植物组织培养实验课件

植物组织培养陈勇一、实验室设计、基本设备及操作技术二、培养基的成分及作用三、培养基的制备概念：本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项技术。即应用无菌操作方法，培养植物的一个离体器官、组织或细胞。这项技术已在快速繁殖、去除病毒、加速育种进程、次生代谢产物生产和种质资源的保存等方面取得了巨大的经济效益、社会效益及生态效益。根芽形成的激素控制理论：细胞分裂素与生长素的比例与绝对含量，调控着植物组织的形态发生及细胞分化，当比值高时产生芽，低时产生根，比值适中时可能维持原组织生长而不分化。植物组织培养的优点1.研究材料来源单一，无性系遗传背景一致2.经济方便效率高3.条件可控误差小4.生长快周期短重复性强5.周年试验或生产（一）实验室设计与要求房屋可划分为准备室、培养室、无菌操作室等。1.准备室20m2左右：完成器皿洗涤、培养基配制、分装、包扎、高压灭菌等环节。主要设备及用具：电冰箱、高压灭菌锅、电炉或煤气炉、不锈钢锅、水槽、大型工作台、玻璃橱、干燥箱、蒸馏水发生器或无离子发生器、酸度计或PH计、托盘天平、电子天平或工业天平、培养器皿、下口杯、试剂瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、洗瓶、手套、塑料篮等。2.无菌操作室（接种室）是进行无菌工作的场所，如材料的消毒接种、无菌材料的继代。是植物组织培养研究或生产工作中的最关键的部分。主要设备是超净工作台：其优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，预备时间短，开机10分钟以上即可操作。无菌室需安装紫外灭菌灯，定期用70%酒精或其他灭菌手段消毒。无菌室内还需有小搁架、医用小平车、无菌操作用器具、小白瓷圆碟、适当大小的烧杯或广口瓶、常备的消毒灭菌药、毛刷、无菌水等。…3.培养室尽量安排在楼层较高处，以利采光、减少尘埃和杂菌污染的机会；还应清洁、干燥、保温隔热、尽量利用自然光照等措施。主要设备与用具：培养架与灯光、配电板、时控器、空调机、控温仪、温度湿度计、温度自动记录仪、最高最低温度计等仪器。（二）操作技术1.洗涤培养过程中最经常最大量的工作之一，是洗涤培养瓶及其它常用器皿。最常用的洗涤助剂就是家庭用的洗衣粉及肥皂。2.灭菌有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体，至少它的表面，毫无例外都是有菌的。无菌的范畴：经过高温灼烧或蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学灭菌方法处理过后的物体，是无菌的。常用的灭菌方法可分为物理方法和化学方法两大类。（1）培养基的灭菌：常规方法是放入高压灭菌锅内加热加压灭菌。一般少量的液体只要121℃即每平方厘米1.1kg的压力20分钟就能达到彻底灭菌。灭菌的功效主要是靠温度，而不是压力。高压灭菌锅的使用可选用以下任一种：A.打开放气阀，煮沸15分钟后再关闭；B打开放气阀煮沸至大量热蒸汽喷出再关闭；C先关闭放气阀，待压力上升到0.5kg/cm2以上时，打开放气阀放出空气，再关闭。（2）不耐热的物质将采用过滤灭菌如赤霉素、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素等。过滤灭菌的原理：溶液通过滤膜后，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。（3）玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌即利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀灭微生物。（4）用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌（5）布制品采用高压灭菌（6）其它（7）植物材料的表面灭菌接种：把处理好的材料经无菌操作手续放置到培养基上。外植体：即接种的植物材料。材料处理的第一步：刷洗、冲洗。第二步：用洗衣粉水或肥皂水浸洗并搅动。第三步：超净台内材料的表面灭菌灭菌剂使用浓度（%）持续时间（分钟）去除的难易效果次氯酸钙次氯酸钠过氧化氢（双氧水）溴水硝酸银氯化汞（升汞）抗菌素9-10210-121-210.1–14-50ppm5-305-305-152-105-302-1530-60易易最易易较难较难中很好很好好很好好最好较好要根据植物材料对灭菌剂的敏感性来选用不同的药剂，确定适宜的处理时间和水洗的次数。次氯酸钙、次氯酸钠——氯气过氧化氢——原子态氧升汞灭菌效果最好，去除较难，需无菌水刷洗8-10次。95%酒精——灼烧表面不同植物、部位、组织年龄及环境状况——灭菌时间不同3无菌操作无菌操作程序：（1）灭菌（2）刷洗（3）切割（4）接种二、培养基的成分及作用

