鸡马立克病疫苗研究进展

鸡马立克病疫苗研究进展摘要：鸡马立克病（MD）是鸡的一种淋巴组织增生性疾病。该病的致病因子为马立克病病毒（MDV），属于疱疹病毒属。世界动物卫生组织（OIE）已将MD归为动物B类传染性疾病。Marek在1907首次报道MD，当时主要发生在成年鸡只，发病率和死亡率都很低。随后报道中显示该病表现出神经性症状，具有传染性。1922年，该病在美国大面积蔓延，从过去很低的死亡率上升到20％，剖检中发现内脏组织中具有淋巴肿瘤。1950年末，呈现出大面积爆发，在低日龄鸡群中最先发病，死亡率达到30％或更高，伴有神经损伤。1965年分离出区别于“基础MD株(nMDV)”的“强MD株(vMDV)”，该毒株成为60年代最严重的毒株形式。1970年随着该病疫苗使用，首次得以控制。该病是第一个能用疫苗预防的肿瘤性疾病，因此受到了医学界、兽医学界、病毒学界的广泛关注。到目前为止,还没有有效的方法来治疗MD患鸡，仍通过疫苗预防控制该病的发生，所以对MD疫苗的研究一直是国内外众多学者研究的热点。本文对马立克病的疫苗进展进行了综述。关键词：鸡马立克病毒；疫苗进展一、MDV的基本生物学特性1概述鸡马立克氏病(Marek'sdisease，MD)是由马立克氏病毒(Marek'sdiseaseVirus，MDV)引起的一种淋巴组织增生性疾病。主要特征是周围神经、内脏器官(性腺、肝、脾、肺、肾、腺胃、肠道等)、虹膜、肌肉及皮肤内发生淋巴样细胞浸润，并发展成为淋巴瘤。MDV是一种细胞结合性病毒，分为三个血清型：Ⅰ型为致瘤的MDV；Ⅱ型为不致瘤的MDV；Ⅲ型为HVT。病毒核衣壳呈六角形，85～100nm；带囊膜的病毒子直径为150～160nm，羽囊上皮细胞中的带囊膜病毒子大小为273～400nm。MDV基因组为166～184kb的线状双股DNA，是一种典型的疱疹病毒，以往归于疱疹病毒亚科，近年来通过基因组排列和基因分析，MDV-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型的基因组酶切图谱均已建立，基因组的结构排列与简单疱疹病毒相同。在长独特区和短独特区的两侧均有倒置重复序列，故将其归于致瘤的疱疹病毒亚科。2蛋白组分MDV基因组中已得到鉴定的编码特异性多肽的基因有46个，可分为3大类，即致瘤相关基因：132-bpr、meq和pp38；糖蛋白基因：gB、gC、gE、gH、gI、gK、gL、gP82以及其他基因。在这些基因中，有3个基因即132-bpr、pp38、meq被认为可能与致瘤相关。其中meq与132-bpr两个基因是MDV-Ⅰ所特有，已证实132-bpr的拷贝数与毒株的致弱程度或在细胞上传代的次数有关，pp38则被证实可抑制机体的免疫应答。meq(Marek'sEcoQ)在转化细胞中表达，编码含有339个氨基酸的蛋白质，其N末端为碱性区亮氨酸链(bZIP)结构，C端富含脯氨酸重复，具有与肿瘤蛋白fos／jun家族相似的结构。因此，被认为是一种细胞核内的致瘤基因及转录激活因子。MDVgB糖蛋白是MDV重要保护性抗原，是由3种分子量不同的糖蛋白(100ku、60ku、49ku)组成的复合物，是一种非分泌性抗原，仅存在于细胞表面和胞浆内。用部分纯化的B抗原免疫鸡后，能诱导中和抗体的产生，抵抗强毒的攻击。因而在新型基因工程疫苗研究中，不管是在痘病毒载体系统中还是在杆状病毒载体系统中，都表达了该蛋白。丁巧玲等同将糖蛋白gB在重组鸡痘病毒中进行表达。