鸭坦布苏病毒病防治关键技术研究及应用分析研究 医学专业

第四章实验结果

1病原分离鉴定实验

1.1PCR结果

参照已有的鸭坦布苏病毒检测方法对收集的鸡胚尿囊液进行PCR检测，PCR扩增产物送生物技术公司测序。结果显示，FC1-FC4及YF2样品接种的鸡胚尿囊液中均未检测到禽坦布苏病毒核酸，YF1，YF3和YF4样品接种的鸡胚尿囊液中检测到DTMUV的存在。PCR扩增片段经测序表明与FJMH220株、YY5株及BYD-1株的同源性在99.1%。因YF1，YF3和YF4样品都来源于同一鸭场的同一批鸭，由此将3份样品分离获得的病毒视为同一株病毒，命名为YF株。获得的病毒经蚀斑纯化后，-80℃保存备用。通过RT-PCR扩增出病毒YF株基因组的8个基因片段，琼脂凝胶电泳检测，片段大小与预测基本相符，结果见图1。扩增片段经1%琼脂凝胶纯化回收后，克隆到pEASY-B载体中，随后每个片段挑选3个阳性克隆送生物技术公司测序。

图1病毒YF株基因组的扩增

M、DNA分子量标尺；1-8、YF毒株基因组各扩增片段

1.2序列比对结果

序列分析表明，该株病毒全基因组全长10990nt，未出现核苷酸插入或缺失及基因重组的变异情况，与已报道的DTMUV分离株的核苷酸同源性均在98.5%以上，且亲缘关系与当前鸭群中优势病毒亚群非常近。

表3坦布苏病毒信息及序列同源性比对结果

毒株

GenBankID

宿主

YF株(%)

毒株

GenBankID

宿主

YF株(%)

核苷酸

氨基酸

核苷酸

氨基酸

XHZD/2010

JQ595407

鸭

99.2

99.0

JXSP

JQ920423

鸭

99.5

99.7

Shandong1

JX965381

鸭

99.3

99.4

Du/CH/LSD/110128

KC136210

鸭

98.5

99.0

FJMH220

JQ928189

鸭

99.3

98.6

ZJ-6

JF459991

鸭

99.4

99.5

ZJ-407

JQ314464

鸭

99.3

99.0

byd1

JQ920420

鸭

99.4

99.2

YY5

JF270480

鸭

99.2

99.1

TA

JQ289550

鸭

99.3

99.4

JS

JQ920422

鸭

99.4

99.2

WR

JX196334

鸭

99.4

99.6

JS804

JF895923

鹅

99.3

98.7

JX2

JQ920426

鸭

98.5

99.2

goose

JQ920424

鹅

99.4

99.6

duan

JQ920421

鸭

99.2

99.1

ZJGH-2

JQ314465

鹅

99.1

99.0

JS/2010

JX273153

鸭

99.4

99.1

GS-PT-7

JQ627864

鹅

99.4

99.8

WJ-1

JX549382

鸭

98.5

99.0

Sitiawan

JX477686

肉鸡

87.2

96.2

MM1775

JX477685

蚊虫

88.6

96.4

图2坦布苏病毒基因组分子进化分析

GroupA为2010年后分离的坦布苏病毒；GroupB为2010年前分离的坦布苏病毒；黑三角(▲)标注的毒株为本实验分离的毒株；图中树结处的阿拉伯数字为自举检验置信值(1,000次重复)。

A

B

图3基于病毒E蛋白（A）和NS5基因（B）的分子进化分析

黑三角(▲)标注的毒株为本实验分离的毒株，图中树结处的阿拉伯数字为自举检验置信值(1,000次重复)

以上果表明，在宜丰发病场采集的病料中分离到了鸭坦布苏病毒。鸭群中流行的鸭坦布苏病毒存在2个病毒群，但主要以II群的病毒为主，其中II-C亚群的毒株为流行的优势病毒群。本研究分离获得的江西分离株（YF株）基因组与已报道的高度同源，遗传稳定，没有出现核苷酸的缺失或插入，未发生基因重组现象。基于YF株全基因组的系统进化分析表明，YF株与鸭群中流行的II-C谱系病毒群亲缘关系最近，这与基于YF株病毒E蛋白及NS5蛋白编码基因的遗传进化分析结果一致，江西鸭群中流行的鸭坦布苏病毒遗传比较稳定，未发生变异。

2病毒复制试验

2.1临床结果

A组蛋鸭前期出现绿色稀便，死前均表现精神沉郁、四肢无力、头颈歪斜、蜷缩于角落，出现产蛋极速下降情况。解剖死鸭发现，最明显的临床病理变化是卵黄溶解、卵巢萎缩钙化淤血，大部分有心冠淤血现象。B组、C组蛋鸭表现正常。

