。（4）针对某一种具体微生物来看，其具体碳源利用范围很悬殊。（5）在发酵工业中，常用的碳素原料主要有：山芋粉、玉米粉、麸皮、废糖蜜、野生植物淀粉等。二、氮源(nitrogensource)：凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源，称为氮源。注意C/N对微生物生长的影响。微生物的氮源谱见表4-3。类型元素水平化合物水平培养基原料水平有机氮N•C•H•O•X复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、酵母膏、饼粕粉、蚕蛹粉等N•C•H•O尿素、一般氨基酸，简单蛋白质等尿素、蛋白胨、明胶等无机氮N•HNH3、铵盐等（NH4）2SO4等N•O硝酸盐等KNO3等NN2

空气表4-3：微生物的氮源谱

氮源的主要功能：是提供合成原生质和细胞其他结构的氮素来源，一般不提供能量，但硝化细菌是利用铵盐或硝酸盐作为氮源和能源的。

对氮源的分析：

（1）从微生物所能利用的氮源种类来看：氨基酸自养型生物:所有绿色植物和很多的微生物氨基酸异养型生物:所有的动物和大量的异养微生物（2）氮源种类：无机氮：铵态氮、硝态氮、氮气等；有机氮源：尿素、氨基酸、蛋白质等。（3）实验室和发酵工业生产中，常用的氮源有铵盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、豆饼粉、花生饼粉等。三、能源（energysource)：能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。能源谱:1、化学物质(化能营养型)有机物：化能异养微生物的能源（同碳源）无机物：化能自养微生物的能源（不同于碳源）2、辐射能(光能营养型)：光能自养和光能异养微生物的能源能源的分析：（1）化能自养型的微生物，其利用的能源物质是一些还原态的无机物质，如NH4+、NO2-、S、H2S、H2、Fe2+

等。（2）单功能营养物：能源如光辐射能双功能营养物：还原态的无机物N三功能营养物：氨基酸四、生长因子（growthfactor)：生长因子：是一类对微生物正常代谢必不可少，且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物。广义的生长因子除维生素外，还包括碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、C4~C8的分支或直链脂肪酸，以及需要量较大的氨基酸；而狭义的生长因子就是指维生素。见表4－4

维生素转移的对象代谢功能硫胺素（B1）乙醛基焦磷酸硫胺素是脱羧酶、转醛酶、转酮酶的辅基，与α-酮酸的氧化脱羧和酮基转移有关核黄素（B2）氢、电子黄素核苷酸FMN和FAD的前体，他们构成黄素蛋白的辅基，转移氢烟酸（B5）氢、电子NAD和NADP的前体，是脱氢酶的辅酶，参与递氢过程及氧化还原反应吡哆醇（B6）氨基磷酸吡哆醛是氨基酸消旋酶、转氨酶与脱羧酶的辅基，参与氨基酸的消旋、脱羧和转氨泛酸酰基辅酶A的前体，乙酰载体的辅基，转移酰基，参与糖和脂肪酸的合成叶酸甲基即辅酶F（四氢叶酸），参与一碳基的转移，与合成嘌呤、嘧啶、核苷酸、丝氨酸和甲硫氨酸有关生物素（H）羧基各种羧化酶的辅基，在CO2固定、氨基酸和脂肪酸合成及糖代谢中起作用维生素B12羧基，甲基钴酰胺辅酶，参与一碳基传递，与甲硫氨酸和胸苷酸的合成和异构化有关表4-4：维生素的生理功能生长因子的功能：生长因子在微生物代谢中有着极其重要的作用，如构成细胞成分；调节代谢，维持生命的正常活动。生长因子分析：（1）各种微生物与生长因子的关系可分以下几类：