鸡痘病毒(PFV)是目前所知的最大的动物病毒，基因组长约300kb，对外源基因的容量很大。并且FPV不感染哺乳动物，因而避免重组病毒水平传播给人带来危险。3MD免疫特点MDV的致病机理是：MD的肿瘤细胞表面有T细胞标志。在鸡体内MDV对淋巴细胞是流产性(abortive)非生产性感染，可使细胞转化而发生T细胞性白血病或淋巴瘤。MDV只是在毛囊上皮细胞里呈生产性感染，产生大量的感染性病毒颗粒。这种MDV病毒注射给敏感的鸡即可诱发Marek病。MDV是细胞结合性的，其与肿瘤细胞和除毛囊细胞以外的所有器官的组织细胞结合；只有毛囊细胞方可向环境中释放成熟的感染性病毒粒子。正因为这样使得该病能够在空气中水平传播。不会或很少发生垂直传播。非致病性火鸡疱疹病毒在火鸡中普遍存在，并在空气中广泛传播。当鸡接种这种病毒后，即使后来感染MD病毒也不会发病。火鸡疱疹病毒疫苗对鸡来说是一种异源疫苗，它对鸡的保护，并不是真正的免疫，而是一种干扰现象，也就是说该疫苗能够防止发病(防治肿瘤的产生)但不能防止感染。当1日龄雏鸡在未感染强毒前接种HVT疫苗，就能诱发阻止肿瘤形成的抗体，从而阻止MD的发病与死亡。4马立克氏病发病特点水平传播是该病广为散播的原因，因此在集约化鸡场，该病流行更为严重，近年来马立克氏病病毒的毒力呈现不断增强的趋势。至今，MDV已发牛3次毒力飘变:(1)20世纪50年代由温和毒株产生强毒株；(2)70年代末由强毒株产生超强毒株;(3)90年代初由超强毒株产生超超强毒株。抗MDV免疫失败在世界各地屡有发生，在我国也存在着类似情况，并有日趋严重之势。在MDV的3个血清型中，仅有血清Ⅰ型病毒(MDV-Ⅰ)可致肿瘤，血清Ⅱ型(MDV-Ⅱ)和血清Ⅲ型(MDV-Ⅲ)均无致瘤性而被用作疫苗来防治MD。Witter等提出根据病毒的致病性或致瘤性可将MDV-Ⅰ的众多毒株分成如下4种致病型，即几乎无致病性或致瘸性的温和型(mMDV)、强毒型(vMDV)、超强毒型(wMDV)和超超强毒型(vv+MDV)。近年来世界各地越来越多的wMDV、特别是vv+MDV型毒株的出现，使得传统的主要依赖疫苗接种来控制MD的措施受到严重挑战。究其根源主要有以下几方面的因素：随着MD疫苗的广泛使用，马立克氏病病毒在鸡群的免疫选择性压力下，出现了毒力更强的vv+MDV；药物的滥用，例如有的鸡场在MD疫苗中添加抗生素，也是导致MD疫苗免疫失败的原因之一；若在接种疫苗前感染上MDV或存在天然的母源抗体，免疫效果亦会受到影响：另外，由于兽医卫生措施与防疫制度的不尽合理，造成鸡舍环境的MDV污染目趋严重。5MD的免疫逃逸机制虽然感染的鸡对MD有体液免疫和细胞免疫2种作用，但疫苗对超超强毒(vv+MDV)的保护作用仍然有限。最近研究认为，vv+MDV有它特殊的免疫逃逸机制：正常T淋巴细胞受vv+MDV攻击后大量变为癌变细胞，导致淋巴细胞数量下降，因而细胞免疫作用减弱。w+MDV还可以使抑制性免疫细胞增加，这些细胞抑制了正常免疫细胞的数量和减弱了它们的作用，同时也抑制了其他免疫效应因子的产生。vv+MDV还会降低B淋巴细胞分泌抗体的功能，减弱体液免疫的作用。从而造成了机体免疫力下降，癌变细胞迅速增殖，很快形成多发性肿瘤，致患鸡死亡。二、马立克病疫苗研究进展1常规疫苗的类型目前全世界使用的疫苗毒株有三种：第一种是人工致弱的1型MDV，如荷兰Rispens氏等的CVl988、美国Witter氏的MD11/75/R2，国内哈尔滨兽医研究所的K株(814)等；第二种是自然不致瘤的2型MDV，如美国的SB1、301B/1和国内的Z4；第三种是3型MDV(HVT)，如全世界广泛使用的FCl26。