毕业论文-耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌耐药基因的研究进展

题目耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌耐药基因的研究进展学院：专业：班级：学号：学生姓名：指导教师：起讫日期：2017年1月16日-2017年5月5日毕业设计（论文）目录摘要32705 =2\*ROMANI32705关键词 =2\*ROMANIAbstract………………..=3\*ROMANIIKeywords………………………=3\*ROMANIITOC\o"1-3"\h\u327051、鲍曼不动杆菌的研究背景 耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌耐药基因的研究进展1、鲍曼不动杆菌的研究背景鲍曼不动杆菌越来越成为影响严重疾病患者并对几乎所有抗生素产生抵抗力。针对革兰氏阴性细菌的最有效的是β-内酰胺类抗生素，是严重鲍曼不动杆菌的首选药物。然而，由于生产碳青霉烯类水解的β-内酰胺酶类抗生素（包括OXA型碳青霉烯酶和MBL），越来越多的鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药。近年来，在亚洲国家越来越多地报道了鲍曼不动杆菌生产的OXA型碳青霉烯酶。三十几项研究显示了传播的碳青霉烯抗性鲍曼不动杆菌分离株不同地理区域，包括中东国家等如阿拉伯联合酋长国[1]，巴林[2]和科威特[3]，在阿拉伯海湾地区，blaOXA-23和blaOXA-40碳青霉烯酶[4]。据报道，生产鲍曼不动杆菌分离株在利雅得，沙特阿拉伯[4]。另外，检测到blaOXA-23-阳性A.鲍曼不动杆菌在五名成人密集患者中阿拉伯联合酋长国谢赫哈利法医疗中心的护理单位阿联酋也有报道[5]。在以前的研究中，Mugnier等分析了八种鲍曼不动杆菌菌株隔离在Salmaniya医疗中心发现巴林王国生产的所有分离株碳青霉烯酶基因[6]。对于八个分离株，两个有遗传blaOXA-23和一个孤立携带的blaOXA-58，而另一个五种鲍曼不动杆菌分离株产生blaOXA-72。APubMed搜索没有标识任何已发表的报告描述blaOXA-23生产鲍曼不动杆菌的发生或传播在也门在这项研究中，我们第一次报告亚胺培南抗性鲍曼不动杆菌的产生blaOXA-23基因在也门。新德里金刚烷-b-内酰胺酶（NDM）最近在肠杆菌科中被鉴定中东国家，包括NDM-1,此外，在阿拉伯联合酋长国分离产生NDM-2的鲍曼不动杆菌菌株[7]。但在我国并没有见到。AlThawra医院新生儿部门的大量学习，2011年也门萨那，不动杆菌属同时，与败血症有关，但分离株易于感染,在研究中检测到blaOXA-23[8]。2013年2月在同一间医院（AlThawra医院）可能表明，耐药性流行病学不动杆菌属物种中巴布宁正在发生变化在也门，正如我们在其他国家所观察到的那样如阿尔及利亚[9]。此外，我们在研究中确定了存在氨基糖苷乙酰转移酶（6¢）-Ib一种鲍曼不动杆菌菌株（Y82），几篇文章发表了描述在阿拉伯海湾分离的菌株中的侧编码基因地区。在科威特，Bonnin等已报道氨基糖苷乙酰转移酶aac（6¢）-Ib在鲍曼不动杆菌产生GES型碳青霉烯酶[10]。中东地区，携带armA的菌株报道各个地区，包括苏丹国肠杆菌科阿曼[11]和阿布扎比[12]。据我们所知，blaOXA-23与16SrRNA甲基化的共同发生，asearmA在也门医院首次报道。鲍曼不动杆菌产生碳青霉烯酶AMEs，和16SrRNA甲基化酶可能与之相关也门与阿拉伯半岛之间的关系也与其他亚洲国家在病人交流方面，特别是在也门冲突和战争局面该区域。在我们的菌株中发现的ST2以前在伊朗[13]和Kwawait[14]中被检测到。