生长因子自养型微生物生长因子异养型微生物生长因子过量合成微生物（2）在配制微生物培养基时，如果配制的是天然培养基，则可加入富含生长因子的原料—酵母膏、玉米浆、肝浸液、麦芽汁或其他新鲜的动植物组织浸液；如果配制的是合成培养基，可加入复合维生素液。五、无机盐(inorganicsalt)：无机盐主要可为微生物提供碳、氮源以外的各种重要元素。大量元素:凡是生长所需浓度在10-3~10-4mol/L范围内的元素，如K、Ca、Na、Mg、S、P、Fe等；微量元素:凡所需浓度在10-6~10-8mol/L范围内的元素，称为，如Mn、Cu、Zn、Co、Mo等。Fe实际上介于大量元素和微量元素之间。不同的微生物对不同的元素要求不同。无机盐的营养功能：无机盐的分析：（1）在配制细菌培养基时，对于大量元素来说，可以加入有关化学试剂，其中首选的是K2HPO4及MgSO4，因为它们可以同时提供4种需要量最大的元素。（2）对其他需要量少些的元素，除非研究代谢等有特殊要求，一般不需外源添加。六、水(water)：水分是微生物细胞中的主要组成成分，一般约为70~90%。其主要作用：细胞物质的组成成分；生物化学反应的介质；细胞内各种物质的基本溶剂；调节细胞内的温度，保持生活环境温度的恒定。除了少数微生物如蓝细菌以水为代谢中间物外，其他微生物都不是利用水作为营养物质。几种生物的游离水含量：人体：～60%海蜇：～96%微生物：75～85%第二节微生物的营养类型分类标准营养类型1.以能源分光能营养型（phototroph）化能营养型（chemotroph）2.以供氢体分无机营养型（lithotroph）有机营养型（organotroph）3.以碳源分自养型（autotroph）异养型（heterotroph）4.以合成氨基酸能力分氨基酸营养型（aminoacidautotroph）氨基酸自养型（aminoacidheterotroph）5.以生长因子分原养型（protoroph）或野生型（wildtype）营养缺陷型（auxotroph）6.以取食方式分渗透营养型（osmotroph）吞噬营养型（phagocytosis）7.以取得死或活有机物分腐生型（saprophytism）寄生型（parasitism）表4-5：微生物营养类型的分类营养类型能源供氢体基本碳源实例光能无机营养型（光能自养型）光无机物CO2蓝细菌、紫硫细菌、绿硫细菌、藻类光能有机营养型（光能异养型）光有机物CO2及简单有机物红螺菌科的细菌（即紫色无硫细菌）化能无机营养型（化能自养型）无机物*无机物CO2硝化细菌、硫化细菌、铁细菌、氢细菌、硫黄细菌等化能有机营养型（化能异养型）有机物有机物有机物绝大多数细菌和全部真核微生物表4-6：微生物的营养类型1、光能自养型（光能无机营养型）

光能自养微生物所需要的能源是光能，以CO2为主要碳源，以无机物作为供氢体，将CO2化合成细胞自己的有机物质。这类微生物都含有光合色素，所以能利用光能进行光合作用。主要类群是蓝细菌、绿硫细菌和紫硫细菌。光合色素主要有二类：叶绿素和菌绿素。以绿硫细菌为例：

CO2+2H2S[CH2O]+2S+H2O2、光能异养型（光能有机营养型）

光能异养微生物利用光作能源，以一种有机化合物为主要碳源，作为供氢体，将CO2还原成碳水化合物。例如红螺菌利用异丙醇作为供氢体，进行光合作用。

CH3CHOH+CO22CH3COCH3+H20CH33、化能自养型（化能无机营养型）

化能自养微生物利用氧化无机物所产生的能量作为能源，CO2作为碳源，合成自身需要的有机含碳化合物。这类微生物仅限一些细菌，共有五类：氢细菌、硫细菌、铁细菌、氨细菌和亚硝酸细菌。这些细菌在产能过程中，都需要大量氧气参加，所以所有的化能自养细菌均为好氧菌。以亚硝酸细菌为例，它将氨氧化为亚硝酸，获得能量，供CO2合成有机含碳化合物时用，二步反应是在细菌细胞内紧密联系进行的。

NH3+O22HNO2+4H++能

CO2+4H+[CH2O]+H2O4、化能异养型（化能有机营养型）化能异养微生物利用氧化有机物时获得的能量作为能源，碳源也是有机化合物。这样对化能异养菌来讲，一种有机化合物的代谢作用既可提供能源又可以供应碳源。绝大多数细菌和全部真核微生物。第三节营养物质的跨膜运输

一般认为，细胞膜以四种方式控制物质的运送，即单纯扩散、促进扩散、主动运送和基团移位，以主动运送最为重要。一、单纯扩散(simplediffusion):又称被动扩散(passivediffusion)或被动运输／送(passivetransport)：细胞膜（包括孔蛋白在内）在无载体蛋白参与下，单纯依靠物理扩散方式让许多小分子、非电离分子尤其是亲水性分子被动通过的一种物质运送方式。特点：物质由高浓度区向低浓度区扩散；不需要能量；扩散是非特异性的，无运载蛋白参与；扩散速度慢。运送的物质：气体（O2和CO2）、水、某些水溶性物质（乙醇等）和脂溶性物质、大肠杆菌吸收钠离子。2、促进扩散（facilitateddiffusion)促进扩散指溶质在运送过程中，必须借助存在于细胞膜上的底物特异载体蛋白的协助，但不消耗能量的一类扩散性运送方式。特点：物质由高浓度区向低浓度区扩散；不需要能量；扩散特异性载体蛋白（渗透酶、易位酶、易位蛋白）参与；扩散速度较快。运送的物质：无机离子和糖类等。

