PCR引物设计原理剖析课件

PCR引物设计原理PCR引物设计原理1PCR反应一般由三个步骤组成：①模板的热变性；②引物复性到单链模板上；③热稳定DNA聚合酶催化的延伸PCR反应一般由三个步骤组成：①模板的热变性；②引物复性2PCR引物设计原理剖析课件3变性在应用TaqDNA聚合酶进行PCR时，变性温度在94-95℃下进行，这也是TaqDNA聚合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不受到过多损失时能耐受的最高温度。有时把变性时间设计为5min，以便大分子模板DNA彻底变性的概率。对于GC含量为55%或更低的线性DNA模板，推荐PCR的变性条件是94-95℃变性45s。变性在应用TaqDNA聚合酶进行PCR时，变性温度4复性温度（退火温度）至关重要！！！退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低；退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性DNA片段的扩增；退火温度，通常比理论设计的引物和模板的Tm值低3-5℃下进行。最好通过对复性温度比两条引物的Tm值低2-10℃内进行PCR预实验（梯度）来对复性条件的优化。引物和模板DNA的复性复性温度（退火温度）至关重要！！！引物和模板DNA的复性5对TaqDNA聚合酶来说，最适温度为72-78℃，时间约为1min。引物的延伸与循环数目哺乳动物DNA为模板时，至少进行25个循环才能得到足够量的扩增产物。一般为30-33个循环。对TaqDNA聚合酶来说，最适温度为72-78℃，时6引物设计要点（1）碱基组成：GC含量应在40%-60%（45%-55%）之间，4中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等；（2）引物长度：引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。引物设计要点（1）碱基组成：7（3）重复或自身互补序列：形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。（3）重复或自身互补序列：8（4）上下引物的互补性：一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端都不能和其他任何引物互补。（4）上下引物的互补性：9（5）解链温度（Tm值）：计算出来的两个引物的Tm值相差不能大于5℃，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃；引物的Tm值一般为50-70℃。这些特性保证了扩增产物在每一个PCR循环可有效变性。（5）解链温度（Tm值）：10（6）3’末端3’末端的性质非常关键。如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A；但不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。（6）3’末端11当末端碱基为A时，错配时引发链合成的效率大大降低；当末端碱基为T时，错配情况下亦能引发链的合成，所以一般PCR反应中，引物3’末端的碱基最好选T、C、G，而不选A。引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。？？（7）5’端序列添加限制性酶切位点：当末端碱基为A时，错配时引发链合成的效率大大降低；12一些概念有意链（Sensestrand），正义链（positivestrand），编码链（codingstrand）；无意链（anti-sensestrand），负义链（negativestrand），模板链（templatestrand）

一些概念有意链（Sensestrand），正义链（posi13正向引物（forwardprimer）：处于DNA双链上游的引物。如用于测序，则从5’→3’方向读出DNA正链的序列。反向引物（Reverseprimer）：处于目的DNA双链下游的引物。如用于测序，则读出DNA负链从下游到上游的反向序列。

正向引物（forwardprimer）：处于DNA双链上14

15PrimerPremier5.0软件设计引物是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件主要界面分为序列编辑窗口（genetank）、primerdesign、酶切分析（restrictionsite）和MotifPrimerPremier5.0软件设计引物是由加拿16正向（Asis）、反向（reversed）、互补（complemented）及反向互补（reversecomplemented）。正向（Asis）、反向（reversed）、互补（comp17正向（Asis）正向（Asis）18反向（reversed）反向（reversed）19互补（complemented）互补（complemented）20EnzymeEnzyme21软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq或Map，分别以序列或图示的方式显示结果。缺点：不能以文本的形式保存结果。软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq或Map，分别22Motif