此外，以前在邻近的也门的沙特阿拉伯进行的研究获得的MLST数据显示，具有ST2的鲍曼不动杆菌菌株是该国恢复的主要克隆[15]。广谱抗生素的出现，鲍曼不动杆菌临床分离株的耳廓抗性谱这个国家令人担忧，因为抗菌药治疗这些患者的效果将非常有限。发现不一样的碳青霉烯类利福平和粘菌素最多对抗MDR鲍曼不动杆菌的活性抗微生物剂分离株这些抗生素可能是一个很好的选择替代治疗。以前的研究表明，利福平粘菌素是最活跃的组合治疗由MDR引起的院内感染的患者[16][17]。鲍曼不动杆菌鉴于天然水库鲍氏不动杆菌菌株及其传播机制也门国家依然未知，加强了监督和卫生政策的检测和控制迫切需要MDR病原体以避免出现并传播这些生物。

2、耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的耐药机制2.1鲍曼不动杆菌的基因组较大近期测得该菌的基因组为3.98Mb，有3830个开发读码框架，易于接受外源性基因。这使得此菌对环境有极强的适应性且可容纳大量携有的耐药基因移动元件[18]。以I类整合子最为常见。在整合子5’保守端有编码整合酶基因及启动子，中间的基因盒可携多种不同性质的耐药基因,可导致多重耐药。国外的研究表明[18]，鲍曼不动杆菌的基因组中有AbaRl耐药岛，含45个耐药基因,一株多重耐药株的耐药岛有74个耐药基因，其中含32个外排基因。已在此菌中发现转座子携带的I类整合子，也发现菌中的插入序列ISAbal，可过表达Ampc酶和OXA51/69酶。鲍曼不动杆菌较大的基因组是其易出现多重耐药的结构基础。2.2产生多类药物的灭活酶或修饰酶2.2.1β-内酰胺酶A类酶：此菌可产生以TEM-1酶为代表的多种超广谱酶，以CTX-M-2为代表的CTX-M型酶。以SHV-12为代表的SHV酶。常见的酶还包括SHV-12、PER-1、VEB-l等，多为超广谱酶。2)B类酶：主要为耐碳青霉烯的金属酶(MBLs)。此酶的活性依赖锌离子的存在，故名金属酶。IMP类金属酶在此菌中已发现有IMP-1、IMP-2、IMP-4、IMP-5、IMP-6、IMP-1。此外还发现有VIM-2型种SIM-1型金属酶等[19]。3)C类酶：代表酶为不动杆菌来源的头孢菌素酶(acinetobacter-derivedcephalosporitinases,ADCs)，另外还有DHA-1型酶等。侯天文等[12]等发现此菌携有blaDHA-l基因，同时还有blaTEM-1型基因。其DⅡA-1型AmpC酶是一种质粒介导的头孢菌素酶，与摩氏摩根菌染色体AmpC酶氨基酸序列一致率达98.17％～99.10％。首次发现的产DHA-l型AmpC酶细菌是1992年白沙特阿拉伯Dha-ham医院一个患者大便标本中分离的肠炎沙门菌。产质粒介导的AmpC酶革兰阴性杆菌临床可选用第4代头孢菌素和碳青酶烯类药疗。4)D类酶：即Bush分类的2D类酶,0XA-23型酶是第1个从鲍曼不动杆菌中分离出来的D类碳青霉烯酶，bla0XA-23基因位于质粒或者染色体上。目前在耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌中已经发现了20余种0XA酶，主要有位于质粒的0XA-23、oXA-58，位于染色OXA-24、OXA-25、OXA-26、0XA-40和可自然出现的类似0XA-51/69酶的0XA-64、0XA-65、OXA-66、0XA-68、OXA-70、0XA-71、OXA-78、OXA-79、0XA-80、OXA-82，并且新的酶仍不断被发现。OXA酶首先与药物底物相互作用形成复合体或组成一个短暂的酰基酶中问体，继而γ-O丝氨酸位点攻击β-内酰胺环碳酰基的碳原子，随后中间体迅速脱酰基化释放出完整的酶和一个开环的产物。