完善的培养基配方：包括大量元素、微量元素、铁盐溶液、碳源、有机附加成分、植物激素、琼脂等。配置中注意8个字：大、微、铁、有、糖、琼、激、PH。（一）大量元素植物所需元素，浓度大于0.5mmol/l的应属于大量元素，而小于0.5mmol/l的则属于微量元素。植物必需的元素在体内的生理作用有四方面（P49）。MS培养基的特点：含有很高量的氮、钾，尤其硝酸盐的用量很大，还含有一定数量的铵盐。（二）微量元素植物所需的微量元素至少包括铁、硼、锰、锌、钼、铜、钴和氯。微量元素的生理作用主要在酶的催化功能和细胞分化、维持细胞的完整机能等方面。（三）铁盐现在培养基中几乎都采用Fe·EDTA形态的铁盐。铁促进细胞分裂与伸长，还影响到叶绿体的结构组成与叶绿素形成。（四）有机成分植物组织需要的一些维生素、氨基酸、肌醇，统称为有机附加成分。维生素有维生素B1（硫胺素）、维生素B6（吡哆醇）、维生素B3或维生素PP（烟酸）、维生素B5（泛酸钙）等氨基酸中最常用的是甘氨酸。（五）糖作用：碳源、碳骨架、提供底物与能源、维持一定的渗透势。常用的碳源是蔗糖，浓度为2—5%。（六）琼脂琼脂是最好的固化剂，本身并不提供任何营养。用量一般在4-10g/l之间。（七）植物激素植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许许多多的生理生化活动。常用种类有：1.生长素类：生理作用（P61），主要有吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4-D等。脱分化：使已分化了的停止分裂的细胞失去分化特性，回复到未分化的幼龄状态，恢复细胞分裂的能力。分化阶段：使脱分化形成的处于幼龄状态的细胞团或组织，再产生根、芽、胚状体等有高层次组织结构的特化细胞。2细胞分裂素生理作用：（P63）种类有苄基腺嘌呤（6-BA）、糠基腺嘌（激动素）等。3赤霉素（GA）生理作用：（P67）4脱落酸（ABA）生理作用：（P68）5乙烯生理作用：（P69）（八）PH值PH值即酸碱度培养的植物材料大多数要求弱酸性的环境，一般用1N的KOH或NaOH调整到PH5.6-5.8的范围内。（九）其它成分较常见的有活性炭、抗生素、抗氧化剂、诱变剂、生长抑制剂、促进细胞分裂和胚状体同步发生的药剂等。三、培养基的制备（一）储备液的配置与保存将配方中的药品一次称量供一段时间使用，即配一些浓溶液，用时稀释，这种浓溶液就是储备液或母液。一般大量元素比使用液浓度高10-100倍，微量元素等可高200-1000倍。表4-1MS培养基储备液的配制成分用量（mg/l)每升培养基取用量（ml）储备液1（大量元素）NH4NO3KNO3CaCl2.2H2OMgSO4.7H2OKH2PO4330003800088007400340050储备液2（微量元素）KIH3BO3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O16612404460172050555储备液3（铁盐）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O550074605储备液4（有机成分）肌醇烟酸盐酸吡哆醇盐酸硫胺素甘氨酸20000100100204005（二）培养基的配制1.先在洁净的不锈钢量杯里放入约750ml蒸馏水，加入所需要的琼脂和糖。2.加入各种母液，按需要加入植物激素2.4-D1mg/l。3.加蒸馏水将最终体积调整到1l。4.充分混合好以后，用1NKOH（或NaOH)调整PH值到5.8左右。5.趁热将培养基倒入三角烧瓶中。6.加盖牛皮纸。7.高压灭菌后取出。配置1升培养基分工：称重：1琼脂8克；2蔗糖30克；3肌醇100毫克。母液：大量元素100ml、微量元素10ml、有机物质10ml、铁盐10ml、生长素2.4-D10ml配置75%酒精500ml裁牛皮纸准备：培养皿1副/人；解剖刀柄2把；镊子（大、小）各两把；三角烧瓶50ml