寻找更佳的蛋白质工程策略

寻找更佳的蛋白质工程策略RomasJKazlauskas&UweTBornscheuer摘要:如今的蛋白质改进策略涉及多种不同的随机诱变与筛选方法与合理设计的结合。为了取得进一步的进展，即让后续的蛋白质工程问题更易于解决，蛋白质工程师们必须以钻研的眼光来比对这些策略并将其中效率较低的剔除。蛋白质工程描述了改变现存蛋白质的结构使其性能改善的过程。这是一项重要的增进我们对蛋白质如何活动及其进化史基本认识的技术，也是提高酶在制药，绿色化学和生物燃料应用方面性能的关键方法。蛋白质工程已经早就很多工业上的成果。由Genencor（来自美国加利福尼亚州南旧金山）设计的蛋白酶可以耐受洗衣粉中的漂白剂并帮助我们清洗衣物。Codexis（来自美国加利福尼亚州红木市）因为合成作为医药中间体的酶的工程而获得了2006年的绿色化学奖。Verenium（来自美国马萨诸塞州剑桥）设计了能帮助原油采收和纤维素乙醇制造的酶。Metabolix（来自美国马萨诸塞州剑桥）开发了多元酯类的生物合成酶。在蛋白质工程的进程中，有几点必须预先计划进策略。即找寻某一能带来益处的个体或选择一个特定的策略来解决某一非常清楚的特定问题。然而，总体格局也许不那么简单。现今的蛋白质工程策略之间大相径庭并且其依靠的设想时有矛盾。采取不同策略的部分原因仅仅是为了绕开蛋白质工程专利，不过很大一部分归结于方法之间比较研究的缺失。做这样一个比较能够促进未来的蛋白质工程发展，就像人们能够从成功与失败中汲取教训一样。两代以前，有机合成中面临着类似的问题。通过鉴赏分子结构与构象分析以及利用定量的方法来研究反应，在有机化学中可以合成复杂的分子。不过有机合成并不系统，在对待综合问题上也没有一个总体策略。这些问题以合成天然产物为目标。此类目标所引入的精确性在于需要获得的不仅仅是任何复杂分子，更是那些可以在自然中发现的化合物。这些合成方面的努力和相关方法的发展使我们对有机合成原理产生了有系统，有组织的理解。例如，Woodward和Eschenmoser的维生素B12合成给出了新的合成策略组合，关于生源论的假设以及轨道对称守恒原理。这些思路的发展使得后续复杂的合成变得更加简单而有效。在这篇评论中，我们的意见是——是时候从总体上思考蛋白质工程了。同时，我们提出两项建议来推动此领域的发展。作者信息：RomasJ.Kazlauskas供职于美利坚合众国，明尼苏达州圣保罗市，明尼苏达大学生物技术研究所，生物化学，分子生物学和生物物理学系；UweT.Bornscheuer供职于德意志联邦共和国格赖夫斯瓦尔德市，格赖夫斯瓦尔德大学，生物化学研究所生物技术与酶催化系电子邮件地址rjk@或uwe.bornscheuer@uni-greifswald.de

图一蛋白质工程方法随酶改变程度不同与合理设计可用之信息量的多寡而大相径庭。图中的ProSAR为蛋白质构效关系，3D指三维，QM\MM分别指量子力学和分子力学。始为域互换同源重组含的变®量改增翊或:成少环薮同时多个或

连续时替换增减氨基酸同谱化铛配PCR技术氨基酸序列同源模型机理及动力学结合过渡态类似过渡态的QMWIM物的3D结构模型（包括动态）所需的信息量A含的变®量改增翊或:成少环薮同时多个或

连续时替换增减氨基酸同谱化现今的策略蛋白质工程包含三步：选择蛋白质的变化方式（即设计策略，如合理设计还是随机化），实现这些变化（突变形成），并评估这些变异蛋白的改进性能（过筛并挑选）。在其中的每一步，选择不同的策略能导致不同的优缺点。例如，存在着一个折衷的方案决定致力于合理设计还是筛选。极端情况下，对一已透彻了解的酶，始于X射线晶体结构的合理设计能促进对某些氨基酸替换的限制性筛选。通过使底物结合部位的按需放缩，此法已提升了磷酸三酯酶的对映选择性。在另一极端，强有力的筛选方法可以完全排除合理设计的步骤。通过选择，已经从一个完全随机，但数量巨大（多达1013个变体）的库中鉴定出具有RNA连接酶活性的蛋白变体。下文中，我们重点关注如今使用的一些主要考虑对象与策略。（另见专栏1）选择最佳的氨基酸替换位点创建变异蛋白通常包含单个氨基酸的取代，同样也包括插入额外氨基酸，删除氨基酸以及改变末端位置（环状排列）。这些变化可以针对整个蛋白或是最有希望产生改进的部位。