据钱洁等分析，OXA-23不是导致鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯的唯一因素，而是由多种碳青霉烯酶共同作用并联含其他机制(例如外排泵的过度表达、外膜蛋白的变异引起的药物通透性降低共同导致的高水平耐药[20]。2.2.2氨基糖苷类修饰酶(AMEs)AMEs分为乙酰转移酶(AAC)、核苷转移酶(ANT)和磷酸转移酶(APH)3大类共50余种，可修饰氨基糖苷类的特定基团，降低或丧失对靶似核糖体的亲和力。此类基因借助于整合子、转座子、质粒等町移动性遗传元件在同种或不同种细菌间传播。酶的修饰作用导致了高水平耐药,现已从鲍曼不动杆菌中检出aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ，aac(3)-Ⅲ、aac(3)-Ⅳ、aac(6’)-Ⅰ、aadA1、aadB、ant(2’’)-I、ant(3’’)-I、aphA1、aphA6等多种修饰酶基因[21]。多为数种基因同时存在。不同国家和地区细菌的修饰酶基因分布有很大差异，如美国以ant(2’’)、aac(3)、aac(6’)最为常见，而日本则以aac(6’)多见。氨基糖苷类抗菌药物与β-内酰胺类药物合用过去曾作为治疗此菌感染的一线药物。然而近年国内的分子生物学研究发现。它可以通过获得氨基糖苷类修饰酶免受氨基糖苷类药物攻击[22]。2.2.3四环素的耐药酶此菌耐四环素的基因TetA和TetB基因与它的外排作用有关。它的TetM基因有保护核糖体免受四环索类药物攻击的作用，可同时使多西环素，米诺环素失效。新型四环素类药物Tigecycline可抵抗酶的作用，是对抗此菌有希望的药物。2.2.4氯霉素酰基转移酶(catB)可钝化氯霉素而且氯霉索外排基因(cmll)可增强外排泵的作用，从而造成对氯霉素的耐药。鲍曼不动杆菌对氯霉素的耐药率高达92.7%。2.3喹诺酮类药物的耐药机制以DNA旋转酶A亚单位基因(gyrA)及拓扑异构酶Ⅳ的C亚单位基因(parC)发生突变为重要途径。研究表明20株对环丙沙星耐药的鲍曼不动杆菌gyrA密码子均由TCA→TTA，使氨基酸由Ser83→Leu。氟喹诺酮类药物作用于细菌的DNA回旋酶(Ⅱ型拓扑异构酶)和Ⅳ型拓扑异构酶，阻断了细菌的生长和分裂，起到杀菌作用[23]。当编码DNA回旋酶gyrA基因和编码Ⅳ型拓扑异构酶的parC基因发生突变时，细菌产生耐药。GyrA的基因突变多数发生在氨基酸密码子第67～106位，因此该区也被称为喹诺酮耐药决定区(QRDR)。国内对喹诺酮类药物的耐药机制研究大多集中在gyrA基因突变。而对parC基因突变较少报道。gyrA基因突变发生的确切顺序各家报道不一，其中gyrA的Ser83→Lcu是公认的第1个突变点。在研究中发现，所有耐药株除存在该位点突变外，还存在Ala88→Thr新突变点；在parC的测序分析中，未发现Ser80→Let突变。2.4生物被膜的药物屏蔽作用细菌生物被膜(BBF)是细菌为适应自然环境、有利于生存而特有的生命现象，系指细菌吸附于惰性物体如生物医学材料或机体黏膜表面后，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖蛋白复合物，使细菌相瓦粘连并将其自身克隆聚集缠绕其中形成的膜样物[24]。其中的藻酸盐多糖可吸附部分抗菌药物；同时，许多易于固定在BBF多糖蛋白复合物上的细菌产生的水解酶等也吸附其上而水解或钝化一部分抗菌药物，从而使渗入菌体的抗菌药物明显减少，达不到抑菌、杀菌浓度，而使药物失效[25]。另外，多糖蛋白复合物还可以延缓大多数抗菌药物的扩散[24]。有研究表明，某些抗生索可诱导BBF内细菌产生β-内酰胺酶的水平显著升高，而使细菌显示出高度的耐药性。鲍曼不动杆菌可形成生物膜，使其耐药性增强[26]。大环内酯类药物如克拉毒索、罗红霉素、地红毒素、氟红霉素、阿奇霉索等可抑制生物膜的形成，可提高喹诺酮类药物刘BBF的渗透性和对被膜下细菌的杀菌活性[27]。