HVT与MDV有交叉免疫作用，对鸡和火鸡均不致瘤，用它免疫后能抵抗强毒MDV的致瘤作用。FCl26是已知最好的HVT疫苗毒株，其他HVT毒株的免疫效果均比不上它，因此未获实际应用。1．1血清Ⅰ型这类疫苗是用MDV通过细胞培养连续传代而致弱的,疫苗所含病毒是细胞结合性的,只有保证细胞的完整性,疫苗才具有免疫原性。最早的Ⅰ型疫苗是英国的学者Churchill等研制出的HPRS-16/att疫苗，随后荷兰学者Rispens等将中等毒力的MDV株经鸭胚成纤维细胞（DEF）传代后获得无毒株，并研制成的CVI988疫苗，广泛应用于荷兰和其他国家。“814”株是我国哈尔滨兽医研究所于20世纪80年代研制的另一种疫苗，它可用代次广，抗母源抗体，性能稳定且安全。1．2血清Ⅱ型该型系一类自然筛选的弱毒疫苗，血清Ⅱ型MDV都是天然非致病性的，广泛分布于鸡群中，这种疫苗毒可通过接触传播，感染后第5周产生很强的免疫力。1988年江苏农学院的黄仕霞等分离出的Ⅱ型Z4弱毒株是国内惟一的Ⅱ型MD疫苗株。这一血清型具有代表性的是SB-1株，制成细胞结合性疫苗，单独使用就能产生广泛的保护力，但对超强毒株抵抗力不太强，可与HVT疫苗合用，充分抵抗超强毒株。1．3血清Ⅲ型此类疫苗是火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗,其代表毒株Fc-126是由美国学者WritterRL博士从火鸡群中分离出来的一株无毒力品系，对鸡和火鸡均不致病,在鸡群内不传播；接种这种疫苗的鸡体，细胞中的HVT能使机体产生抗体,但不能中和MDV。该疫苗具有干扰作用，它先于MDV侵入鸡体细胞,能诱发阻止肿瘤形成的抗体，防止肿瘤的形成和发展。这种疫苗广泛应用，可有效抵抗强毒。既有细胞结合性活疫苗，又有易于储存、运输的冻干苗，目前正在使用的疫苗有：HVTFc-126和PB-THV1C4。1．4二价和三价（多价）苗自20世纪80年代开始，由于MDV毒力出现了超强毒，世界某些地区单价苗免疫失败屡屡发生，因此有些学者提出多价苗战略，先后研制出二价苗和三价苗。在美国主要使用Ⅱ型和Ⅲ型组成的疫苗，即SB-1或301B/12+HVTFc-126，西欧则使用Ⅰ型和Ⅲ型组成的疫苗CVI988+HVTFc-126；我国使用的二价苗有814+HVTFc-126、SB-1+HVTFc-126及Z4+HVTFc-126。目前，我国使用的三价苗主要由814+SB-1+HVTFc-126组成。这些疫苗的使用虽能阻止发病，但并不能介导淋巴节萎缩，也不能阻止强毒的感染、复制和排毒；存在免疫间期；不能对所有的强毒株提供完全的保护；三价疫苗虽然比相应的双价疫苗保护率高，但由于生产成本高、工艺复杂，所以实际上并未获推广应用；利用几种血清型病毒协同保护作用，使MD造成的损失得以降低，但多价苗只能用液氮保存和运输，成本很高。2新型疫苗为了解决现行MD疫苗存在的许多问题，人们希望通过分子生物学、遗传工程方法获得新的、更有效的疫苗。近年来，提出了疫苗的三个发展思路：1、通过基因缺失致弱肿瘤MDV株；2、用活病毒载体表达在免疫上重要的MDV基因；3、核酸疫苗。2．1基因缺失苗MDV某些基因的缺失，可使病毒的毒力降低，利用基因工程手段（插入、突变或缺失）失活强毒株的致病性基因使病毒致弱研制基因工程缺失疫苗。