一个常见的蛋白质工程目标是提高酶的热稳定性。基于结构的方法有一个基本假设就是：更为刚性的酶在高温下具有更好的稳定性。酶的X射线品体结构被用来设计特定的使酶稳定的作用结构诸如二硫键或盐桥，通过引进脯氨酸和去除甘氨酸来稳定环状区域或通过B一因子实验确定目标蛋白的最具可塑性区域并在此集中诱发突变。基于进化与生物信息学的方法的基本假设是：保守的氨基酸最有助于稳定。设计策略是对相关序列进行比较并调节目标蛋白至相似的共有序列。（每个位点上出现频率最高的氨基酸）专栏1成功的蛋白质工程所需方法与畛摘要最隹方法的14择®［决于诸如信息强度（三堆给构已知）,诱变方法，舞查与14择工具的范围.蛋白麋工程师们用了许多不同策庵来馥进，其中起码大部分最终能产出改良产物"变化位置结构类型的变化•整个蛋白•替换（最常见）:•选定区域■•剔除或插入皆活性部位,环映排列在可塑部位,同源重组基于结构建模确定的位点舜选方法基于序列比对确定的位点•选择培养（最大犀）诱变方莎•昌通量筛选•直先稳定蛋白质？-.,底物类似而或真实底物•单一替换•真实反应条件或简化之筛选条件错配PCR饱和诱变限制性氨基酸替换基因漂变库•彻底筛查或基于库的部分筛查•多重替换通过基因合成添加特殊变化氨基酸替换的逐步累积取多部位同时诱变几部也同时诱变并重复数次选择如何引入氨基酸替换一旦变换的位置确定，研究者们将选择如何引入单一替换，抑或更可能的多重替换。对单一替换来说，研究者们可以利用位点饱和诱变或是错配PCR技术。位点饱和诱变将使选定位置替换成所有十九个可能的氨基酸。而错配PCR倾向于替换平均数仅为六个的可能氨基酸。许多突变需要更换密码子中的两个核苷酸，不太可能使用错配PCR。其基本假设是，要么只有几个解决方案存在（在这种情况下应该选择一个更完整的库），或者存在许多解决方案（在这种情况下，应该选择一个不完整的，但更易于制造的库）。举例，Carretal利用细菌的突变株（类似于错配PCR）来寻找具有更高对映选择性的胺氧化酶变体。另一例，DeSantis和同事利用位点饱和诱变来寻找对阿托伐他汀（立普妥＜降血脂药〉）的合成中间体有着更高对映选择性的腈水解酶的变体。变体包含一个A190H替代，这需要两个密码子碱基变化一一从丙氨酸的GCN密码子变为组氨酸的CA[T/C]密码子——将可能无法使用错配PCR技术。氨基酸的多重替换引入了额外的选择。阶梯式的逐步替换将错过任何协助互动，同时能创建一个其中大部分变体不活跃的呈幕级增大的库。Arnold和同事们偏爱单一氨基酸替换的阶梯式累积，因为这和自然演化机制更相像。每一步鉴定出的变体都比前一个更好一些。这种方法假设在每阶段都至少有一条通路去改进。对5个位点的氨基酸替换，有120条可能的路径。Weinreich和同事们尝试了所有120条路径来寻找一种改进型的P-内酰胺酶，然后发现在每个阶段仅有18条路径改善了对P-内酰胺的抗性。同样的，在每一步仅有8条路径增加了一种环氧化物水解酶的对映选择性（如果包含一个中性突变的化将有55条路径）。这些测试中得出的悲观结论是：在每一步选择最好的单一突变的结果是很有可能走入死胡同。乐观结论是：有相当多的路径通往某个特殊变体，所以在每阶段选择几个突变，我们将得到最好的五个替换氨基酸。使几个位点同时突变的理由是为了避免走入死胡同和寻找协同效应，并非在于更高的筛选成本。例如，Whittle和Shanklin在去饱和酶的活性部位的六个位点同时替换（理论上可能变种数达108）。为了筛查如此大数目的变种，他们使用了只有那些底物特异性发生改变了的变种才能生长的基质。临近氨基酸间协同作用更易于产生，因此联合活性部位饱和测试（CASTing）是条捷径。它选择在线性序列上相近的两个氨基酸，只需一个诱变引物。