2.5药物作用靶位的改变和外膜蛋白的缺失已有研究表明鲍曼不动杆菌膜上的青霉素结合蛋白(PBPs)可因基因变异而改变，如PBP2的表达减低，使青霉素和头孢类药物无结合位点而难以进入菌体。对多重耐药的鲍曼不动杆菌研究发现其可有22、33、37、44、47、43kDa的外膜蛋白缺失。这类耐药机制常与其他机制共同形成多重耐药。2.6外排系统的重要作用鲍曼不动杆菌可形成药物的外排泵使进入菌体的药物浓度明显减低而失效。外排系统(acinctobacterdrugcfflux，Adc)就是由不动杆菌发现的。此菌的外排泵以AdcABC为主。其结构与耐药结节分化(resistancenodulationdivision，RND)的三联多药外排系统相似，由AdeA(ORF4)，AdeB(ORF5)，AdeC(ORF6)组成，分别位于细菌的细胞膜内、膜上和膜外。此系统可排出多种底物，有氨基糖甙类、氟喹诺酮类、四环素类、米诺霉素、氯霉素、红霉素、甲基苄胺啼啶等[28]。但对利福平、磺胺、阿莫西林、头孢他啶没有排除作用。此外，还发现有Ad-eDE系统，可使对喹诺酮类、亚胺培南、庆大霉素、奈替米星、阿米卡星等的敏感性减低。日本发现此菌的AdeM系统可能是多药及毒物外排(multidrugandtoxiccompoundextrusion，MATE)系统的成员，可使对喹诺酮类、庆大霉索、柔红霉素、阿霉素等的敏感性减低。另有发现AbxM外排系统的报道[28]。

3、耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的耐药基因CRAB主要产生多种碳青霉烯类酶[29]，PCR法扩增常见的碳青霉烯酶基因A组(blaKPC、blaSME、blaGES)、B组(blaIMP、blaVIM、blaNDM-1)、D组(blaOXA)、ESBL(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M)、AmpC(blaDHA、blaACT、blaFOX)，而其中最为多见的为OXA酶。复合体和酶中间体的形成使β-内酰胺酶重建，OXA酶与抗生素底物相互作用形成的重建性β-内酰胺对青霉素、头孢菌素、单内酰环类抗生素都有活性，阻断这些抗生素发挥作用[30]。OXA酶可分为4个族，第1族是blaOXA-23，第2族是blaOXA-24，第3族是blaOXA-51，第4族blaox-58。其中第1族和第4族是由质粒介导，而第2和第3族是由染色体介导。OXA酶中以OXA-23为我国广泛流行的耐药基因，是碳青霉烯类抗生素重要的耐药基因之一；但研究发现OXA-23型基因的酶对碳青霉烯类抗生素的水解活性较弱。OXA-51存在于大多数鲍曼不动杆菌中，具有很高的种属特异性，国外有研究表明，OXA-51基因某一个序列被插入了不同的基因序列，导致OXA-51基因水解酶被激活，使其对碳青霉烯类抗生素有特异性的水解能力，甚至可以以此作为快速检测鲍曼不动杆菌的方法之一。使用Modeller9v7对OXA-51基因结构及与其β-内酰胺酶类抗生素相互作用进行研究，发现OXA-51对头孢他啶的亲和力最高，而对亚胺培南亲和力最低。所以碳青霉烯类抗生素对OXA-51及OXA-23基因阳性的CRAB的临床疗效，目前暂未完全明确。

4、耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌临床用药的研究进展碳青霉烯类抗菌药物(Carbapcnem)可迅速渗入细菌细胞壁中，与靶位青霉素结合蛋白(penicillinbindingproteins，PBPs)特异性结合，不易分开，具有特异的稳定性，且广谱抗菌，甚至对厌氧菌及多重耐药的细菌均有良好作用。由于其部分药物可以穿透血脑屏障，且不良反应较少，然而随着这类药物在临床使用的增加，一般体外药敏试验均显示碳青霉烯类抗菌药物耐药，CRAB的大量出现使临床的使用率大大下降。