Motif23PCR引物设计原理剖析课件24PrimerPrimer25点击Search，进行引物搜索点击Search，进行引物搜索26Searchcriteria窗口：多种参数可以调整。PrimerLength常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。PCRProductsize最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。Searchcriteria窗口：多种参数可以调整。Pr27Manual→Searchparameters→人工搜索参数设置窗口。Searchstringency应选High。GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以。Manual→Searchparameters→人工搜索28Searchprogress窗口中显示SearchCompleted→OK键Searchprogress窗口中显示SearchCo29结果窗口→有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物按优劣次序排列，满分为100。选其中的一对引物，在主窗口显示结果。对于上述引物，如果其它各项指标还可以，可在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它。引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。结果窗口→有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物30该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，“S”和“A”可查看有义链或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。注意：尾末给出该引物的最佳退火温度！！第四层：四种重要指标的分析该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，“S”和“A”可31引物长度：控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度。长的PCR引物能给扩增带来更好的特异性，可以通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为18-27nt。Tm融链温度：根据相邻二碱基对作用原理来计算融链温度。PCR反应的合适Tm范围为56-63℃（50-70℃）GC%含量：对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适。（40-60%,45-55%）Degeneracy多义性，尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，尽量避免3’末端的多义性，因为这个位置即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。

引物长度：控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度。长的32BLAST验证引物进入http:///BLAST/,点击BasicBLAST中的nucleotideblast选项BLAST验证引物进入http://www.ncbi.n33在EnterQuerySequence栏中输入引物序列：例：引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;

5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5’→3’。输入上游引物后，加上≥20个字母n，再输入下游引物。在EnterQuerySequence栏中输入引物序列：34在ChooseSearchSet栏中：Database根据预操作基因的种属定了，可选Humangenomic+transcript或Others在ChooseSearchSet栏中：Database根35在ProgramSelection中：选择Somewhatsimilarsequences(blastn)项，如下图：在此界面最下面关键要点击Algorithmparameters参数设置，进入参数设置界面。在ProgramSelection中：选择Somewhat36在GeneralParameters中：Expectthresshold期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Wordsize的下拉框将数字改为7。在GeneralParameters中：Expectth37图中：序列与引物匹配的得分值小于40分、40～50分、50-80分、80-200分等，分值越高，特异性越好；线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。两线段间没有连线的，表示单条引物与该基因一致。有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引物互补（Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。图中：序列与引物匹配的得分值小于40分、40～50分、50-38Accession，数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息Desscription序列的简单描述高的就是有两线段间有连线的代表随机匹配的可能性。E值接近零时最有意义，也就是说序列完全匹配了。Accession，数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序39比对到的序列长度E值越小为好！！匹配上的碱基数占总序列长度的比例缺失或插入，用“-”来表示Query1、2表示输入的两对引物，Sbjct表示在库里比对的序列PrimerBLAST的详细结果比对到的序列长度E值越小为好！！匹配上的碱基数占总序列长度的40ncbi在线primer设计ncbi在线primer设计41默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。

默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你42PCR引物设计原理剖析课件43PCR引物设计原理剖析课件44PCR引物设计原理剖析课件45用Oligo软件设计/评估PCR引物启动Oligo，选择File→open，打开要进行引物分析的序列。用Oligo软件设计/评估PCR引物启动Oligo，选择Fi46图中显示的三个指标：Tm值、ΔG和Frequencies。退火温度窗口是设计引物的主窗口，其他两个具有辅助作用。图中显示的三个指标：Tm值、ΔG和Frequencies。47因为分析要涉及多个指标，启动窗口的Cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为Tile方式。因为分析要涉及多个指标，启动窗口的Cascade排列方式不48用Tile方式显示窗口用Tile方式显示窗口49Tm，退火温度窗口Tm值曲线以选取72℃附近为佳；5’到3’端的下降性状也有利于引物引发聚合反应。圈出来的序列部分及黄色的bar即代表当前分析的21个碱基的Tm值可点击窗口的左下角的Upper、Lower按钮选择上游引物、下游引物。Tm，退火温度窗口Tm值曲线以选取72℃附近为佳；圈出来的序50Tm值似乎太低了Tm值似乎太高了Tm值似乎太低了Tm值似乎太高了51显示了装载的整个序列的6-7mers寡核苷酸顺序的相对频率。寡核苷酸的3'端如果在一个特定的数据库（GenBank的子数据库）更普遍（即出现的频率更高），那么更容易导致错误引发。

