生物技术制药：抗体工程制药 1课件

第四章抗体工程制药第四章抗体工程制药（1）抗体的产生MMMMDMDGMDA成熟B细胞祖B细胞前B细胞（胞浆出现

IgM重链）不成熟B细胞MatureBcellsImmatureBcellsPre-BcellsPro-BcellsB细胞的发育过程第一节、概述（1）抗体的产生MMMMDMDGMDA成熟B（2）IgG的结构（2）IgG的结构生物技术制药：抗体工程制药1课件（3）抗原抗体反应（3）抗原抗体反应生物技术制药：抗体工程制药1课件生物技术制药：抗体工程制药1课件以ELISA侦测特定

病原体（4）抗体的应用WersternBlot、免疫荧光等检测

特定抗原2.医疗以毒素连结抗体攻击

病变細胞3.检验1.研究以ELISA（4）抗体的应用WersternBlot2生物技术制药：抗体工程制药1课件（5）抗体制药发展历史

1890年发现白喉抗毒素，建立了血清疗法，开抗体制药之先河(马血清多克隆抗体）。1937年用电泳法将血清分为白蛋白、甲种、乙种、丙种球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。1975年首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出McAb.在临床上主要用于诊断和治疗。1986年第一个治疗用单抗OKT3上市（5）抗体制药发展历史1890年发现白喉抗毒素，建立了血清McAb在免疫导向疗法中存在的问题：A、McAb均是鼠源性抗体，可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有5-6h，难以维持有效药物作用靶组织时间；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。需要解决的问题：A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相对分子质量。McAb在免疫导向疗法中存在的问题：A、McAb均是鼠源性解决问题的方法或途径—基因工程技术

1984年报道了人—鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的1/80-1/3。解决问题的方法或途径—基因工程技术

1984年报道了人—鼠嵌生物技术制药：抗体工程制药1课件生物技术制药：抗体工程制药1课件基因工程包括以下内容基因克隆技术将全套抗体Ｈ链和Ｌ链Ｖ区基因克隆出来，进行原核表达，筛选特异性的基因噬菌体抗体库技术含人免疫球蛋白的转基因小鼠基因工程包括以下内容基因克隆技术将全套抗体Ｈ链和Ｌ链Ｖ区基因治疗用抗体发展的三个阶段单克隆抗体基因工程抗体多克隆抗血清第一代抗体第二代抗体第三代抗体治疗用抗体发展的三个阶段单克隆抗体基因工程抗体多克隆抗血清第整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术

基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术噬菌体抗体库技术

Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技（6）抗体制药的现状1986年，美FDA批准上市了第一个用于治疗移植物抗宿主病（GVHD）抗体药物OrthocloneOKT3，翻开了生物医药历史崭新的一页8年后，FDA批准了第二个抗体药物上市。21世纪后，抗体药物研发上市速度加快，目前共有150余个抗体药物正在临床评估中，其中20多个已经上市，超过500种处于临床前研究阶段。1996年开始进入快速发展的轨道。

2002年治疗类风湿关节炎的完全人源化单抗humira批准上市，这是抗体药物发展具有里程碑意义大事。（6）抗体制药的现状1986年，美FDA批准上市了第一个用于抗体药物销售趋势图2009年销售400亿，复合增长率高达55%

目前是抗体药物的黄金期，增长势头还在持续,市场远未饱和

抗体药物销售趋势图2009年销售400亿，复合增长率高达55至2010年底，全世界共有34个治疗用抗体药物批准上市。2004年，约占全球药物市场份额的2％2006年，单抗药物的联合销售额为200亿美元。2008年，全球单抗药物市场规模达370亿美元

2009年，单抗药物的联合销售额为400亿美元。2010年，全球单抗药物市场规模达480亿美元

(诊断和研究试剂的单抗药物100亿美元销售额

)2006-2012年间的年销售额增长率为14%。而同一时期，小分子药物增长率预计仅为0.6%。单克隆抗体药成为增长最快的药物至2010年底，全世界共有34个治疗用抗体药物批准上市。现在有5大单抗药物占据了80%的市场份额，1.Remicade(类克,强生公司)2.Avastin安维汀、3.Rituxan美罗华(Roche和Geneteck)

4.Humira(修美乐,雅培公司)5.Herceptin(赫赛汀,

Roche和Geneteck)抗体药物的价格昂贵，治疗乳腺癌的Herceptin，250mg／支(15000元／支，一个疗程8支)，治疗淋巴瘤的Rituxan，400mg／支(21000元／支，一个疗程４支)现在有5大单抗药物占据了80%的市场份额，全世界正在研制的生物技术药品，25%为各类单克隆抗体。前三大生物治疗药物分别为单克隆抗体、疫苗和肿瘤坏死因子（TNF）抑制剂.

