兽用生物制品技术课件

兽用生物制品技术主讲教师：任平教授1项目七诊断制品制造技术任务1血清学诊断抗原任务2变态反应抗原任务3标记抗体任务4单克隆抗体的制备2任务1血清学诊断抗原抗原凝集反应抗原沉淀反应抗原直接凝集反应间接凝集反应3实例1直接凝集反应抗原鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集抗原制造工序

菌种选育菌种是从多株鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌中筛选出的标准菌株（抗原结构9、121、123）和变异菌株（抗原结构9、121、122）各一株。要求：标准型菌株对沙门氏菌因子血清O9、O123凝集，对O122不凝集或轻度凝集；变异型菌株对沙门氏菌因子血清O9、O122凝集，对O123不凝集。4制造要点

工序1菌液培养接种于硫代硫酸钠甘油琼脂扁瓶基，大量培养

工序2灭活0.3%甲醛溶液工序3计数测定菌液浓度（3亿个/ml）。

工序4标化将两菌株稀释为不同浓度的菌液，分别与标准型和变异型的国际标准血清做平板凝集试验，标化后配制抗原的菌液合适浓度。

工序5染色将结晶紫乙醇溶液、甘油按适当比例加入菌液中，充分混匀，即制成鸡白痢鸡伤寒多价平板凝集抗原，分装小瓶。5实例2间接凝集抗原以红细胞致敏为例，简介间接凝集抗原的制造方法。

工序一、4%绵羊红细胞的制备：采集绵羊的血液与等量的阿氏液混合，用pH7.2～7.4PBS液洗涤血细胞3次（每次3000r/min离心5min），每次离心后弃去上清液和白细胞，最后用PBS液配成4%的红细胞悬液。工序二、2%鞣化红细胞悬液的制备：取5ml4%红细胞悬液与等量1:25000鞣酸PBS液合并，温和混匀，室温静置30min，用PBS液洗涤3次（每次2000r/min离心5min），然后用PBS液配成2%的鞣化红细胞悬液。7工序三、4%致敏红细胞的制备：取5ml鞣化红细胞与等量适当稀释的抗原液在50℃水浴中孵育5min或4℃过夜，加入5ml1:100稀释的健康兔血清或含0.25%的牛血清白蛋白的PBS液，离心洗涤3～4次，用同一溶液配成4%致敏红细胞悬液。最后测定致敏红细胞的凝集价：取标准阳性血清，用平板法或试管法进行方阵滴定，以测定致敏红细胞的效价。能与最高稀释度的血清产生50%凝集的致敏红细胞的最高稀释倍数即为致敏红细胞凝集价，即最适使用浓度。8沉淀抗原

沉淀抗原的一般制备程序为：对病原进行人工培养或采集自然发病动物的组织，用适当方法破碎细胞以制成病原体的可溶性抗原，经过灭活、浓缩，即得到沉淀反应抗原。9实例介绍（沉淀抗原的制备方法）

鸡传染性法氏囊病APG抗原的制作取传染性法氏囊病鸡的法氏囊组织，加入适量灭菌PBS液或生理盐水制成匀浆，经反复冻融或超声波裂解，于4℃浸泡24h后3500～4000r/min离心30min，收集上清液；沉淀物加入适当PBS液悬浮、浸泡后，再经10000r/min离心60min，收集上清液；两次上清液合并，加入终浓度为0.1%～0.4%的甲醛溶液，37℃作用20h，即成鸡传染性法氏囊病APG抗原。将此抗原与标准阳性血清做APG试验，24h后出现1～3条沉淀线为合格。保存于-20℃。10任务2变态反应抗原现以牛型提纯结核菌素为例，简介其制造方法。11工序1．菌种牛型提纯结核菌素的菌种为牛结核杆菌C68001株和C68002株。工序2．制造要点将上述菌种接种于不含蛋白质的苏通合成培养基液面上，置37℃培养2～3个月，获得培养物。培养物经121℃30min灭菌后，用数层纱布过滤除去菌膜，再用滤器过滤除菌，取滤液加入40%三氯醋酸溶液使其终浓度为4%，4℃静置过夜，弃上清液，将沉淀物用1%三氯醋酸水溶液重新悬浮沉淀，静置，弃上清液，重复3次，最后将沉淀物以5000r/min离心15～30min，弃上清液。将沉淀物先加少量1mol/L氢氧化钠溶液溶解，然后用pH7.4的PBS液稀释，最后将pH调至7.4，用灭菌滤器过滤除菌，滤液即为牛型提纯结核菌素原液。12工序3．检验与保存