Frequencies，碱基频率窗口如果选择出现频率较低的位点作为3'末端，那么就减少了在复杂的底物（比如整个基因组DNA）内的许多位点结合、引发的几率，从而减少了非特异性PCR产物的形成。

显示了装载的整个序列的6-7mers寡核苷酸顺序的相对频52平均频率为1000的话，CTTGGC的频率为1500以上，而TTGGCG德频率很低，约300。平均频率为1000的话，CTTGGC的频率为1500以上，而53ΔG，序列内部碱基稳定性窗口显示了寡核苷酸的内部稳定性(五聚体的自有能)。-1.9值=-（3.1+3.1+3.1+1.6）ΔG值反应了序列与模板的结合强度；最好引物的ΔG值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低。ΔG，序列内部碱基稳定性窗口显示了寡核苷酸的内部稳定性(五聚54在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的，以自由能ΔG表示。第二个核苷酸第一个（5’）核苷酸例子：双链d（ACGG/CCGT）的ΔG是：ΔG（ACGG）=ΔG（AC）+ΔG（CG）+ΔG（GG）=-（1.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的，以55显示了3’末端序列ΔG值较低，适合引发。3’末端序列ΔG太高。显示了3’末端序列ΔG值较低，适合引发。3’末端序列ΔG太高56你可以在三个窗口中自行设计引物。选择了自己认为顺眼的位置，此时，点击Uper，上游引物即可显示。同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。对你设计的引物质量进一步分析。你可以在三个窗口中自行设计引物。选择了自己认为顺眼的位置，此57同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物58参数设置与搜索选择search→forprimersandprobes，进行如右图设置。点击searchranges，设置引物范围和PCR产物的大小点击parameters，进行参数设置。因为设计的是一对引物，正、负链的复选框都要选上。同时选compatiblepairs默认下，对引物的要求：无二聚体、3’高度特异、GC%含量有限定、去除错误引发引物等。参数设置与搜索选择search→forprimersan59引物的长度及产物的长度设置。PrimerLength设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要;PCRProductsize最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊。上限没有太多的限定。引物的长度及产物的长度设置。PrimerLength设置在60普通设置、参数及更多参数从高到低六个等级的设定，最后有一个用户定制选项。当对软件功能不了解时，应选veryhigh/High。选automaticallychangestring后，搜索引物时，如果在高等级设定中无法搜索到引物对时自动降级一个等级来搜索，直到找到为止。反向引物时用普通设置、参数及更多参数从高到低六个等级的设定，最后有一个用61让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE（primeEfficeince）值（引发效率）。可以限定所选引物对的最大数目。让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE（prime62实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据实验需求做相应改动。其他的参数就使用Oligo默认值，一般无需改动。实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据实验需求做相应改动。63直接使用Oligo默认值，一般也无需改变。直接使用Oligo默认值，一般也无需改变。64参数设置完毕后，点击确认OK，程序即进行引物搜索。参数设置完毕后，点击确认OK，程序即进行引物搜索。65引物搜索结果如入：Oligo提供了按引物位置、产物大小、退火温度、GC含量等的排列方式。引物搜索结果如入：66Oligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它提供了多种分析方法并以不同的形式展现出来。选择其中的一对引物，这时程序自动弹出一个PCR分析窗口。Oligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它提供了67PCRoptimalannealingtemperature

（最佳退火温度）数值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。产物Tm值与引物Tm值（低的那个）的差异，一般控制在20度以内。引物间Tm值的差异，一般控制在5-6度以内。引发效率：上（下）引物对于正、负链正确引发效率比。最佳引物浓度PCRoptimalannealingtemperatu68在Analyze菜单中，Oligo提供了众多分析功能。选择相应的功能，分析结果。在Analyze菜单中，Oligo提供了众多分析功能。选69点击Selectedprimers，会给出两条引物的概括性信息;其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbormethod计算，会比Primer5中引物的Tm值略高;引物的DeltaG和3’端的DeltaG:3’端的DeltaG过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。KeyInfo点击Selectedprimers，会给出两条引物的概括性70Duplexformation，引物二聚体引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素→应避免，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其ΔG值应该偏低→由退火温度决定，50°的退火温度和65°对二聚体的影响肯定不一样。Themoststable3’-Dimer