抗体市场快速增长的主要推动：一、销售持续攀升；二、新品种不断上市；三、研发方面的重金投入。大型医药公司还会通过收购来获得对抗体新药的控制权。如最近美国强生公司收购了抗体药物研发的领头羊Centocor公司。生物技术制药：抗体工程制药1课件2016年，美国FDA批准了22个新药，其中抗体药占七席，31.82%比重。美国ElusysTherapeutics公司的抗吸入性炭疽感染的Anthim（Obiltoxaximab）；美国礼来公司的抗中重度银屑病药物Taltz（Ixekizumab）；以色列梯瓦公司的血液嗜酸性粒细胞水平升高重度哮喘成人患者用药Cinqair（Reslizumab）；瑞士罗氏公司的抗膀胱癌治疗药物Tecentriq（Atezolizumab），瑞士罗氏和Biogen的复发缓解型多发性硬化症药物Zinbryta（Daclizumab）；美国礼来的抗软组织肉瘤药物Lartruvo（Olaratumab）；美国默沙东的降低梭菌毒素B感染风险药物Zinplava（Bezlotoxumab）。2016年，美国FDA批准了22个新药，其中抗体药占七席，3生物技术制药：抗体工程制药1课件（6）抗体制药－国内市场1.利妥昔单抗销售额领先

TOP5品种依次是利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、雷珠单抗和重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，TOP5品种用药金额约占据抗体市场的近四分之三。2.广州地区销量最大

广州是最大的抗体药物市场，占有总市场份额的30％，其次是北京和上海。（6）抗体制药－国内市场1.利妥昔单抗销售额领先

TOP53.罗氏产品占绝对优势上海罗氏制药操控着整个国内抗体药物市场。巴利昔单抗是北京诺华的独家产品3.罗氏产品占绝对优势（6）抗体制药－国内生产研究现状CFDA到2015年底共批准了10个抗体药物上市，国内形成了三个抗体药物的中试及产业化基地。产业化基地：北京基地（百泰生物药业）；上海基地（中信国健药业）；中试：第四军医大学和成都华神集团合作形成西安基地。

（6）抗体制药－国内生产研究现状CFDA到2015年底共批准泰欣生(尼妥珠单抗,Nimotuzumab，百泰药业)：重组人源化抗人表皮因子受体(EGFR)单克隆抗体注射液，2008年6月上市，人源化程度95%，是世界上第三个用于治疗实体瘤的单克隆抗体。目前定价:50mg/10ml（3680元）泰欣生上市不仅代表我国在单抗药物人源化技术领域取得了重大突破,更重要的意义在于突破了哺乳动物细胞规模化培养这一生物技术瓶颈

泰欣生(尼妥珠单抗,Nimotuzumab，百泰药业)：重组碘［131I］美妥昔单抗注射液（西安基地）［131I］人鼠嵌合型肿瘤细胞核单抗注射液（上海基地）注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白”（商品名为“益赛普”）（上海基地）碘［131I］美妥昔单抗注射液（西安基地）抗体制药的国内状态随着生物单抗专利到期，国内已进行了仿制生物制品的研究开发。据CFDA最新数据，国内有多家获得临床批文。利妥昔单抗2016年已由正大天晴药业获得临床批文（利妥昔单抗CXSL1500056苏）华兰的重组CD20单抗(利妥昔单抗)获得临床批文（CXSL1400096豫）曲妥珠单抗2016年国内已有两家企业获得临床批文，分别是正大天晴的注射用曲妥珠CXSL1400013苏），华兰的重组抗人表皮生长因子受体2(HER2)单抗(曲妥珠单抗)注射用药（CXSL1400077豫）。抗体制药的国内状态随着生物单抗专利到期，国内已进行了仿制生物瓶颈：大规模动物细胞培养工艺，而此类工艺属于欧美严禁出口的技术，长期以来对我国实行封锁。

