细菌内毒素和热原检查法

关于细菌内毒素和热原检查法第1页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五基础知识热原：注入人体后可引起发热反应的物质。1材料的致热性。2因微生物污染造成的热原反应。第2页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五热原的检查方法体内热原检查法——兔温法（PT)——是一种体内的、全热原的检查方法。1942年USP12版第一次收载。各国药典至今仍在使用。体外热原检查法（ITP)——是一种体外的利用人血细胞反应的全热原检查法。尚未有药典收载，欧洲药典将会收载。细菌内毒素检查法（BET)——医药工业普遍接受控制内毒素等于控制热原。第3页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五热原分类——按检查法分内毒素热原——革兰氏阴性细菌细胞壁的组分非内毒素热原——除内毒素外的热原第4页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五热原检查法（家兔法）可用于检测上述两种原因产生的热原反应。细菌内毒素检查法只检测产品的细菌内毒素含量。试验验证未发现输液器材料的致热性，临床发生的热原反应均为细菌内毒素污染造成的。因此对输液器成品可采用细菌内毒素检查法进行热原初试。第5页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五热原通常是指能够致热的微生物的尸体及代谢产物，主要是细菌的内毒素。细菌内毒素：主要存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁内，菌体裂解时释放出来。是磷脂，脂多糖和蛋白质组成的复合物，复合物中的脂多糖是内毒素的主要成分，具有特别强的热原活性。第6页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五热原的致热机理：细菌内毒素，病毒，细菌及其他微生物，类固醇或某些材料释放热原质，作用于动物体单核细胞，巨噬细胞等靶细胞后，促使其产生内生性热原，作用于下丘脑体温调节中枢，结果使动物体温升高。第7页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五热原反应给临床治疗带来极大的危害，一般热原进入人体后数分钟至1小时内，即会出现高热症状，反应严重者会造成死亡，故必须严格控制。细菌内毒素的理化性质1耐热性：180~200摄氏度2小时干热可完全破坏。（药典为250摄氏度至少1小时。）

第8页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五2滤过性：体积极小，可通过普通滤器。3水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水冲洗以除去热原。4不挥发性5被吸附性：可被树脂等吸附除去。6被酸碱破坏7被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡4小时，可完全破坏。第9页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五细菌内毒素生物活性致热性致死性引起血液白细胞中的粒细胞下降激活凝血系统血压下降诱导机体对内毒素的耐受引起淋巴细胞的有丝分裂诱导抗感染的非特异性杀死肿瘤细胞与鲎试剂反应第10页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五细菌内毒素检查法第11页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五概述：1968年发现并创造了鲎试验，至今仍是国际上通用检测细菌内毒素的最简便有效的方法，其优点在于：1科学性：有生物化学的理论基础。2准确性：是酶的分子生化反应，专属性高，重现性强。3灵敏性：鲎试剂和细菌内毒素的反应灵敏度极高，第12页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五当内毒素量低到10-10g/ml浓度，它们都能起凝胶反应，至今未发现一种物质对鲎试剂的反应比细菌内毒素更灵敏。4实用性：方法快速，操作简单，无需特殊仪器设备，经济实用。由于细菌内毒素检查法的优越性，已被广泛应用于临床检验。第13页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五实验目的：据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断医疗器械或其浸提液中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，医疗器械/材料须经热原实验评价证实无材料致热性，同时经测定证实样品对细菌内毒素试验无干扰作用后，才能采用该方法。第14页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五实验原理细菌内毒素在钙离子，镁离子参与下，激活鲎试剂中c因子，活化的c因子激活b因子，活化的b因子激活凝固酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成凝固蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。第15页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五内毒素C因子活化c因子B因子活化b因子凝固酶元凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白凝胶某些非热原物质G因子活化g因子第16页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五实验试剂：鲎试剂：是从栖生于海洋的无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示。鲎试剂的灵敏度是用细菌内毒素来标定的，因此标定鲎试剂灵敏度所用的细菌内毒素必须是统一且标准的。第17页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五实验试剂细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素，单位：EU.用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其效价。具备均一性和稳定性。第18页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五细菌内毒素检查用水：指与灵敏度为0.03EU/ML或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。第19页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五实验用具

移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10×75mm）、三角瓶、小试管（16×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。所有玻璃器皿须经180℃干烤至少2小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。第20页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五试剂

75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。

第21页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五操作方法

试验准备洗液的配备配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。玻璃器皿的洗涤将洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，置烤箱。第22页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五