DeltaG绝对值一般不要超过4.5kcal/mol。△G绝对值越大结构越稳定。结合碱基对不要超过3个。themoststableDimeroverall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关。实验表明在PCR退火温度65°时，6.7kcal/mol没有问题。Duplexformation，引物二聚体引物二聚体是影71Hairpinformation，引物发夹结构DeltaG绝对值一般不要超过4.5kcal/mol。结合碱基对不要超过3个。特定的发夹如果没有显示Tm值，那么发夹结构就不容易形成。Hairpinformation，引物发夹结构Delta72结合碱基对已经超过3个。结合碱基对已经超过3个。73在3’形成发夹会引发引物内部的延伸反应，减少了参加正式反应引物的数量。在3’形成发夹会引发引物内部的延伸反应，减少了参加正式反应引74CompositionandTm上下游引物的GC％控制在40％～60％。最后一种是Primer5所采用的方法。TdisanormalizedTmin1MsaltconditionstheTmisavariablevalue,thatdependsonsaltandDNAconcentrationsetintheSearchParameterswindowTm值高时错配很少，特异性强。CompositionandTm上下游引物的GC％控制在75Falseprimingsites，错误引发位点oligo会给正确引发效率和错误引发效率。一般的原则：使误引发效率控制在100以下。有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。Primer的primingefficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。Falseprimingsites，错误引发位点olig76下游引物对于负链，没有发现错误引发。下游引物对于负链，没有发现错误引发。77SelectedOligoSelectedOligo78Primerpairs系统设计出的所有引物对。Primerpairs系统设计出的所有引物对。79internalstabilityInternalstability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。internalstabilityInternalst80上游引物的参数注意：必需把方框拉到上游引物处。上游引物的参数注意：必需把方框拉到上游引物处。81对应的下游引物的参数注意：必需把方框拉到下游引物处。对应的下游引物的参数注意：必需把方框拉到下游引物处。82Hybridizationtime，杂交时间该窗口显示了不同长度、不同浓度的寡核苷酸的杂交时间

Hybridizationtime，杂交时间该窗口显示了不83Concentration您只需点一下鼠标，就轻松地实现对你地引物、PCR产物、DNA模版链即时的浓度、体积、OD值、分子量的转换。该浓度窗口是一个强大的时间保存计算器。Concentration您只需点一下鼠标，就轻松地实现对你84Oligo不仅能以图表的方式将结果展示出来，还能以文本的形式保存。在软件所出现的任何一个窗口，选择File→dataAs，把数据存为一个文本文件。Oligo不仅能以图表的方式将结果展示出来，还能以文本的形式85文本保存的结果如下：最佳退火温度最佳引物浓度、盐浓度文本保存的结果如下：最佳退火温度最佳引物浓度、盐浓度86Primerpremier5设计引物→Oligo引物评估