2.2PCR检测结果

A组病料通过RT-PCR扩增出病毒YF株的基因片段，琼脂凝胶电泳检测，片段大小与预测基本相符，结果显示，实验室经过病原分离鉴定，重新得到了鸭坦布苏病毒YF毒株。B组、C组蛋鸭未见YF基因扩增片段。

通过以上实验能成功复制鸭坦布苏病毒病，表明鸭坦布苏病毒病不仅具有致病性，且是独立的病毒种类，具有可复制性，且在感染机体内能够稳定存在。

3病毒传播途径探究试验

3.1临床结果

通过试验发现通过接触传播、空气传播方式均能使鸭群感染鸭坦布苏病毒病，蛋鸭出现精神沉郁、采食下降、产蛋率急剧下降等临床状况。

表4病毒传播途径产蛋率变化情况

组别

0天

（%）

1天

（%）

2天

（%）

3天

（%）

4天

（%）

5天

（%）

6天

（%）

7天

（%）

8天

（%）

9天

（%）

10天

（%）

空气

传播

>90

70.97

74.19

45.16

61.29

35.48

12.90

6.45

0.00

3.23

3.57

混群

接触

>90

83.33

72.22

27.78

5.56

16.67

11.11

11.76

5.88

6.25

0.00

空白

对照

>90

38.89

72.22

94.44

100.0

72.22

77.78

77.78

77.78

72.22

88.89

3.2病理剖检结果

病理剖检结果：解剖死鸭发现，直接接触传播和空气传播感染蛋均出现鸭卵黄溶解、卵巢萎缩钙化淤血、部分死鸭出现心冠淤血等情况，空白对照组剖检正常，结果见图6。

图6病毒传播途径试验蛋鸭病理组织学检查情况

空气传播组混群接触传播组空白对照组

结果表明鸭坦布苏病毒病不仅具有致病性，且能够通过混群接触感染、空气传播等方式进行传播，在日常生产过程中对患病鸭群应尽早实行较好的隔离措施等方式，才能阻止疫病的传播。

序号

试验组别

存栏

1d

2d

3d

4d

5d

6d

7d

8d

9d

10d

11d

12d

1

感染对照组

30

83.33

73.33

33.33

13.33

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

2

F疫苗免疫组

30

93.33

73.33

76.67

83.33

86.67

83.33

90.00

86.67

86.67

90.00

83.33

86.67

3

中草药预防1组

30

86.67

63.33

66.67

63.33

60.00

63.33

66.67

66.67

70.00

66.67

70.00

70.00

4

中草药预防2组

30

100.00

56.67

53.33

63.33

63.33

63.33

70.00

73.33

73.33

70.00

70.00

73.33

5

中草药预防3组

30

86.67

76.67

40.00

10.00

3.33

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

6

中草药治疗1组

30

73.33

50.00

20.00

16.67

20.00

13.33

26.67

20.00

26.67

36.67

43.33

50.00

7

中草药治疗2组

30

88.89

50.00

20.00

26.67

23.33

26.67

30.00

33.33

36.67

36.67

50

53.33

8

空白对照组

30

93.33

96.67

93.33

100.00

90.00

86.67

93.33

96.67

90.00

93.33

93.33

93.33

4鸭坦布苏病毒防治试验

4.1试验后产蛋变化结果

攻毒前鸭群各组产蛋率均在90%以上。攻毒后，感染对照组产蛋量迅速下降，第5d降至0；中草药预防3组未见明显预防效果，第6d产蛋率降至0；F疫苗免疫组、中草药预防1组、中草药预防2组、中草药治疗1组和中草药治疗2组均出现明显防治效果。而空白对照组产蛋率则基本保持稳定。

表5鸭坦布苏病毒病毒试验产蛋率变化表单位：%

4.2致死率结果

攻毒后发现，感染对照组在攻毒后第5d开始出现死亡。结果显示，与感染对照组比较，F疫苗免疫组、中草药预防1组、中草药预防2组、中草药治疗2组在用药后不发生鸭只的死亡。

表6鸭坦布苏病毒病毒试验各组死亡率情况表

序号

试验组别

原存栏

攻毒种类

最后存栏数

死亡数

死亡率

1

感染对照组

30

鸭坦布苏病毒

27

3

10.00%

2

F疫苗免疫组

30

鸭坦布苏病毒

30

0

0.00%*

3

中草药预防1组

30

鸭坦布苏病毒

30

0

0.00%*

4

中草药预防2组

30

鸭坦布苏病毒

30

0

0.00%*

5

中草药预防3组

30

鸭坦布苏病毒

27

3

10.00%

6

中草药治疗1组

30

鸭坦布苏病毒

29

1

3.33%

7

中草药治疗2组

30

鸭坦布苏病毒

30

0

0.00%*

8

空白对照组

30

细胞培养液

30

0

0.00%*

*：与感染对照组差异显著。

4.3剖检病理变化结果

剖检病死鸭发现，卵巢病变明显，可见卵巢出血、萎缩、破裂，卵泡出血、萎缩、破裂，卵泡膜明显增厚、浑浊，严重者卵黄破裂，出现卵黄性腹膜炎；心脏表面呈现大量出血点，心脏内膜出血，心肌外观苍白，并附有条索状出血带，见图7。