这种同时突变法将环氧化物酶的对映选择性从4.6增加到了115,而使用错配PCR的单一突变法仅仅将其增加到了7.4。这两种方法均需筛选达20000种的变种。另一个处理同时突变的途径是通过消除重复的密码子来降低库的大小。大多数饱和突变使用NNK（N指A、T、G或C，K指G或T）的密码子，这将产生32种可能的密码子编码20种氨基酸，其中12个密码子是重复的。当三个氨基酸同时突变，按NNK的排布可以列出32768个密码子，不过仅有8000个不同的蛋白质。其中一种可能是NDT序列（D代表G，A或T），将生成编码12个不同氨基酸的12个密码子。三点同时突变能列出1728种可能的蛋白质类型或者说变异密码子。这种方法消除了重复，但省略了八种可替换用氨基酸。从每个库中筛选同一个环氧化物水解酶的转化体5000个（NNK库的不完全筛选，NDT库的完全筛选），发现在每个库中都具有对映选择性＞100的变体。另一种降低库的大小的途径是剔除折叠或不稳定的蛋白质。做此类排除的一个策略是模仿第二个主要的生物进化机制：遗传漂变。遗传漂变指的是维持正常的前提下随机变化的积累。中性突变库是保持原有功能的变种集合。Arnold和Tawfik两组均为P450单加氧酶系和对氧磷酶系创建了此库。通过筛选这些更小的库，他们发现了诸如底物范围扩大或活性轻微增加的新性能。此方法依托的假设是：多重替换的大多数变种是不稳定的。通过筛选这些维持了原有功能的蛋白质，可以确保它们仍然正确折叠。第三种处理这些多重替换带来的数目极大的变种的方法是一种叫做ProSAR的统计方法，即蛋白质构效关系。这种方法与生物进化间没有对应，它并不直接发现“击球点”，而是找到氨基酸替换对功能改进的贡献。蛋白质变体平均包含十个替换点，而许多变体具相同的替换点。即使某个特定变异性能差，与其他具有相同替换的变种的统计对比会显示出此突变有益与否。在下一轮过程中结合有益突变，除去有害突变并进行更多的替换测试。这种方法特别适用于快速引入数个替换点。运用这种方法，Codexis小组设计了一种用来合成阿托伐他汀侧链的卤代醇脱卤素酶，他们替换了35个氨基酸，使酶拥有了4000倍于之前的生产能力的同时无损于它的立体选择性。选择筛查策略筛查策略种类非常广泛。其中一些涉及耗时的筛选程序比如产业条件下的合成，且只能筛查10到100个变种。反之高通量筛选方法诸如荧光激活细胞分选可以筛查上亿，数十亿或更多的变种。很明显，如果可以只筛查一小部分，那就没有理由创建一个庞大的库。因此，有时会发生的情况是：由于缺乏合适的筛选或选择策略，研究人员只能测试极少数突变体，并为此错过最佳的解决方案。哪种策略最棒？我们认为，能花最少力气达成目标的方法才是最棒的蛋白质工程策略。此标准显示纯粹的合理设计或纯粹的随机突变均非最佳选择。在选定位点替换所有19个可能氨基酸并进行筛选的工作量通常小于通过合理计算推出哪个氨基酸最佳。反之，蛋白的可能结构变化数是个天文数字，因此随机突变法也需要限制变化数量的策略。一个尚未解决的挑战是这些新的催化反应很少足够有效率到能进行实际应用。不过到底在我们的理解中缺少了什么才使得催化活动程度无法继续增加尚不得而知。如此，第二个最佳策略标准是选择那些帮助我们更快达到下一个目标的策略，也即我们能从中学到东西的策略。例如，使用错配PCR来使蛋白变异引入了一个或两个氨基酸的替换。经筛查找出改进变体后，变异位点的位置（即“热点”）便暗示了进一步努力的方向在何处。额外的计算机模拟可能会就改善的运作方式产生一个工作假设，相比之下，利用DNA改组使蛋白变异将创建含有不同的起始蛋白片段的蛋白质碎片。尽管通过筛查辨认出了这些变体中的那些具有改进性能，这些变体也是如此多变以至于很难剖析改进为何产生以及下一步如何做。这种差异是为何错配PCR继续在蛋白质工程中被广泛应用而DNA改组不是的原因之一。鉴别最佳的蛋白质工程策略将帮助整个领域从两条途径向前发展。首先，它将使蛋白质工程加速。上述策略均经论证是成功的，倘若有许多解决办法，使用任何策略最终都将达到目的。