举例说明：ncbi里查找基因LIF的mRNA序列，用FASTA格式直接保存改基因的CDS区序列。Primerpremier5设计引物→Oligo引物评估87上游引物上游引物88下游引物下游引物89可以看出，Oligo对引物进行了非常全面的分析，为选择最佳的引物提供了参考。Oligo不仅能对所搜索的引物进行全面分析，还能对任意的寡核苷酸进行分析。选择File→newsequence，在出现的窗口中输入要分析的寡核苷酸序列，完毕后按回车键或选择Accept/Discard→Accept。可以看出，Oligo对引物进行了非常全面的分析，为选择最佳的90温馨小提示：当你验证引物时，不要如图似的把引物序列直接黏贴。此处，应该把模板序列输进去。温馨小提示：当你验证引物时，不要如图似的把引物序列直接黏贴。91editnewsequence里用键盘输入上游引物的模板序列（A），选择Accept/Discard→Accept。输入S或dsDNA是错误的。editnewsequence里用键盘输入上游引物的模92注意：看到的序列是模板，而不是需要验证的引物。注意：看到的序列是模板，而不是需要验证的引物。93PCR引物设计原理剖析课件94看：上游引物已经显示了！显示的是方框/当前序列的位置也可以这样操作：方框定位到288，点击Upper，即可显示上游引物。错误！当方框短于引物时，可改变当前序列长度看：上游引物已经显示了！显示的是方框/当前序列的位置也可以这95PCR引物设计原理剖析课件96下游引物也显示了！引物序列长度不同于当前的引物，从“Change”菜单中改变当前的引物长度！引物输入完毕，接下来分析各个参数下游引物也显示了！引物序列长度不同于当前的引物，从“Chan97PCR引物设计原理剖析课件98上下引物3’末端没有二聚体产生。Primerpremier5Oligo上下引物间产生的二聚体，ΔG绝对值应小于4.5值。上下引物3’末端没有二聚体产生。Primerpremier99Primerpremier5Oligo上引物内部形成的二聚体。ΔG绝对值大于9，有点不能接受，而且核苷酸为4个。Primerpremier5Oligo上引物内部形成的二100Primerpremier5Oligo下引物内部形成的二聚体。ΔG绝对值小于4.5，可以接受，最佳退火温度时可以忽略。Primerpremier5Oligo下引物内部形成的二101OligoPrimerpremier5上引物内部形成的发夹结构。ΔG绝对值小于4.5，可以接受。下引物内部没有形成发夹结构。OligoPrimerpremier5上引物内部形成的发102FalsePrimingSites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有分析，但不如oligo详细。Primerpremier5注意：此处，引物在非特异位点进行引发，错误引发。FalsePrimingSites，即错误引发位点，在P103Primerpremier5Primerpremier5104上下引物内部稳定性分析上下引物内部稳定性分析105上引物6-mers出现频率分析上引物6-mers出现频率分析106下引物6-mers出现频率分析下引物6-mers出现频率分析107PCR引物设计原理PCR引物设计原理108PCR反应一般由三个步骤组成：①模板的热变性；②引物复性到单链模板上；③热稳定DNA聚合酶催化的延伸PCR反应一般由三个步骤组成：①模板的热变性；②引物复性109PCR引物设计原理剖析课件110变性在应用TaqDNA聚合酶进行PCR时，变性温度在94-95℃下进行，这也是TaqDNA聚合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不受到过多损失时能耐受的最高温度。有时把变性时间设计为5min，以便大分子模板DNA彻底变性的概率。对于GC含量为55%或更低的线性DNA模板，推荐PCR的变性条件是94-95℃变性45s。变性在应用TaqDNA聚合酶进行PCR时，变性温度111复性温度（退火温度）至关重要！！！退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低；退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性DNA片段的扩增；退火温度，通常比理论设计的引物和模板的Tm值低3-5℃下进行。最好通过对复性温度比两条引物的Tm值低2-10℃内进行PCR预实验（梯度）来对复性条件的优化。引物和模板DNA的复性复性温度（退火温度）至关重要！！！引物和模板DNA的复性112对TaqDNA聚合酶来说，最适温度为72-78℃，时间约为1min。引物的延伸与循环数目哺乳动物DNA为模板时，至少进行25个循环才能得到足够量的扩增产物。一般为30-33个循环。对TaqDNA聚合酶来说，最适温度为72-78℃，时113引物设计要点（1）碱基组成：GC含量应在40%-60%（45%-55%）之间，4中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等；（2）引物长度：引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。引物设计要点（1）碱基组成：114（3）重复或自身互补序列：形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。（3）重复或自身互补序列：115（4）上下引物的互补性：一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端都不能和其他任何引物互补。（4）上下引物的互补性：116（5）解链温度（Tm值）：计算出来的两个引物的Tm值相差不能大于5℃，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃；引物的Tm值一般为50-70℃。这些特性保证了扩增产物在每一个PCR循环可有效变性。（5）解链温度（Tm值）：117（6）3’末端3’末端的性质非常关键。如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A；但不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。（6）3’末端118当末端碱基为A时，错配时引发链合成的效率大大降低；当末端碱基为T时，错配情况下亦能引发链的合成，所以一般PCR反应中，引物3’末端的碱基最好选T、C、G，而不选A。引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。？？（7）5’端序列添加限制性酶切位点：当末端碱基为A时，错配时引发链合成的效率大大降低；119一些概念有意链（Sensestrand），正义链（positivestrand），编码链（codingstrand）；无意链（anti-sensestrand），负义链（negativestrand），模板链（templatestrand）