这些致病性基因与早期溶细胞感染或肿瘤形成有关，而它们的失活与缺失并不会影响病毒的复制与增殖。其中缺失Meq基因的毒株是最有前景的，最新的研究也表明：在用超强毒和特超强毒攻击后，Meq基因缺失株能提供比CVI988更好的保护，这也是目前报道的保护效果最好的MDV候选疫苗株。虽然某些基因缺失可使病毒的毒力降低，但并不能使MDV致瘤性完全丧失，而且基因缺失的同时使病毒在细胞内复制的能力下降，甚至达不到目前常规疫苗的保护水平，所以这种疫苗作为商品化应用，还要做进一步研究。基因缺失疫苗的研究和开发从理论上讲是很有发展前途的。但在MDV由于缺乏认识哪一个基因与毒力或致瘤性有关以及技术上的困难阻止了它的发展。2．2基因重组活载体疫苗目前，从国内外的研究资料来看，利用基因重组工程研制MD疫苗成为一个热点并取得一些重要进展。1992年，Nazerian等用禽痘病毒(fowlpoxVirus，FPV)为载体构建了能表达MDVgB基因的重组体FPV—gB。将重组体FPV—gB接种至SPF鸡群可使之获得抗强毒株的攻击，但对有母源抗体的商品鸡保护力低。另外，利用杆状病毒或HVT做载体获取新型的MDV疫苗也是一个研究热点，并可能为抵抗更强的MDV毒株提供新的研究方向。2．3核酸疫苗核酸疫苗也是将来MDV疫苗研制的一个重要方向。研究的原理是将编码免疫原的基因插入合适的真核表达质粒中，质粒在细菌中复制，提取并纯化质粒后，再采用一定方法给动物接种。当质粒在宿主细胞中表达，表达产物可激发机体产生免疫应答。李建伟等将含MDVgB基因的PIJcl9质粒直接注射1日龄的鸡体中，80％的鸡能抵抗强毒的攻击。TischerBK等将血清I型MDV克隆到BAC20(细菌人工染色体)上免疫鸡，发现DNA疫苗可以对鸡产生保护作用，但其免疫保护力并不比传统的疫苗高。核酸疫苗存在整合到宿主基因组引起宿主原癌基因活化和肿瘤抑制基因失活的危险，也存在刺激产生抗DNA

抗体和持续表达外源基因可产生的不良后果，同时肌肉注射产生免疫力需要大量抗原或使用基因枪，成本很高，因此对家禽疾病控制来说，核酸疫苗的应用还需要进一步研究。总结作为养禽业一种重要疾病，MD持久的威胁始终是预防兽医学的一个研究焦点。在长达50年的MD疫苗研究应用中，取得了诸多成功，MD疫苗作为第一个应用于抗肿瘤方面的疫苗，不仅有力地控制了疫病的发生，降低养禽业的损失，而且推动了胚胎免疫技术的发展。但是在这个过程中，我们必须意识到简单的依靠疫苗控制疾病的发展，而未曾从根本上阻止病毒的感染和传播，只能是一个暂时的解决方法，尤其疫苗的使用推动了病原毒力的不断增强，更增加了疫苗研制的难度。因此在研发疫苗的进展中，我们必须要重视病毒毒力的进化态势，通过采取更多有效手段，阻止病毒增强，正确把握疫苗的有限功效。

参考文献高巍，秦爱建，金文杰等，中国预防兽医学报，扬州大学兽医学院，2010,32(12)CuiX;LeeLF;ReedWMMarek'sdiseasevirusencodedvIL8geneisinvolvedinearlycytolyticinfectionbutdispensableforestablishmentoflatency，2004(09)张立杰，马力，杨飞鸽.鸡马立克氏病疫苗研究进展及病毒毒力进化态势，北京市兽医生物药品厂，2009（6）.刘爱玲，刘长军，张艳萍等.鸡马立克病毒流行强毒株的致