卵黄性腹膜炎心脏病变

图7病死鸭病理变化

卵巢变化情况结果

攻毒试验结束后，每组随机挑选2只鸭进行解剖观察。结果发现，F疫苗免疫组卵巢基本正常；中草药治疗1组卵巢的损伤程度较轻，卵巢上仍有卵泡发育；而其余各组蛋鸭的卵巢均存在不同程度的萎缩或者钙化现象，详见图8。

F疫苗预防组中草药治疗1组

中草药预防2组中草药预防3组

感染对照组空白对照组

图8各实验组卵巢情况

5流行病学调查及田间应用试验

5.1流调结果

通过对全省南昌、九江、吉安等5个设区市的20个养殖场（含3个发病场）进行鸭坦布苏病毒流行病学调查研究，共采集样品524份进行检测。结果显示，鸭坦布苏病毒感染率较高，3个发病场均检测出鸭坦布苏病毒感染；20个调查场中有18个场检测出鸭坦布苏病毒阳性，场阳性率高达90.0%。流调样品检测结果如表7所示。

表7流调样品检测情况（部分）

采样市

采样县

存栏量

样品类型

样品总数

个体阳性率

场阳性率

宜春市

FX-1场

1000

卵黄组织

36

40.00%

100%

FX-2场

1000

卵黄组织

36

20.00%

南昌市

JX-1场

280

咽腔栻子

20

25.00%

100%

JX-2场

500

咽腔栻子

20

20.00%

上饶市

PY-1场

4000

咽腔栻子

18

0

66.7%

PY-2场

12000

咽腔栻子

18

40.00%

PY-3场

4300

咽腔栻子

18

40.00%

九江市

DC-1场

1100

咽腔栻子

20

0

66.7%

DC-2场

5000

咽腔栻子

18

40.00%

DC-3场

2300

咽腔栻子

20

40.00%

吉安市

SC-1场

1500

咽腔栻子

30

40.00%

90.0%

SC-2场

560

咽腔栻子

30

0

SC-3场

490

咽腔栻子

30

20.00%

SC-4场

1520

咽腔栻子

30

40.00%

SC-5场

1500

咽腔栻子

30

40.00%

YF-1场

1000

咽腔栻子

30

40.00%

YF-2场

2000

咽腔栻子

30

40.00%

YF-3场

4000

咽腔栻子

30

40.00%

YF-4场

1200

咽腔栻子

30

20.00%

YF-5场

1500

咽腔栻子

30

60.00%

合计

524

30.3%

90%

5.2田间应用结果

用试验筛选出的中草药（5%牛至提取液），在吉安地区进行了广泛的田间试验，主要针对吉安地区于2016年2月起，在一些蛋鸭养殖场陆续出现个别死亡、产蛋量骤降的病，按禽流感和鸭副粘病毒病治疗预防仍没有效果，造成了不小的经济损失。通过试验课题组采样检测，大部分诊断为鸭坦布苏病毒病，对诊断为鸭坦布苏病毒病的蛋鸭场用筛选出的中草药进行预防治疗，减轻了该病的危害，减少了养殖户的损失，提高了养殖效益和促进了养鸭者的积极性，为我省控制该病发挥了一定作用，为我省防治鸭坦布苏病毒病提供了借鉴经验,田间应用结果如表8所示。

表8田间应用结果统计表

应用区域

应用单位

起止时间

新增产值（万元）

新增纯收入（万元）

应用结果及社会效益

县区

XGX畜牧兽医局

2016年2月--2017年6月

95.6

19.12

通过两年的推广应用，所有应用养鸭场明显减少了因鸭坦布苏病毒并造成的经济损失，提高了养殖效益，提升了养殖户的积极性。

JSX畜牧兽医局

2016年2月--2017年6月

348

69.6

YFX畜牧兽医局

2016年2月--2017年6月

133.85

26.77

QYQ畜牧兽医局

2016年2月--2017年6月

28.18

5.6

JZQ农业局

2016年2月--2017年6月

34.2

6.84

XJX畜牧兽医局

2016年2月--2017年6月

84

18.48

合计

JAS畜牧兽医局

2016年2月--2017年6月

1014.6

202.92

6结论与讨论

鸭坦布苏病毒病不仅具有致病性，且是独立的病毒种类，具有可复制性，且在感染机体内能够稳定存在。通过病毒复制实验，结果证明实验功复制鸭坦布苏病毒病，经病毒分离、基因序列测定分析表明，其病原为黄病毒科黄病毒属的坦布苏病；为成功建立典型的疾病模型，保证试验结果具有较好的临床意义，本研究选择自然感染鸭分离的DTMUV野毒株，采用肌肉注射法复制疾病模型。结果证实，感染鸭的临床症状非常典型，剖检病变与自然感染的条件下鸭只基本一致。