一些概念有意链（Sensestrand），正义链（posi120正向引物（forwardprimer）：处于DNA双链上游的引物。如用于测序，则从5’→3’方向读出DNA正链的序列。反向引物（Reverseprimer）：处于目的DNA双链下游的引物。如用于测序，则读出DNA负链从下游到上游的反向序列。

正向引物（forwardprimer）：处于DNA双链上121

122PrimerPremier5.0软件设计引物是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件主要界面分为序列编辑窗口（genetank）、primerdesign、酶切分析（restrictionsite）和MotifPrimerPremier5.0软件设计引物是由加拿123正向（Asis）、反向（reversed）、互补（complemented）及反向互补（reversecomplemented）。正向（Asis）、反向（reversed）、互补（comp124正向（Asis）正向（Asis）125反向（reversed）反向（reversed）126互补（complemented）互补（complemented）127EnzymeEnzyme128软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq或Map，分别以序列或图示的方式显示结果。缺点：不能以文本的形式保存结果。软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq或Map，分别129Motif

Motif130PCR引物设计原理剖析课件131PrimerPrimer132点击Search，进行引物搜索点击Search，进行引物搜索133Searchcriteria窗口：多种参数可以调整。PrimerLength常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。PCRProductsize最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。Searchcriteria窗口：多种参数可以调整。Pr134Manual→Searchparameters→人工搜索参数设置窗口。Searchstringency应选High。GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以。Manual→Searchparameters→人工搜索135Searchprogress窗口中显示SearchCompleted→OK键Searchprogress窗口中显示SearchCo136结果窗口→有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物按优劣次序排列，满分为100。选其中的一对引物，在主窗口显示结果。对于上述引物，如果其它各项指标还可以，可在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它。引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。结果窗口→有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物137该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，“S”和“A”可查看有义链或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。注意：尾末给出该引物的最佳退火温度！！第四层：四种重要指标的分析该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，“S”和“A”可138引物长度：控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度。长的PCR引物能给扩增带来更好的特异性，可以通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为18-27nt。Tm融链温度：根据相邻二碱基对作用原理来计算融链温度。PCR反应的合适Tm范围为56-63℃（50-70℃）GC%含量：对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适。（40-60%,45-55%）Degeneracy多义性，尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，尽量避免3’末端的多义性，因为这个位置即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。

引物长度：控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度。长的139BLAST验证引物进入http:///BLAST/,点击BasicBLAST中的nucleotideblast选项BLAST验证引物进入http://www.ncbi.n140在EnterQuerySequence栏中输入引物序列：例：引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;