临床根据《中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识》，通过增加碳青霉烯类抗生素给药次数，加大给药剂量，延长给药时间，均显示对部分CRAB感染病例有效。其原因可能是体内试验和体外试验的差异。检测结果和用药疗效通常与三者相关：患者体内因素；药物因素；感染菌的因素也是非常重要，包括不同地域的不同菌株差异、感染细菌的量、细菌的独立因素、细菌耐药基因的表达模式、以及细菌复杂的耐药机制。故体外药敏并不能等同于体内敏感或耐药，MIC和抑菌环直径只能作为提示临床选用药物因素之一，其疗效并不能保证。目前有研究表明，菌株的耐药性，与其携带的耐药基因有关，同时也说明，对抗CRAB的药物疗效与耐药基因有关系。有研究表明，CRAB的基因群OXA-51的阳性与阴性表达为临床用药的治疗提供依据，OXA-51型碳青霉烯酶水解碳青霉烯类药物的能力要弱于OXA-23型碳青霉烯酶；同时OXA-23和OXA-51均为阳性的碳青霉烯酶基因可能是我国鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物高度耐药的主要原因之一。检测基因序列对于临床联合用药具有一定的临床提示价值,考虑到鲍曼不动杆菌极易对抗菌药物耐药，故用药时应联合用药，目前针对CRAB，尚没有明确的有效的抗菌药物组合方案。而国内外普遍认为亚胺培南西司他丁与哌拉西林/舒巴坦联合用药对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌OXA-51和OXA-23基因阳性的CRAB肺部感染患者的临床疗效更显著。OXA-23基因和OXA-51基因序列的检测对临床抗生素的选择具有指导意义。

5、总结CRAB治疗难度大，可选药物有限，为了减少耐药菌株出现、提高疗效显得非常重要。选择用药的时候应根据本医院或地区的流行病学,以内体外药敏试验的差异，耐药基因型的研究，PK/PD原则优化治疗方案联合用药[30]。本文对我国碳青霉烯酶进行PCR基因扩增的主要耐药表型进行总结，观察亚胺培南联合用药治疗感染的临床疗效，综合上述研究PCR基因扩增碳青霉烯酶的耐药基因可以为联合用药提供依据，增加耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌CRAB细菌的耐药基因明确度，从而改善治疗方案，提高治愈率和细菌清除率。为更加合理有效的用药，提供一个新的参考。但是CRAB耐药机制非常复杂，本研究观察联合用药对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌OXA-51和OXA-23基因均为阳性患者的临床疗效更显著，可能与OXA-51耐碳青霉烯酶水解能力弱有关，虽然CRAB耐药机制还未完全阐述，但通过临床的疗效的观察，我们认为联合用药方式在临床治疗中具有很大的潜力，值得进一步深入研究和探索。此外，抗生素联合用药的有效率评价的重要指标之一是部分抑菌指数（FIC），体外药敏试验的相加和协同作用可以通过FIC来判断，本文因为时间人力有限并未一同纳入研究。联合用药的方式比较，本研究设想未做深入与其他统计学方法进行比较，没有大规模标本验证支持，希望在今后进一步的完善和证实。

致谢感谢我的老师，感谢他无私帮助，他关心每一位同学，在本文的方向逻辑甚至统计方案上给予各种指导和帮助，再次感谢老师的无私教诲。同时感谢我的同事们，无锡市中医医院中心实验室主任张志斌老师，给与我实验的技术和方法指导，检验科微生物室组长张立红老师在选题进展，实施过程中都给我很多意见和帮助教育我查阅资料和统计方法。最后感谢各位专家抽出时间对本文提出宝贵的意见。

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