组批混合，进行无菌检验、蛋白测定和效价测定，用加防腐剂的pH7.4的PBS液将牛型提纯结核菌素原液稀释为10万IU/ml，定量分装，迅速冷冻真空干燥。成品按《中华人民共和国兽药典》（2005版）进行无菌检验、安全检验、效价测定、特异性检验、剩余水分测定及真空度测定等。检验合格的产品于2～8℃保存，有效期为10年。13任务3标记抗体子任务1荧光素标记抗体子任务2酶标记抗体14子任务1荧光素标记抗体荧光抗体是将荧光物质标记在抗体上，然后与相应的抗原结合，借荧光显微镜观察抗原抗体复合物中特异性荧光的存在，从而判断抗原的存在、位置、分布和含量。免疫荧光技术是将抗原抗体结合的特异性、荧光检测的高敏感性以及显微镜的精确性三者结合的一种检测技术。现已广泛用于细菌、病毒、原虫的鉴定和传染病的快速诊断。15原理荧光素是能够产生明显荧光、并能作为染料使用的有机化合物。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RB200）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC），其中FITC应用最广。FITC分子中含有异硫氰基，在碱性（pH9.0～9.5）条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。用于标记的IgG通常用亲和层析法从抗血清中提纯，并具有特异性强和纯度高的特点。16实例介绍现以FITC为例，其标记程序是：将提纯的IgG用pH7.2PBS稀释成浓度为10～20mg/ml的溶液，按蛋白含量的1/80～1/100加入FITC，先用pH9.50.5mol/L碳酸盐缓冲液溶解FITC，于5min内滴加到IgG溶液中，最后补加碳酸盐缓冲液，使其总量为IgG溶液的1/10。在4℃条件下搅拌12～15h（20～25℃1～2h）；用大量PBS透析4h，用SephadexG-50凝胶滤除标记抗体中的游离荧光素，通过DEAE纤维素层析除去过高标记和未标记的蛋白分子；最后测定标记抗体的效价和特异性，分装保存。17子任务2酶标记抗体技术

酶标记抗体是用一定方法使抗体与酶共价结合，利用抗体与抗原反应的特异性和酶催化反应的高敏感性，通过酶专一性底物的显色反应来显示样品中抗原的存在与否，从而对疾病做出诊断。18用于抗体标记的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以辣根过氧化物酶应用最广。HRP作用的底物是过氧化氢，催化时需要供氢体，供氢体在HRP催化过氧化氢生成水的过程中提供氢，而后自己生成有色产物，因此供氢体亦为显色剂。常用的显色剂有邻苯二胺（OPD）和3,3＇-二氨基联苯胺（DAB），前者用于酶联免疫吸附试验，后者用于免疫酶组织化学染色法、斑点-酶联免疫吸附试验和免疫转印等试验。19抗体的酶标记常用方法有戊二醛一步法、戊二醛二步法和过碘酸钠氧化法三种。过碘酸钠氧化法标记率较高，但穿透细胞的能力较弱，主要用于ELISA试验。其原理是：先用2,4-二硝基氟苯（FDNB）封闭酶蛋白上残存的α-氨基和ε-氨基，以避免酶的自身交联；然后用过碘酸钠（NaIO4）将HRP表面的多糖链氧化为醛基，用硼氢化钠（NaBH4）中和多余的过碘酸。酶分子上的醛基很活泼，可与蛋白质的氨基结合。20过碘酸钠氧化法标记步骤①取5mgHRP溶于1.0ml新配制的0.3mol/LpH8.2的NaHCO3溶液中。②滴加0.1ml1%2,4-二硝基氟苯无水乙醇溶液，室温避光轻搅1h。③加入1.0ml0.06mol/L过碘酸钠水溶液，室温轻搅30min。④加入1ml0.16mol/L乙二醇，室温避光轻搅，装入透析袋中。⑤于1000mlpH9.50.01mol/L的碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，其间换液3次。⑥吸出透析袋中液体，加入含5mgIgG的pH9.50.01mol/L碳酸盐缓冲液1ml，室温避光轻搅2～3h。