注意事项有：一是病毒复制需要确保整个过程处于无菌状态，不能确保则需要对收集的病毒进行提纯处理。二是在接种时，进针要避开大的血管，把握好进针的深度，并做好密封工作，避免被污染。三是照蛋要勤快，每天进行早中晚三次照蛋。四是要接种后孵化要保持温度在37℃下，照蛋后要及时放进去。四是收集尿囊液时，不要在鸡胚死亡后立马收集，应在-20℃条件下反复冻融两次后再收集，提高病毒含量。

2.鸭坦布苏病毒病流行特征经本实验证实，病毒能够通过混群接触感染、空气传播等方式进行传播。而且两种传播方式中，接触传播方式实验组引起蛋鸭产生精神沉郁、采食下降、产蛋率急剧下降等临床症状较空气传播方式实验组更早出现。所以在日常生产过程中对患病鸭群应尽早进行隔离，并根据养殖场所处风向因素，合理布置病鸭群与健康鸭群的鸭舍位置，才能更加有效阻止该疫病的传播。虽然有相关文献报道鸭坦布苏病毒能够通过蚊虫、节肢动物等媒介进行传播，但此次试验受场地、试验开展季节等因素影响，未能对此传播方式进行证实，但在实际生产过程中，也应该做好灭蚊灭虫等工作，确保鸭群养殖环境健康。

3.中草药在预防鸭坦布苏病毒病防控与治疗中有一定效果。鸭坦布苏病毒预防用药与攻毒实验中，从产蛋变化情况评估，攻毒试验后攻毒组的蛋鸭产蛋量一直处于下降趋势，直至产蛋率降为0%，至试验结束时产蛋量仍然未见回升。中草药预防3组未见明显预防效果，第6d产蛋率降至0；F疫苗免疫组、中草药预防1组、中草药预防2组、中草药治疗1组和中草药治疗2组均出现明显防治效果；空白对照组产蛋率则基本保持稳定。本研究结果说明F疫苗和中草药1组、2组配方进行预防或治疗可以有效控制鸭坦布苏病毒病对鸭群减蛋的影响。

从致死率可知，感染对照组在攻毒后第5d开始出现死亡，死亡率10%；中草药预防3组死亡率为10%；中草药治疗1组死亡率为3.33%；F疫苗免疫组、中草药预防1组、中草药预防2组、中草药治疗2组死亡率为0。以上结果说明F疫苗和中草药1组、2组配方能较好保护鸭群，提升鸭群抵抗鸭坦布苏病毒侵袭的能力，降低病死率。

从卵巢恢复情况可发现，F疫苗免疫组卵巢基本正常；中草药治疗1组卵巢的损伤程度较轻，卵巢上仍有卵泡发育；而其余各组蛋鸭的卵巢均存在不同程度的萎缩或者钙化现象，说明F疫苗和中草药1组配方能保护蛋鸭卵巢。

攻毒实验中，对攻毒剂量、注射部位、治疗用药开始时间都要做到精准，既要保证蛋鸭感染病毒的方式接近于自然感染，又要保证感染后蛋鸭的临床症状和病例变化趋近于自然感染造成的危害。因此，此次攻毒实验中，攻毒剂量为5×103.5TCID50，注射部位为腿部肌肉注射，治疗用药时间为产蛋率下降50％左右（攻毒后第2天），初步取得了预期的实验效果。但实验过程中发现，攻毒感染造成的产蛋率下降较自然感染更快，所以，在今后的类似实验中，应该优化攻毒剂量、注射部位和治疗用药开始时间。

流行病学调查也显示，鸭坦布苏病毒在我省流行范围较为普遍，需加以重视，因此我们用筛选出的疫苗和中草药组方在部分感染鸭坦布苏病毒病的蛋鸭场，进行预防治疗的田间试验，发现疫苗是预防该病发生与防控的较好选择，中草药在预防鸭坦布苏病毒病的防控与治疗中也有一定效果，能够减轻该病危害，为养殖户减少损失，中草药组方用法、用量及生产效益比等仍需进一步深入研究，仍需进一步进行优化和更广的田间试验验证，展示出中草药对治疗鸭坦布苏病毒有独特的疗效和广阔的发展空间。

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