那么究竟哪些战略能找到更好的解决方案，或者用更少的努力找到同样的解决方案呢？批判性的比较策略将允许蛋白质工程师确定需要最小努力的方法。第二种鉴别最佳策略的途径是测试每个策略的基本假设。每种策略都有关于蛋白质如何折叠，进化和催化反应的假设。这些假设中的每一个都有一两项的成功支持，而在蛋白质工程中更广泛地使用它们可以测试出哪些是更普遍真实的，哪些是最重要的。在给出了改善某个酶的实际目标后，更多的研究者将精力集中在达成目标而非测试各种方法的基础假设上。对蛋白质工程的提议为了在蛋白质工程中取得更快进展，该领域需要对蛋白质的结构如何影响蛋白质性质有更好地理解并对许多蛋白质工程方法进行更具批判性的评价。两件事阻碍了蛋白质结构与功能间的关联。首先，许多实验涉及蛋白质的多重替换，这隐藏了成功的原因。最终导致——这也是影响此领域成长的主要障碍一一下一个问题没那么容易解决。考虑到这些问题，我们提出两个建议：所有蛋白质工程方面的成功范例应当附有一份具有实验支持的，有关成功的分子基础方面的假说。新范例和新假设的累积将使后续的蛋白质工程问题更加简单。所有的蛋白质工程方法应被彻底评估和相对于其他方法进行定量比较。为了报告一个新成果，作者们应当定期提供包含改进性能变体比例以及这些改进的重要程度的信息。理论库，实验库与被筛选的库比例究竟有多大？所有这些相对于其他方法的对比情况怎样？这些情况应与同一实验室中相同的问题比较，而不是依赖于文献报道。计算方法也应包含类似比较。下一步怎么走在未来，蛋白质工程将随着其原则的建立而迈向向合理设计。今日，有机合成仍充满挑战，不过规则已然确立——例如首先构建碳框架，其次是在所有点控制立体化学结构的操作功能组。化学家们知道在连续合成前使用汇集合成，并在可能的情况下避免保护基。确定哪些蛋白质工程策略是最好的，以及突变为何工作能使蛋白质工程加速发展。如果我们比较这些策略，未来的解决方案将更省力。某一策略占上风似不可能，因为每个问题的目标，可用信息量和蛋白质的细节均不同。尽管如此，某些策略将会比其他的更好。比较还将确立蛋白质工程的原则并加强我们对酶工作情况的理解。这一理解将使合理设计更加可靠，并加快通向解决方案的步伐。致谢U.T.B.和R.J.K.分别感谢德国研究基金会(DFG,theGermanResearchFoundation，地址GrantBo1862/4-1)和美国国家科学基金会(theUSNationalScienceFoundation,CHE-0616560)的经济支持。参考文献Lutz,S.&Bornscheuer,U.T.(eds.).ProteinEngineeringHandbook(Wiley-VCH,Weinheim,2009).Estell,D.A.,Graycar,T.P.&Wells,J.A.J.Biol.Chem.260,6518-6521(1985).Fox,R.J.etal.Nat.Biotechnol.25,338-344(2007).Gray,K.A.,Zhao,L.&Emptage,M.Curr.Opin.Chem.Biol.10,141-146(2006).McCarthy,A.Chem.Biol.10,893-894(2003).Eschenmoser,A.&Wintner,C.E.Science196,1410-1420(1977).Woodward,R.B.PureAppl.Chem.33,145-177(1973).Chen-Goodspeed,M.,Sogorb,M.A.,Wu,F.&Raushel,F.M.Biochemistry40,1332-1339(2001).Seelig,B.&Szostak,J.W.Nature448,828-831(2007).Qian,Z.&Lutz,S.J.Am.Chem.Soc.127,13466-13467(2005).Morley,K.L.&Kazlauskas,R.J.T