成都基地瓶颈：大规模动物细胞培养工艺，而此类工艺属于欧美严禁出口的技（1）概念抗原决定族

（Epitope,Antigenicdeterminant）●一个抗原分子上可能有数个抗原决定基●

每个抗原决定族至少诱生一种专一性抗体●蛋白质性质抗原决定基含有六个以上氨基酸第二节、单克隆抗体及其制备（1）概念抗原决定族（Epitope,Antigeni多价抗原单克隆（致敏的B细胞）单克隆抗体多价抗原单克隆单克隆抗体单克隆抗体

基本原理

细胞工程抗体----杂交瘤----单克隆抗体单克隆抗体基本原理细胞工程抗体----杂交（2）多克隆抗体

(Polyclonalantibody)（2－1）概念给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物,它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的,称为多克隆抗体.（2）多克隆抗体

(Polyclonalantibody（2－2

）实验室制备多克隆抗体研究、诊断用所用动物：1Balb/c小鼠，6－8周龄；雄性

2大鼠3兔子生后约12周。抗原：1纯化的抗原（线性抗原或构型抗原）

2非纯化抗原技术关键：抗原制备应用：免疫学检测

（2－2）实验室制备多克隆抗体所用动物：1Balb/c小抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234B細胞抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234B細（2－3）制备多克隆抗体药物－紧急被动免疫和及紧急预防1234马血清抗原（破伤风毒素）破伤风抗毒素血清一头成年马反复采血可获得10000ml以上的抗血清

（2－3）制备多克隆抗体药物1234马血清抗原（破伤风毒素）类毒素毒素马血清抗毒素超敏反应抗体抗原类毒素毒素马血清抗毒素超敏反应抗体抗原马血清抗毒素的两重性：(1)特异性抗体----中和毒素(2)异种抗原，可刺激机体产生抗马血清抗体马血清具有立即提供保护的优势，但异种gamma-球蛋白只是短期有效，常常导致病理合并症（血清病）和过敏反应。马血清抗毒素的两重性：人源多克隆抗体－血液制品

人的gamma-球蛋白是最理想的(同源性免疫球蛋白)，但具有传播肝炎和爱滋病的风险。献血员免疫（白喉毒素、狂犬病疫苗等）少量采血测效价大量采血制备抗体是人源多克隆抗体－血液制品

人的gamma-球蛋白是最理（3）单克隆抗体

(Monoclonalantibody,McAb)（3－1）概念:通过B细胞杂交瘤技术,获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体.特点:单一特异;可重复;大量供应不需纯抗原;灵敏度高

（3）单克隆抗体

(Monoclonalantibody,骨髓瘤细胞致敏的B淋巴细胞杂交瘤骨髓瘤细胞致敏的B淋巴细胞杂交瘤HAT:次黄嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶HAT:次黄嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)

(3-2)、抗原与动物免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原不需纯化;化学合成或者提纯微生物或细胞可直接作为抗原免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠Balb/c小鼠，8-12周龄；雄性动物与骨髓瘤同品系P183页佐剂:弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂(3-2)、抗原与动物免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原免疫方法：体内免疫:免疫原性强,抗原量多.皮下注射,腹腔注射免疫体外免疫:不能用体内免疫的杂交瘤细胞株不稳定

初步免疫和加强免疫测定抗体效价处死小鼠,去脾细胞

免疫方法：生物技术制药：抗体工程制药1课件基本方法：取适量脾细胞与骨髓瘤细胞进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。其他融合方法:电融合等细胞：骨髓瘤细胞（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)缺陷型）应和免疫动物属于同一品系，这样杂交率高。（3－3）免疫及细胞融合基本方法：取适量脾细胞与骨髓瘤细胞进行混合，在PEG作用下诱饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的细胞称饲养细胞。常用的有小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若癌细胞可培养生长浆细胞Bcell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组染色体混在一起也可以培养生长产生专一性抗体一个