5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5’→3’。输入上游引物后，加上≥20个字母n，再输入下游引物。在EnterQuerySequence栏中输入引物序列：141在ChooseSearchSet栏中：Database根据预操作基因的种属定了，可选Humangenomic+transcript或Others在ChooseSearchSet栏中：Database根142在ProgramSelection中：选择Somewhatsimilarsequences(blastn)项，如下图：在此界面最下面关键要点击Algorithmparameters参数设置，进入参数设置界面。在ProgramSelection中：选择Somewhat143在GeneralParameters中：Expectthresshold期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Wordsize的下拉框将数字改为7。在GeneralParameters中：Expectth144图中：序列与引物匹配的得分值小于40分、40～50分、50-80分、80-200分等，分值越高，特异性越好；线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。两线段间没有连线的，表示单条引物与该基因一致。有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引物互补（Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。图中：序列与引物匹配的得分值小于40分、40～50分、50-145Accession，数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息Desscription序列的简单描述高的就是有两线段间有连线的代表随机匹配的可能性。E值接近零时最有意义，也就是说序列完全匹配了。Accession，数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序146比对到的序列长度E值越小为好！！匹配上的碱基数占总序列长度的比例缺失或插入，用“-”来表示Query1、2表示输入的两对引物，Sbjct表示在库里比对的序列PrimerBLAST的详细结果比对到的序列长度E值越小为好！！匹配上的碱基数占总序列长度的147ncbi在线primer设计ncbi在线primer设计148默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。

默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你149PCR引物设计原理剖析课件150PCR引物设计原理剖析课件151PCR引物设计原理剖析课件152用Oligo软件设计/评估PCR引物启动Oligo，选择File→open，打开要进行引物分析的序列。用Oligo软件设计/评估PCR引物启动Oligo，选择Fi153图中显示的三个指标：Tm值、ΔG和Frequencies。退火温度窗口是设计引物的主窗口，其他两个具有辅助作用。图中显示的三个指标：Tm值、ΔG和Frequencies。154因为分析要涉及多个指标，启动窗口的Cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为Tile方式。因为分析要涉及多个指标，启动窗口的Cascade排列方式不155用Tile方式显示窗口用Tile方式显示窗口156Tm，退火温度窗口Tm值曲线以选取72℃附近为佳；5’到3’端的下降性状也有利于引物引发聚合反应。圈出来的序列部分及黄色的bar即代表当前分析的21个碱基的Tm值可点击窗口的左下角的Upper、Lower按钮选择上游引物、下游引物。Tm，退火温度窗口Tm值曲线以选取72℃附近为佳；圈出来的序157Tm值似乎太低了Tm值似乎太高了Tm值似乎太低了Tm值似乎太高了158显示了装载的整个序列的6-7mers寡核苷酸顺序的相对频率。寡核苷酸的3'端如果在一个特定的数据库（GenBank的子数据库）更普遍（即出现的频率更高），那么更容易导致错误引发。

Frequencies，碱基频率窗口如果选择出现频率较低的位点作为3'末端，那么就减少了在复杂的底物（比如整个基因组DNA）内的许多位点结合、引发的几率，从而减少了非特异性PCR产物的形成。