3、主动运输（activetransport)主动运输是指一类必须提供能量并通过细胞膜上特异性载体蛋白构想的变化，使膜外环境中底浓度的溶质运入膜内的一种运送方式。

特点：逆浓度梯度运输；需要提供能量；需要特异性载体蛋白参与；运送速度较快运送的物质：无机离子、有机离子和一些糖类等。四、基团转位(grouptranslocation)基团转位

指一类既特异性载体蛋白的参与，又需耗能的一种物质运送方式，其特点是溶质在运送前后会发生分子结构的变化，而不同于一般的主动运送。

磷酸转移酶系统。该磷酸转移酶系统包括酶I、酶II和Hpr。

第一步：PEP+HPr---------P~HPr+丙酮酸第二步：P-Hpr+糖-----------糖-P+Hpr热稳载体蛋白丙酮酸特点：逆浓度梯度运输；需要能量；需要特异性载体蛋白；被转运的物质改变了化学结构。运送的物质：某些细菌运送的葡萄糖四种运送营养物质方式的比较比较项目单纯扩散促进扩散主动运送基团转位特异载体蛋白无有有有运送速度慢快快快溶质运送方向由浓到稀由浓到稀由稀到浓由稀到浓平衡时内外浓度内外相等内外相等内部浓度高得多内部浓度高得多运送分子无特异性特异性特异性特异性能量消耗不需要不需要需要需要运送前后溶质分子不变不变不变改变载体饱和效应无有有有与溶质类似物无竞争性有竞争性有竞争性有竞争性运送抑制剂无有有有运送对象举例H2O、CO2、O2、甘油、少数氨基SO42-、PO43-；糖氨基酸、乳糖等糖类，Na+、Ca2+等无机离子葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等。影响营养吸收的因素：1、细胞内外营养物质的浓度差浓度差越大，越有利于细胞的吸收。2、营养物的特性（1）大分子化合物不易透过，需经胞外酶水解成可溶性的小分子后，才被吸收。（2）脂溶性化合物较水溶性物质更易透过细胞膜。（3）不易电离的化合物较易电离的化合物更易进入细胞。3、细胞膜的通透性当营养物的电荷与膜上的孔的电荷相反时，透性增加；当菌种是幼龄时，膜透性较大；当细胞受损或死亡时，膜的选择性受到破坏，菌体内含物容易从体内渗出。其他物化条件，如温度、pH、有毒物质等都会影响细胞膜的通透性。第四节培养基

培养基(medium/culturemedium)一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。具备六种营养要素、进行灭菌。一、配制原则（4条)1、目的明确：

实验室：不计较成本，重复性要强；大生产：考虑成本（1）种子培养基：利于菌种的快速繁殖（2）发酵培养基：利于产物的生成2、营养协调：微生物细胞内各种成分间有较稳定的比例关系。因此大多数化能异养微生物的培养基，除水分外，碳源（兼能源）的含量最高，其后依次是氮源、大量元素和生长因子。C/N比指在微生物培养基中所含的碳源中碳原子与氮源中氮原子的摩尔数比。一般来讲，真菌需C/N比较高的培养基（似动物的“素食”），细菌尤其是动物病原菌需C/N较低的培养基（似动物的“浑食”）。据记载：一般培养基的C/N比为100/0.5~2；谷氨酸发酵培养基为100/11~21；放线菌蛋白质培养基为100/10~20。3、条件适宜（理化适宜）：（1）pH：各大类微生物一般都有它们合适的生长pH值。如细菌7.0～8.0，放线菌7.5～8.5，酵母菌3.8～6.0，霉菌4.0～5.8，藻类6.0～7.0，原生动物6.0～8.0。A)内源调节培养基的pH值调剂能力，通过培养基内成分发挥的调节作用。磷酸缓冲液：K2HPO4和KH2PO4浓度比，pH6.0～7.6。备用碱：CaCO3或NaHCO3B)外源调节:加入酸液或碱液（2）渗透压和水活度：渗透压：等渗环境适宜微生物生长；水活度：水可利用性的衡量指标；不同微生物要求的水活度不同。（3）氧化还原势：发酵—0.1V—呼吸各种微生物对氧的需求不同。氧化还原电位Eh可作为供氧水平的指标。好氧微生物生长的Eh为+0.3～+0.4V，它们在Eh＞0.1V的环境中均能生长；兼性厌氧微生物在Eh＞0.1V时进行好氧呼吸，在Eh＜0.1V时进行发酵；厌氧微生物在Eh＜0.1V时才能生长。培养厌氧微生物时，除了在配制培养基、灭菌、按种和培养一系列操作中采用严格的厌氧技术除去氧气外，还要在培养基中加入还原剂，降低其氧化还原电位。不论是好氧还是厌氧微生物，随着它们的生长和代谢活动的进行，培养基的原有Eh会逐步降低。这是由于溶解氧的消耗及H2S、H2等还原性代谢产物形成累积所致。4、经济节约（1）以粗代精（2）以“野”代“家”（3）以废代好（4）以简代繁（5）以烃代粮（6）以纤代糖（7）以氮代朊（8）以“国”代“进”二、设计步骤（方法）