Bcell只产生一种抗体癌细胞浆细胞融合瘤YYYYYYYYYYYYYYYYYY细两组1234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗体分开1234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾細胞+各抗细胞融合后存在脾细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞细胞融合后存在脾细胞HAT培养液：次黄嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T)，氨基蝶呤可阻断DNA的合成。胸腺嘧啶激酶（TK）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）。如细胞含有此两种酶则可启动补救（应急）途径。次黄嘌呤,胸腺嘧啶在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶作用下合成DNA的合成，并可克服氨基蝶呤的阻断．（3－4）筛选及抗体检测HAT培养液：次黄嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T)在HAT培养液中，骨髓瘤细胞缺乏TK或HGPRT而不能生长，而脾细胞能生长但不能长期增殖而死亡，只有杂交瘤细胞具有以上两种酶故能生长。脾细胞（HGPRT+,TK+,不能长期生长）骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+,TK+，能够生长）在HAT培养液中，骨髓瘤细胞缺乏TK或HGPRT而不能生长，杂交瘤的克隆化指将抗体阳性孔进行克隆化。作用:分开抗体分泌细胞和非分泌细胞及其他抗体分泌细胞，非分泌细胞比分泌细胞生长快，可抑制分泌细胞的生长。方法：常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。（3－5）杂交瘤的克隆化杂交瘤的克隆化指将抗体阳性孔进行克隆化。（3－5）杂交瘤的克有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培养液。软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培养。有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中单抗检测RIA、ELISA、免疫荧光技术等杂交瘤细胞的冻存每次克隆后进行冻存常规冻存法单抗检测RIA、ELISA、免疫荧光技术等（3-6）单克隆抗体的鉴定：特异性鉴定；类与亚类的鉴定；类:酶标或荧光素标记的IgG,IgM中和活性的鉴定；识别抗原表位的鉴定；亲和力的鉴定。效价鉴定（3-6）单克隆抗体的鉴定：特异性鉴定；杂交瘤细胞的鉴定—染色体分析正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62-68，NS-1为54-64，大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝点。杂交瘤细胞的鉴定—染色体分析正常鼠的脾细胞染色体数：40，全杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，则反。杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结单克隆抗体的大量生产：体外培养法：无血清培养基悬浮培养体内接种杂交瘤细胞：收取腹水或血清。（3－7）单抗大量生产单克隆抗体的大量生产：（3－7）单抗大量生产（1）体外培养法：可获得10µg/ml的抗体。采用RPMI1640，添加10%-20%牛血清。但由于培养液中含有血清成分，给纯化带来困难。改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可达2*107/ml,收集的单克隆抗体可达400µg/ml。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达108。（1）体外培养法：可获得10µg/ml的抗体。采用RPMI1（2）动物体内诱生法：可获得10mg/ml的抗体。基本程序：接种前1-2周，小鼠腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或用液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞，7-12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。（2）动物体内诱生法：可获得10mg/ml的抗体。

抗体-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和

脾脏产生各种

B細胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫

抗原采血后可得传统抗血清已建立之小鼠骨髓癌细胞株由脾脏收集

B細胞抗原通常有多个抗原決定基免疫后的脾脏约在两月內注射五到八次AgX抗体-a-b-c-d-a-b--d细胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤细胞（Subcloning）

(确定只有一种细胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌细胞Bcell脾细胞分株培养筛选筛选单抗传统抗体(抗血清)试验专一性对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d’新的抗原-d细胞融合-a-b-c-dAgAgELISAHATPEG单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题？单克隆抗体的特异性由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应异种抗体反应鼠源性单抗用于人体，产生人抗鼠抗体（HAMA），导致异源性超敏反应

至2003年再没有新的鼠源抗体药物进入临床研究

单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题？第四章抗体工程制药第四章抗体工程制药（1）抗体的产生MMMMDMDGMDA成熟B细胞祖B细胞前B细胞（胞浆出现

IgM重链）不成熟B细胞MatureBcellsImmatureBcellsPre-BcellsPro-BcellsB细胞的发育过程第一节、概述（1）抗体的产生MMMMDMDGMDA成熟B（2）IgG的结构（2）IgG的结构生物技术制药：抗体工程制药1课件（3）抗原抗体反应（3）抗原抗体反应生物技术制药：抗体工程制药1课件生物技术制药：抗体工程制药1课件以ELISA侦测特定