显示了装载的整个序列的6-7mers寡核苷酸顺序的相对频159平均频率为1000的话，CTTGGC的频率为1500以上，而TTGGCG德频率很低，约300。平均频率为1000的话，CTTGGC的频率为1500以上，而160ΔG，序列内部碱基稳定性窗口显示了寡核苷酸的内部稳定性(五聚体的自有能)。-1.9值=-（3.1+3.1+3.1+1.6）ΔG值反应了序列与模板的结合强度；最好引物的ΔG值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低。ΔG，序列内部碱基稳定性窗口显示了寡核苷酸的内部稳定性(五聚161在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的，以自由能ΔG表示。第二个核苷酸第一个（5’）核苷酸例子：双链d（ACGG/CCGT）的ΔG是：ΔG（ACGG）=ΔG（AC）+ΔG（CG）+ΔG（GG）=-（1.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的，以162显示了3’末端序列ΔG值较低，适合引发。3’末端序列ΔG太高。显示了3’末端序列ΔG值较低，适合引发。3’末端序列ΔG太高163你可以在三个窗口中自行设计引物。选择了自己认为顺眼的位置，此时，点击Uper，上游引物即可显示。同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。对你设计的引物质量进一步分析。你可以在三个窗口中自行设计引物。选择了自己认为顺眼的位置，此164同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物165参数设置与搜索选择search→forprimersandprobes，进行如右图设置。点击searchranges，设置引物范围和PCR产物的大小点击parameters，进行参数设置。因为设计的是一对引物，正、负链的复选框都要选上。同时选compatiblepairs默认下，对引物的要求：无二聚体、3’高度特异、GC%含量有限定、去除错误引发引物等。参数设置与搜索选择search→forprimersan166引物的长度及产物的长度设置。PrimerLength设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要;PCRProductsize最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊。上限没有太多的限定。引物的长度及产物的长度设置。PrimerLength设置在167普通设置、参数及更多参数从高到低六个等级的设定，最后有一个用户定制选项。当对软件功能不了解时，应选veryhigh/High。选automaticallychangestring后，搜索引物时，如果在高等级设定中无法搜索到引物对时自动降级一个等级来搜索，直到找到为止。反向引物时用普通设置、参数及更多参数从高到低六个等级的设定，最后有一个用168让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE（primeEfficeince）值（引发效率）。可以限定所选引物对的最大数目。让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE（prime169实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据实验需求做相应改动。其他的参数就使用Oligo默认值，一般无需改动。实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据实验需求做相应改动。170直接使用Oligo默认值，一般也无需改变。直接使用Oligo默认值，一般也无需改变。171参数设置完毕后，点击确认OK，程序即进行引物搜索。参数设置完毕后，点击确认OK，程序即进行引物搜索。172引物搜索结果如入：Oligo提供了按引物位置、产物大小、退火温度、GC含量等的排列方式。引物搜索结果如入：173Oligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它提供了多种分析方法并以不同的形式展现出来。选择其中的一对引物，这时程序自动弹出一个PCR分析窗口。Oligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它提供了174PCRoptimalannealingtemperature

（最佳退火温度）数值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。产物Tm值与引物Tm值（低的那个）的差异，一般控制在20度以内。引物间Tm值的差异，一般控制在5-6度以内。引发效率：上（下）引物对于正、负链正确引发效率比。最佳引物浓度PCRoptimalannealingtemperatu175在Analyze菜单中，Oligo提供了众多分析功能。选择相应的功能，分析结果。在Analyze菜单中，Oligo提供了众多分析功能。选176点击Selectedprimers，会给出两条引物的概括性信息;其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbormethod计算，会比Primer5中引物的Tm值略高;引物的DeltaG和3’端的DeltaG:3’端的DeltaG过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。KeyInfo点击Selectedprimers，会给出两条引物的概括性177Duplexformation，引物二聚体引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素→应避免，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其ΔG值应该偏低→由退火温度决定，50°的退火温度和65°对二聚体的影响肯定不一样。Themoststable3’-Dimer

DeltaG绝对值一般不要超过4.5kcal/mol。△G绝对值越大结构越稳定。结合碱基对不要超过3个。themoststableDimeroverall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关。实验表明在PCR退火温度65°时，6.7kcal/mol没有问题。Duplexformation，引物二聚体引物二聚体是影178Hairpinformation，引物发夹结构DeltaG绝对值一般不要超过4.5kcal/mol。结合碱基对不要超过3个。特定的发夹如果没有显示Tm值，那么发夹结构就不容易形成。Hairpinformation，引物发夹结构Delta179结合碱基对已经超过3个。结合碱基对已经超过3个。180在3’形成发夹会引发引物内部的延伸反应，减少了参加正式反应引物的数量。在3’形成发夹会引发引物内部的延伸反应，减少了参加正式反应引181CompositionandTm上下游引物的GC％控制在40％～60％。最后一种是Primer5所采用的方法。TdisanormalizedTmin1MsaltconditionstheTmisavariablevalue,thatdependsonsaltandDNAconcentrationsetintheSearchParameterswindowTm值高时错配很少，特异性强。CompositionandTm上下游引物的GC％控制在182Falseprimingsites，错误引发位点oligo会给正确引发效率和错误引发效率。一般的原则：使误引发效率控制在100以下。有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。Primer的primingefficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。Falsepr