本科生实验课件

实验一培养基的制作一、目的要求了解培养基的配制原理，掌握培养基的制备方法。

二、基本原理

在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基。培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养，用人工方法配制而成的营养基质。在植物病理学研究中，最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基，主要用于分离培养病原真菌。在培养基配制完之后，必须经过灭菌，以便彻底杀死其中原有的一切微生物。三、材料、试剂与仪器1．材料马铃薯。2．试剂葡萄糖、琼脂等。3．仪器与用品高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（或酸度计）、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等。四、操作步骤PDA培养基（马铃薯葡萄糖培养基）配方去皮马铃薯200g;葡萄糖20g;琼脂15～20g;蒸馏水1000ml自然pH,在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，这样配制的培养基也称为PSA培养基。1．称量:去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g。提示琼脂加入的量取决于琼脂的质量，质量好的15g就够了，质量差的应适当增加。另外，在夏天气温较高时，适当增加用量。2．将马铃薯切成小块，放入锅中，加水1000ml，煮沸30min。用纱布滤去马铃薯残渣。3．将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。提示在琼脂融化的过程中，需要用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。4．加入葡萄糖。葡萄糖容溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1000ml。提示通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度，如1000ml,2000ml等，在定容时直接将水加至已标记的刻度即可。8．灭菌将培养基以0.1Mpa，121C,高压蒸气灭菌20min。9．搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50C左右，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。培养基经灭菌后，必须放在37℃温箱培养24h，无菌生长者方可使用。

五、所需时间流程培养基配制高压灭菌培养观察六、实验作业各组上交按计划制备的培养基。七、思考题1为什么有的培养基要调pH值，有的可以不调?2加压蒸气灭菌为什比干热灭菌所要求的温度低、时间短?3．想一想，试一试，将几只试管包扎在一起比较牢固？实验二植物病害的调查通过植物病害的调查，了解植物病害种类、分布和发生情况，是掌握病害的发生发展规律，开展病害防治的基础工作。

通过调查研究，才能制定防治策略，提出切合实际，行之有效的防治方法与适当的防治适期。防治前了解情况才能做到心中有数，防治后调查可以检查防治效果及存在问题。一、目的要求

了解植物病害田间取样的各种方法和掌握调查病情的方法，学会计算发病率和病情指数，以及进一步估计因病造成的损失等。二、材料和用具

大棚蔬菜病害；笔记本、铅笔、米尺。三、内容与方法

病害调查可分为一般调查和重点调查两类，根据调查目的不同，再决定调查的方法。3.1一般调查当一个地区有关病害发生情况的资料很少，可先进行一般调查，主要是了解病害的分布和发病程度，调查的面要广，并且要有代表性。3.2重点调查经过一般调查发现的重要病害，可作为重点调查的对象，深入了解它的分布，发病率、损失率、生态环境和防治效果等。重点调查的次数要多一些，发病率的计算也要求比较准确。3.3植物病害田间调查的时间和次数：根据调查目的来确定。3.4取样的方法与数量：（1）棋盘式：（2）对角线取样法（3）平行线跳跃式取样法（抽行式）：实验三病害标本的采集及病原菌的分离

分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的外部，有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。

番茄灰霉病主要发生在果实上，在病部形成鼠灰色的霉层；番茄叶霉病主要发生在叶片上，叶子背面形成褐色霉层。最易伴生腐生细菌。分离时用无菌接种针（环）挑取孢子少许用划线方法接种到PDA平板上。或者加灭了菌的蒸馏水制成孢子悬浮液,均匀涂抹在平板上.全自动高压灭菌锅

分离工作应在无菌条件下进行，无菌室和超净工作台是分离不可缺少的设施。

2.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，以番茄叶霉病、灰霉病为试材进行：（1）取番茄叶霉病病叶，先用无菌水冲洗干净。（2）在病、健交界处剪取2～3毫米长的病组织，在70%的酒精中浸2～3秒种。

目的是在表面消毒的同时，驱除病组织表面的气泡，使病组织与升汞溶液能够充分接触发挥消毒作用。

（3）按无菌操作法将病组织移入0.1%升汞溶液中表面消毒3～5分钟，时间长短依病组织不同而异。（4）然后在无菌水中连续漂洗3次，除去残留的消毒剂后，直接移至PDA平板培养基上。每皿放4～5块，倒置于20～25℃室温下，一般3～4天后观察待分离菌生长结果。

(为防止细菌污染，可在培养基中加入1000ppm链霉素10毫升)，

（5）待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PDA斜面培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是番茄叶霉或灰霉病菌，若仅有其中的一种病菌的孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。实验四病原真菌的培养性状及生长量的测定

植物病害方面，培养真菌的目的主要是观察它的性状和研究环境条件对它的影响，或者是大量繁殖后用于接种或其他试验。真菌生长量的测定主要有（1）目力估测；（2）直线生长：测定菌落的半径或直径或者计算菌落面积；（3）湿重测定：振荡培养后测定菌丝的重量；（4）干重测定：菌丝烘干后测重。一、目的要求