病原体（4）抗体的应用WersternBlot、免疫荧光等检测

特定抗原2.医疗以毒素连结抗体攻击

病变細胞3.检验1.研究以ELISA（4）抗体的应用WersternBlot2生物技术制药：抗体工程制药1课件（5）抗体制药发展历史

1890年发现白喉抗毒素，建立了血清疗法，开抗体制药之先河(马血清多克隆抗体）。1937年用电泳法将血清分为白蛋白、甲种、乙种、丙种球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。1975年首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出McAb.在临床上主要用于诊断和治疗。1986年第一个治疗用单抗OKT3上市（5）抗体制药发展历史1890年发现白喉抗毒素，建立了血清McAb在免疫导向疗法中存在的问题：A、McAb均是鼠源性抗体，可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有5-6h，难以维持有效药物作用靶组织时间；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。需要解决的问题：A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相对分子质量。McAb在免疫导向疗法中存在的问题：A、McAb均是鼠源性解决问题的方法或途径—基因工程技术

1984年报道了人—鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的1/80-1/3。解决问题的方法或途径—基因工程技术

1984年报道了人—鼠嵌生物技术制药：抗体工程制药1课件生物技术制药：抗体工程制药1课件基因工程包括以下内容基因克隆技术将全套抗体Ｈ链和Ｌ链Ｖ区基因克隆出来，进行原核表达，筛选特异性的基因噬菌体抗体库技术含人免疫球蛋白的转基因小鼠基因工程包括以下内容基因克隆技术将全套抗体Ｈ链和Ｌ链Ｖ区基因治疗用抗体发展的三个阶段单克隆抗体基因工程抗体多克隆抗血清第一代抗体第二代抗体第三代抗体治疗用抗体发展的三个阶段单克隆抗体基因工程抗体多克隆抗血清第整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术

基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术噬菌体抗体库技术

Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技（6）抗体制药的现状1986年，美FDA批准上市了第一个用于治疗移植物抗宿主病（GVHD）抗体药物OrthocloneOKT3，翻开了生物医药历史崭新的一页8年后，FDA批准了第二个抗体药物上市。21世纪后，抗体药物研发上市速度加快，目前共有150余个抗体药物正在临床评估中，其中20多个已经上市，超过500种处于临床前研究阶段。1996年开始进入快速发展的轨道。

2002年治疗类风湿关节炎的完全人源化单抗humira批准上市，这是抗体药物发展具有里程碑意义大事。（6）抗体制药的现状1986年，美FDA批准上市了第一个用于抗体药物销售趋势图2009年销售400亿，复合增长率高达55%

目前是抗体药物的黄金期，增长势头还在持续,市场远未饱和

抗体药物销售趋势图2009年销售400亿，复合增长率高达55至2010年底，全世界共有34个治疗用抗体药物批准上市。2004年，约占全球药物市场份额的2％2006年，单抗药物的联合销售额为200亿美元。2008年，全球单抗药物市场规模达370亿美元

2009年，单抗药物的联合销售额为400亿美元。2010年，全球单抗药物市场规模达480亿美元

(诊断和研究试剂的单抗药物100亿美元销售额

)2006-2012年间的年销售额增长率为14%。而同一时期，小分子药物增长率预计仅为0.6%。单克隆抗体药成为增长最快的药物至2010年底，全世界共有34个治疗用抗体药物批准上市。现在有5大单抗药物占据了80%的市场份额，1.Remicade(类克,强生公司)2.Avastin安维汀、3.Rituxan美罗华(Roche和Geneteck)

4.Humira(修美乐,雅培公司)5.Herceptin(赫赛汀,

Roche和Geneteck)抗体药物的价格昂贵，治疗乳腺癌的Herceptin，250mg／支(15000元／支，一个疗程8支)，治疗淋巴瘤的Rituxan，400mg／支(21000元／支，一个疗程４支)现在有5大单抗药物占据了80%的市场份额，全世界正在研制的生物技术药品，25%为各类单克隆抗体。前三大生物治疗药物分别为单克隆抗体、疫苗和肿瘤坏死因子（TNF）抑制剂.