除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素，玻璃器皿置箱后将烤箱调至180℃，待烤箱温度升到设定的温度后开始记时，须干烤至少2小时。达到时间后，关断电源。待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可两周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。塑料制品清洗干净后在30％双氧水中浸泡4h，再用无热原水充分冲洗后在60℃烘箱中烘干备用。第23页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五鲎试剂灵敏度复核

内毒素标准溶液的制备取NSE或WSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。按标准品使用说明书用移液管加入规定量的BET水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0λ、1.0λ,0.5λ,0.25λ（λ为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒（详细过程请参见使用说明书）。第24页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五示例例如使用NSE(内毒素含量为9000EU/支)时的方法如下：溶解：准确吸取BET水1ml加入NSE的安瓿内，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器混合15分钟，即为9000EU/ml内毒素标准溶液。稀释：取0.3ml内毒素标准溶液加上2.7mlBET水即为1→10稀释液，得到900EU/ml内毒素标准溶液。第25页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五取0.3mL1→10稀释液，加上2.7mLBET水即为1→100稀释液，得到90EU/ml内毒素标准溶液。往后依次类推。也可写成下列格式：第26页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五9000EU/ml→900EU/ml→90EU/ml→9EU/ml→1EU/ml→0.5EU/ml→0.25EU/ml→0.125EU/ml→0.0625EU/ml在上述稀释过程中，每稀释一步，均须旋涡混合器上混合30秒钟。0.3ml2.7ml2.4ml0.3ml1ml1ml第27页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五待复核鲎试剂的准备

在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈处轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，加入0.1mlBET水，使鲎试剂充分溶解，避免产生气泡。第28页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五

若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水溶解，将溶解后的鲎试剂溶液混匀后每0.1ml分配到10×75mm凝聚管中，要求至少分配18管备用。第29页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18支(管)放在试管架上，排成5列，其中4支(管)4列分别加入2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；2支(管)1列分别加入BET水，作为阴性对照。内毒素标准溶液和BET水加样量均为0.1ml/支。第30页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37摄氏度水浴中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟.第31页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五结果判定：将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。第32页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五鲎试剂灵敏度复核

如最大2.0λ浓度管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性，

按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。λc＝lg-1(ΣX/4)式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后四个呈阳性的结果浓度。第33页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五结果记录阴性0.50.250.1250.0625-++---++---++---+---第34页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五举例计算内毒素稀释液浓度d(EU/ml)X(lgd)0.25-0.602060.25-0.602060.25-0.602060.5-0.30103第35页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五举例计算∑X=﹣2.10721λс=lg-1(-2.10721/4)=0.297测定值在标示值的50%——200%之间，所标示灵敏度可被确认，此批鲎试剂可用于供试品的细菌内毒素检查。第36页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五内毒素限值的确定一次性使用输液器内毒素限值为20EU/套（GB/T14233.2-2005)供试品细菌内毒素的检查第37页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五供试品细菌内毒素的检查供试品溶液的制备每批输液器取3套，管内腔注入细菌内毒素检查用水10mL，反复荡洗5次后，两端封闭，置37℃下2h，将腔内的液体倒入一无菌无热原玻璃容器内。第38页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五举例：所用鲎试剂标示灵敏度为0.25EU/ml,则阳性对照溶液的细菌内毒素浓度为0.5EU/ml.阳性对照溶液的制备用细菌内毒素检查用水制成2λ浓度的细菌内毒素溶液。试剂制备第39页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五鲎试剂制备在制备供试品溶液、内毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂6支，手指轻弹瓶壁，使颈部瓶壁上的粉末落入瓶内，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加入0.1ml/支水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若使用的鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水复溶，将溶解后的鲎试剂液混匀后每0.1ml分配到10×75mm凝集管中，要求至少分配6管备用。第40页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五供试液的稀释使用鲎试剂的灵敏度标示值小于供试品的细菌内毒素限量时，用检查用水将供试液稀释后进行试验，公式如下：供试液稀释倍数=X/λX——供试品的细菌内毒素限量λ——使用鲎试剂的灵敏度标示值第41页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五加样取装有0.1ml鲎试剂溶液的10×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿8支。2支加入0.1ml按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液作为供试品试管。2支加入0.1ml2λ浓度的内毒素溶液作为阳性对照。2支加入0.1mlBET水作为阴性对照。2支加入0.1ml含2λ浓度的内毒素的供试品溶液作为供试品阳性对照第42页，共48页，2022年，5月20日，19点20分，星期五