了解几种常见植物病原真菌在平板上生长的特性以及不同病原真菌的生长速率。二、材料、用具及仪器番茄灰霉病菌灰葡萄孢菌番茄叶霉病菌褐孢菌PDA平板笔记本、铅笔、米尺、接种刀、打孔器、接种环、消毒液（70%的酒精）微波炉高压灭菌锅超净工作台恒温培养箱三、实验步骤

实验五真菌孢子的萌发及的记数

促使真菌孢子的产生和孢子的萌发实验，在真菌病吉的研究上是很重要的。真菌的鉴定主要是根据子实体和孢子的形态，孢子的萌发实验又是杀菌剂药效测定的主要方法。为了研究病原真菌的生活史、病害循环以及病害的发生和流行的条件等。都涉及孢子的产生和萌发问题。一、目的要求

掌握常见孢子萌发的方法和孢子的记数方法。二、材料、用具及仪器灰霉病菌褐孢菌镰刀菌链格菌PDA平板小烧杯笔记本、铅笔、打孔器、接种环玻璃棒显微镜搅拌器恒温培养箱三、实验步骤

3.1悬滴法：可用有凹陷的载玻片，粘固剂可以用蜂蜡，或者在蜂蜡中加少许凡士林。在盖玻片的四个边上涂上粘固剂，然后在盖玻片的中央加一滴孢子悬浮液，将盖玻片翻转而放在载玻片上，轻轻压一下，盖玻片就粘在载破片上，将载破片放在培养皿中，在适宜的温度下使孢子萌发。3.2培养皿中的萌发法将10m1适当稀释的孢子悬浮狡加在平底的培养皿中，萌发后在显做镜下直接观察，其优点是同时可以测定大量孢子的萌发率。3.3琼胶平板表面萌发法许多在水中萌发不太好的孢子，可放在任琼胶平板表面萌发。为了避免杂菌的生长，有时，可用水琼胶平板。4.孢子的记数计数器计数法：孢子的计数最好是用计数器。计数器的种类很多，纽鲍尔(Neubauer)血球计数板是常用的一种。它是一块很厚的载玻片，上面划有每边长为0.05mm的小方格，每小格的面积是0.0025mm2。加盖玻片后，小格的深度是0.1mm，所以每小格的容积是0.00025mm3，它的体积是1／4000000mL。测数时，先将盖玻片放在计数汁上有刻度的位置，从盖破片的一侧加小滴适当稀释的孢子悬浮液，然后在显微镜下观察每小格中孢子的数目；观察80小格，以它的平均数乘以4000000。就是1毫升悬浮液中孢子的数目。5.作业

计算单位面积产孢量

实验六细菌的染色反应1.亚甲蓝染色法：用亚甲蓝染色法，成分如下：溶液1（亚甲蓝0.3g，95％酒精30mL）；溶液2（0.01％氧氧化钾溶液100mL）;溶液1和2分别配好后混合后可染色。用移植环挑取少量琼胶平板上培养24～48h左右的内生细菌与蒸馏水混合，将配成的稀悬浮液1滴涂匀在洁净的载玻片上，在空气中干燥后通过火焰二三次固定后染色。细菌染色后，用油镜观察其形状和大小。

2.革兰氏染色法（GramStain）原理:第一步：结晶紫使菌体着上紫色第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。

G+菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。1、菌株：未知2、流程路线：(1)涂片(2)干燥(3)固定(4)草酸铵结晶紫染色1min(5)水洗干燥(6)碘液媒染1min(7)水洗干燥(8)95%乙醇脱色15~20秒(9)水洗干燥(10)番红复染1min水洗干燥镜检(1)涂片干燥固定:21（2）草酸铵结晶紫染色1min水洗干燥（3）碘液媒染1min水洗干燥

（4）95%乙醇脱色15~20秒水洗干燥（5）番红复染1min水洗干燥镜检注意事项（1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。（3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。实验七病原菌的接种接种试验是植物病理学最重要的工作，早期的接种试验主要是确定一种病原物的致病性，证明病害的病原物，以后逐渐扩展到各个领域如侵染过程、病害循环、病原物致病性的分化、植物对病原物抗性、病害流行、损失估计和病害控制的研究各个方面。（1）喷雾法喷雾法是将孢子（或菌丝）悬浮液喷洒在寄主表面，常用于接种由气流和雨水传播的病害。病菌可以从气孔、伤口或表皮直接侵入。（2）喷撒法喷撒法是用于接种锈菌和白粉菌，可将干的病菌孢子喷撒在潮湿的植物表面上。白粉菌和锈菌的孢子可与滑石粉混合后放在小喷粉器中喷。加滑石粉的量是孢子量的10倍左右。（3）涂抹法如接种麦类锈菌，由于寄主表面和锈菌孢子都不易沾湿（不宜用喷洒法接种），一种接种法是先用手指沾水摩擦叶片，使表面有一薄层水膜，然后将孢子涂抹在上面。喷雾、喷撒和涂抹接种后的植物，必须保湿约24～48h，使病菌的孢子能够萌发和侵入。（4）注射法注射法是将病菌孢子悬浮液用注射针注入寄主的生长点或幼嫩部分，发病往往可以很重。这种方法用于接种麦类锈菌及玉米瘤黑粉菌等的效果很好，也适用于一些其他病害的接种。（5）针刺法接种伤口侵入的