21⑦加硼氢化钠5mg，置4℃3h或过夜。⑧逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液，置4℃1h，4000r/min离心15min，弃上清。再用50%饱和硫酸铵沉淀2次。⑨沉淀物溶于少量pH7.40.01mol/LPBS，装入透析袋，以同样PBS充分透析至无铵离子，10000r/min离心30min，上清液即为酶标抗体。酶标抗体可用SephadexG-200过滤除去未标记的抗体。⑩用751型分光光度计测定酶标抗体OD值，按公式计算酶含量、抗体含量、HRP/IgGmol比和酶结合率。22酶含量：HRP（mg/ml）=OD403nm×0.4IgG含量：IgG（mg/ml）=（OD280nm－OD403nm×0.34）×0.6HRP和IgG摩尔比：HRP/IgGmol=HRP含量：IgG含量×4酶结合率：HRP结合率=酶标抗体中酶总量：标记时加入的HRP量酶标抗体中的酶量达500μg/ml以上时，效果较好，如达1000μg/ml，则效果最为理想。HRP/IgGmol再1.0以上较好，2.0时效果最好。酶结合率在9%～10%时较好，能达30%最好。以上述方法制备的酶标抗体可加纯甘油（终浓度为33%），置4℃保存，保存期达半年至1年，活性不变。如酶标抗体经SephadexG-200洗脱，则应小量分装，置-20℃保存，尽量避免反复冻融。23任务4单克隆抗体的制备

工序1．B细胞的制备用提纯抗原免疫BALB/c健康小鼠，一般免疫2～3次，间隔2～4周，最后一次免疫后3～4d，取小鼠脾脏，制成108个/ml的脾细胞悬液，即为亲本的B细胞。工序2．骨髓瘤细胞的制备用与免疫同源的小鼠骨髓瘤细胞，在含有10%新生犊牛血清的DMEM培养基中培养，至对数生长期，细胞数达105～106个/ml，即可用于细胞融合。工序3．饲养细胞的准备常用的饲养细胞有小鼠胸腺细胞、小鼠腹腔巨噬细胞。饲养细胞一方面可减少培养板对杂交瘤细胞的毒性，另一方面巨噬细胞也能清除一部分死亡的细胞。在融合前，将饲养细胞制成所需浓度，加入培养板孔中。24工序4．选择培养基常用HAT选择培养基，H为次黄嘌呤，T为胸腺嘧啶核苷，A是氨基嘌呤，在DMEM培养基中加入H、A、T3种成分即制成HAT选择培养基。在该培养基中，只有融合的骨髓瘤细胞才能生长。工序5．细胞融合将脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例混合，离心后吸尽上清液，然后缓缓加入融合剂，静置90s，逐渐将HAT培养基分别加入有饲养细胞的96孔培养板中，置5%～10%二氧化碳培养箱中培养。5d更换一半HAT培养基，再5d后改用HT培养基，再经5d用完全DMEM培养基。25工序6．检测抗体杂交瘤细胞培养后，应用敏感的血清学方法检测各孔中的抗体，通过检测筛选出抗体阳性孔。图5-1单克隆抗体制备流程（引自于善谦）工序7．杂交瘤细胞的克隆化对于