抗体市场快速增长的主要推动：一、销售持续攀升；二、新品种不断上市；三、研发方面的重金投入。大型医药公司还会通过收购来获得对抗体新药的控制权。如最近美国强生公司收购了抗体药物研发的领头羊Centocor公司。生物技术制药：抗体工程制药1课件2016年，美国FDA批准了22个新药，其中抗体药占七席，31.82%比重。美国ElusysTherapeutics公司的抗吸入性炭疽感染的Anthim（Obiltoxaximab）；美国礼来公司的抗中重度银屑病药物Taltz（Ixekizumab）；以色列梯瓦公司的血液嗜酸性粒细胞水平升高重度哮喘成人患者用药Cinqair（Reslizumab）；瑞士罗氏公司的抗膀胱癌治疗药物Tecentriq（Atezolizumab），瑞士罗氏和Biogen的复发缓解型多发性硬化症药物Zinbryta（Daclizumab）；美国礼来的抗软组织肉瘤药物Lartruvo（Olaratumab）；美国默沙东的降低梭菌毒素B感染风险药物Zinplava（Bezlotoxumab）。2016年，美国FDA批准了22个新药，其中抗体药占七席，3生物技术制药：抗体工程制药1课件（6）抗体制药－国内市场1.利妥昔单抗销售额领先

TOP5品种依次是利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、雷珠单抗和重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，TOP5品种用药金额约占据抗体市场的近四分之三。2.广州地区销量最大

广州是最大的抗体药物市场，占有总市场份额的30％，其次是北京和上海。（6）抗体制药－国内市场1.利妥昔单抗销售额领先

TOP53.罗氏产品占绝对优势上海罗氏制药操控着整个国内抗体药物市场。巴利昔单抗是北京诺华的独家产品3.罗氏产品占绝对优势（6）抗体制药－国内生产研究现状CFDA到2015年底共批准了10个抗体药物上市，国内形成了三个抗体药物的中试及产业化基地。产业化基地：北京基地（百泰生物药业）；上海基地（中信国健药业）；中试：第四军医大学和成都华神集团合作形成西安基地。

（6）抗体制药－国内生产研究现状CFDA到2015年底共批准泰欣生(尼妥珠单抗,Nimotuzumab，百泰药业)：重组人源化抗人表皮因子受体(EGFR)单克隆抗体注射液，2008年6月上市，人源化程度95%，是世界上第三个用于治疗实体瘤的单克隆抗体。目前定价:50mg/10ml（3680元）泰欣生上市不仅代表我国在单抗药物人源化技术领域取得了重大突破,更重要的意义在于突破了哺乳动物细胞规模化培养这一生物技术瓶颈

泰欣生(尼妥珠单抗,Nimotuzumab，百泰药业)：重组碘［131I］美妥昔单抗注射液（西安基地）［131I］人鼠嵌合型肿瘤细胞核单抗注射液（上海基地）注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白”（商品名为“益赛普”）（上海基地）碘［131I］美妥昔单抗注射液（西安基地）抗体制药的国内状态随着生物单抗专利到期，国内已进行了仿制生物制品的研究开发。据CFDA最新数据，国内有多家获得临床批文。利妥昔单抗2016年已由正大天晴药业获得临床批文（利妥昔单抗CXSL1500056苏）华兰的重组CD20单抗(利妥昔单抗)获得临床批文（CXSL1400096豫）曲妥珠单抗2016年国内已有两家企业获得临床批文，分别是正大天晴的注射用曲妥珠CXSL1400013苏），华兰的重组抗人表皮生长因子受体2(HER2)单抗(曲妥珠单抗)注射用药（CXSL1400077豫）。抗体制药的国内状态随着生物单抗专利到期，国内已进行了仿制生物瓶颈：大规模动物细胞培养工艺，而此类工艺属于欧美严禁出口的技术，长期以来对我国实行封锁。

成都基地瓶颈：大规模动物细胞培养工艺，而此类工艺属于欧美严禁出口的技（1）概念抗原决定族

（Epitope,Antigenicdeterminant）●一个抗原分子上可能有数个抗原决定基●

每个抗原决定族至少诱生一种专一性抗体●蛋白质性质抗原决定基含有六个以上氨基酸第二节、单克隆抗体及其制备（1）概念抗原决定族（Epitope,Antigeni多价抗原单克隆（致敏的B细胞）单克隆抗体多价抗原单克隆单克隆抗体单克隆抗体

基本原理

细胞工程抗体----杂交瘤----单克隆抗体单克隆抗体基本原理细胞工程抗体----杂交（2）多克隆抗体

(Polyclonalantibody)（2－1）概念给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物,它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的,称为多克隆抗体.（2）多克隆抗体