1、生态模拟２、参考文献３、精心设计４、试验比较

三、培养基种类

（一）按对培养基成分的了解来分

天然培养基、组合培养基和半组合培养基１．天然培养基(complexmedium;undefinedmedium)：天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。如培养细菌用的牛肉膏蛋白胨培养基、培养酵母菌的麦芽汁培养基等。用作这种培养基的主要原料：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。优点：取材广泛，营养全面和丰富，制备方便，价格低廉，适宜于大规模培养微生物。缺点：成分复杂，成分不稳定。配制天然培养基用的几种原料性质与成分原材料产品特点营养成分牛肉膏

(beefextract)瘦牛肉加热抽提并浓缩而成的膏状物富含水溶性动物组织的营养物，如糖类、有机含氮物、水溶性维生素和无机盐等蛋白胨

(peptone)由酪素或明胶等蛋白质经酸或酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等)水解而成。因蛋白质来源和水解方式不同，可以获得不同特性的产品是营养丰富的有机氮源，其中还含有若干维生素和糖类。如胰酶水解的酪蛋白约含总氮12.9%，氨基氮6.6%酵母膏

(yeastextract)由酵母细胞水提取物浓缩而成的膏状物，还可制成粉末型商品富含B族维生素，也含丰富的有机氮和碳化物２．组合培养基(chemicaldefinedmedium)：组合培养基又称合成培养基或综合培养基，是按照微生物的营养要求精确设计后，用多种化学试剂配制而成的培养基。如实验室常用的培养E.coli等细菌用的葡萄糖铵盐培养基；放线菌（链酶菌）用的淀粉硝酸盐培养基（常称为高氏一号培养基）；培养真菌用的蔗糖硝酸盐培养基（即察氏一号培养基）等。优点：成分精确、重演性好。缺点：价格较贵、配制较烦。一般用于实验室进行营养代谢、分类鉴定和选育菌种、菌种鉴定和生物测定等定量要求较高的研究工作上。３．半组合培养基(semi-definedmedium)：半组合培养基用一部分天然物质作为碳氮源及生长辅助物质，又适当补充少量无机盐类配制的培养基。例如：培养真菌的马铃薯蔗糖培养基等。半合成培养基应用最广，能使绝大多数微生物良好地生长。（二）按培养基外观的物理状态来分

1、固体培养基(solidmedium)：根据固体的性质可把其分为四类：①固化培养基：常称为固体培养基，加1~2%琼脂或5~12%明胶作凝固剂②非可逆性凝固培养基：血清或无机硅胶③天然固体培养基：由天然固体状基质直接制成④滤膜：一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维薄膜。

固体培养基的用途很广泛，如用于菌种的分离、鉴定、菌落计数、检验杂菌、选种、育种、菌种保藏、抗生素等生物活性物质的生物测定等，还可以用于固体发酵。

成分营养价值分解性融化温度凝固温度耐高压灭菌力琼脂

明胶聚半乳糖

硫酸酯

蛋白质无

氮源罕见

极易96℃

25℃40℃

20℃强

弱琼脂与明胶性质比较A在标准营养培养基上对总菌数进行计数。（染色）B在粪便大肠菌培养基上检测粪便中的大肠菌类C在远藤氏培养基上检测大肠杆菌D在麦芽汁培养基上生长的酵母和霉菌2、半固体培养基(semi-solidmedium)：

加入少量的凝固剂到液体培养基中就配制成半固体培养基，琼脂用量一般在0.5%左右。常用来观察细菌的运动性，鉴定噬菌体的效价和厌氧菌的培养及菌种保存等。3、液体培养基(liquidmedium)：

所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物。液体培养基营养成分分布均匀，适用于做细致的生理代谢等各项基本理论的研究，更适用于现代化的大规模发酵生产。4、脱水培养基（dehydratedculturemedia）

指含有除水以外的一切营养成分的商品培养基，使用时只要加入适量的水分并加以灭菌即可。（三）按培养基的功能来分选择性培养基、鉴别性培养基1、选择性培养基(selectedmedium)根据某种微生物的特殊营养要求或对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，其功能是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。一般利用“投其所好”和“取其所抗”的原理，如加富性培养基和抑制性选择培养基。选择对象抑制剂及其用量(μg/ml)抑制对象

细菌四环素(