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果胶酶酶活力测定方法果胶酶降解底物的糖苷键,生成含还原端基产物,故采用常用的还原糖测定法—DNS法。测定原理果胶酶在一定条件下水解底物果胶,生成半乳糖醛酸等醛糖,醛糖与3,5—二硝基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比,在540nm下测其吸光度,从而计算出果胶酶酶活。·酶活性单位定义:在上述测定条件下,以每分钟水解底物生成1μg还原糖所需酶量定义为一个酶活性单位,单位为U/mL。DNS试剂400mL6.3g3,5-21g185g水合酒石酸钾钠(C4H4O6KNa-4H2O)、5.0g苯酚、5.0g无水亚硫酸钠,温水浴不超过4810005~7d6个月。pH7.0的磷酸—柠檬酸缓冲溶液71.62g、C6H8O7·H2O21.01g1000mL,按16.47:3.53的体积比混合,即可。底物的配制1.00gpH7.00.5100mL0~4℃冰箱里。粗酶液的制备取发酵液,于10000r/min,4℃离心5min后,取上清液即为酶液。酶学性质分析酶的最适温度45505560657.0的条件下,反应30min100%,其他的以它的百分比计。酶的最适pH在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0(pH≤8.0的用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,pH>8.0的用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液,最适温度的条件下,反应30mi100%,其他的以它的百分比计。酶的温度稳定性在适的pH条件下,将酶液放置在不同的温度(55℃、60℃、65℃、70℃)下,隔约15pH100%他的以它的百分比计。酶的pH稳定性分别用不同pH(pH3.pH4.0pH5.0pH6.0pH7.pH8.0pH9.pH10.0,254h后,然后调到最适pH条件下,测定其pH100%。结果及分析酶的最适温度pH7.00.2mol/LNa2HPO4-0.lmol/L反应。结果见图2,果胶酶的最适反应温度范围为55~65℃,最适温度为60℃。酶的最适pHpH4pH8.0~9.0pHpH8.5时候酶活达到最高值。热稳定性将粗酶液分别置于55℃、60℃、65℃、70℃的恒温水浴中,每隔一定的时间取样测定65530min时,酶活有略为上升,酶活力是原来的120%,这可能是在保温的过程中助于酶活构象的展开,更易酶反6015min的时候也有酶活上升的现象,之后酶活120min后,残余酶活力是原来的60120min61%70℃保温的过程中,在保温20min120min时,残余酶活力降至原来的29%。pH稳定性分别用不同pH(pH3.0pH4.pH5.0pH6.0pH7.pH8.0pH9.pH10.0,254hpH条件下,测定其酶pH8pH3.0~10.0时有很好的稳定性,在
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