(Polyclonalantibody（2－2

）实验室制备多克隆抗体研究、诊断用所用动物：1Balb/c小鼠，6－8周龄；雄性

2大鼠3兔子生后约12周。抗原：1纯化的抗原（线性抗原或构型抗原）

2非纯化抗原技术关键：抗原制备应用：免疫学检测

（2－2）实验室制备多克隆抗体所用动物：1Balb/c小抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234B細胞抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234B細（2－3）制备多克隆抗体药物－紧急被动免疫和及紧急预防1234马血清抗原（破伤风毒素）破伤风抗毒素血清一头成年马反复采血可获得10000ml以上的抗血清

（2－3）制备多克隆抗体药物1234马血清抗原（破伤风毒素）类毒素毒素马血清抗毒素超敏反应抗体抗原类毒素毒素马血清抗毒素超敏反应抗体抗原马血清抗毒素的两重性：(1)特异性抗体----中和毒素(2)异种抗原，可刺激机体产生抗马血清抗体马血清具有立即提供保护的优势，但异种gamma-球蛋白只是短期有效，常常导致病理合并症（血清病）和过敏反应。马血清抗毒素的两重性：人源多克隆抗体－血液制品

人的gamma-球蛋白是最理想的(同源性免疫球蛋白)，但具有传播肝炎和爱滋病的风险。献血员免疫（白喉毒素、狂犬病疫苗等）少量采血测效价大量采血制备抗体是人源多克隆抗体－血液制品

人的gamma-球蛋白是最理（3）单克隆抗体

(Monoclonalantibody,McAb)（3－1）概念:通过B细胞杂交瘤技术,获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体.特点:单一特异;可重复;大量供应不需纯抗原;灵敏度高

（3）单克隆抗体

(Monoclonalantibody,骨髓瘤细胞致敏的B淋巴细胞杂交瘤骨髓瘤细胞致敏的B淋巴细胞杂交瘤HAT:次黄嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶HAT:次黄嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)

(3-2)、抗原与动物免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原不需纯化;化学合成或者提纯微生物或细胞可直接作为抗原免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠Balb/c小鼠，8-12周龄；雄性动物与骨髓瘤同品系P183页佐剂:弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂(3-2)、抗原与动物免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原免疫方法：体内免疫:免疫原性强,抗原量多.皮下注射,腹腔注射免疫体外免疫:不能用体内免疫的杂交瘤细胞株不稳定

初步免疫和加强免疫测定抗体效价处死小鼠,去脾细胞

免疫方法：生物技术制药：抗体工程制药1课件基本方法：取适量脾细胞与骨髓瘤细胞进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。其他融合方法:电融合等细胞：骨髓瘤细胞（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)缺陷型）应和免疫动物属于同一品系，这样杂交率高。（3－3）免疫及细胞融合基本方法：取适量脾细胞与骨髓瘤细胞进行混合，在PEG作用下诱饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的细胞称饲养细胞。常用的有小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若癌细胞可培养生长浆细胞Bcell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组染色体混在一起也可以培养生长产生专一性抗体一个

Bcell只产生一种抗体癌细胞浆细胞融合瘤YYYYYYYYYYYYYYYYYY细两组1234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗体分开1234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾細胞+各抗细胞融合后存在脾细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞细胞融合后存在脾细胞HAT培养液：次黄嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T)，氨基蝶呤可阻断DNA的合成。胸腺嘧啶激酶（TK）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）。如细胞含有此两种酶则可启动补救（应急）途径。次黄嘌呤,胸腺嘧啶在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶作用下合成DNA的合成，并可克服氨基蝶呤的阻断．（3－4）筛选及抗体检测HAT培养液：次黄嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T)在HAT培养液中，骨髓瘤细胞缺乏TK或HGPRT而不能生长，而脾细胞能生长但不能长期增殖而死亡，只有杂交瘤细胞具有以上两种酶故能生长。脾细胞（HGPRT+,TK+,不能长期生长）骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+,TK+，能够生长）在HAT培养液中，骨髓瘤细胞缺乏TK或HGPRT而不能生长，杂交瘤的克隆化指将抗体阳性孔进行克隆化。作用:分开抗体分泌细胞和非分泌细胞及其他抗体分泌细胞，非分泌细胞比分泌细胞生长快，可抑制分泌细胞的生长。方法：常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。（3－5）杂交瘤的克隆化杂交瘤的克隆化指将抗体阳性孔进行克隆化。（3－5）杂交瘤的克有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培养液。软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态