流脑实验室诊断技术课件

流脑实验室诊断技术黑龙江省疾病控制中心免疫规划所内容提要流脑疾病简介流脑流行情况流脑的病原学流脑流行病学流脑诊断与鉴别诊断流脑实验室监测疾病简介流行性脑脊髓膜炎（Cerebo-spinalmeningitidis，CSM）简称流脑，是由脑膜炎奈瑟氏菌（NeisseriaMeningitidis，Nm）感染脑膜或脑脊髓膜引起的急性呼吸道传染病，常在冬春季节发病和流行。该病起病急、病情重，有发热、头痛、呕吐、皮肤出血点及脑膜炎刺激征。流脑流行情况（国际）流脑从病原学的发现至今已有100多年的历史，现在仍是一种常见的呼吸道传染病，病死率高。流脑遍布全球，在温带地区可出现地方性流行，经常有散在病例出现，在冬春季节会出现季节性发病高峰。全世界每年发生流脑病例超过50万，平均年发病率为1/10万~10/10万，但在流行地区，流行期可达100/10万~500/10万。但至今仍然未得到有效的控制，全球每年仍有30多个国家和地区受到严重威胁。流脑流行情况（中国）我国是流脑高发国家之一，一般非流行年全国发病率为3/10万~10/10万，小流行年为30/10万~50/10万，大流行年可高达100/10万~500/10万。全国发病率疫苗使用前，发病率水平较高，多在20/10万左右1967年曾达到403/10万，发病超过304万，死亡数超过16万A群流脑疫苗广泛使用后，发病率大幅度下降，病死率仍然维持在较高水平。1990年起＜1/10万；2000年起＜0.2/10万，病例数少于3000例。流脑流行周期疫苗使用前，每8-10年出现一次流行。广泛使用疫苗后，流行周期不明显。流脑流行情况（中国）A群开始接种、广泛接种A+C群批准、接种1950-2007年全国流脑报告发病率、死亡率及病死率流脑流行情况（中国）1970年1990年2000年2007年不同年份流脑高发省份变迁内容提要流脑疾病简介流脑流行情况流脑的病原学流脑流行病学流脑诊断与鉴别诊断流脑实验室监测流脑病原学在光学显微镜下观察：（革兰染色，放大1000倍）流脑病原学脑膜炎球菌为专性需氧菌。最适PH为7.2~7.4，最适培养温度为36~37℃，低于25℃或高于40℃不生长。常用培养基为血琼脂，巧克力琼脂或卵黄平板。在37℃培养24h后，在巧克力或血培养基或卵黄培养基上生长良好。Nm为需氧菌，菌落直径为0.5mm～2mm，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色，透明或半透明、似露珠状、不溶血、不产色素。培养时间延长，菌落增大，着色深浅不一致，不透明，并可出现颗粒状中心和放射性周边。

流脑病原学脑膜炎奈瑟菌培养在巧克力琼脂上，显示灰白色菌落，其氧化酶阳性。（巧克力琼脂，18小时，37℃）流脑病原学三、生化反应Nm能分解葡萄糖、麦芽糖；产酸不产气，不发酵蔗糖、果糖、乳糖，不液化明胶，V.P、靛基质、硫化氢试验均为阴性，氧化酶阳性。

流脑病原学四、抵抗力Nm的抵抗力较弱，对干燥、热均很敏感。在生理盐水中仅能存活数小时，加热60℃，5min即可死亡。对各种化学剂亦敏感，在1%酚、0.1%升汞，10%甲醛（福尔马林），浸泡数分钟即可被杀死。抗生素选择：对青霉素、氨苄西林、美洛培南、头孢曲松、头孢噻肟、氯霉素、米诺环素、阿奇霉素、利福平、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明等12种抗生素开展耐药性检测均较敏感。流脑病原学耐药的Nm菌株增多对青霉素耐药的菌株少见未发现对氯霉素耐药的菌株对磺胺药物耐药的菌株较多流脑病原学黑龙江省流脑菌群耐药性监测2006年、2008年对我省分离出的A群脑膜炎奈瑟氏菌进行耐药性检测。结果显示：敏感药物----头孢噻肟、头孢曲松、阿齐霉素、米诺环素、氯霉素、利福平耐药----环丙沙星、磺胺甲噁唑流脑病原学五、抗原结构与分析Nm新分离菌株具有下列主要抗原：血清群特异性荚膜多糖（Capsularpolysaccharide，CPS）、主要外膜蛋白（Outermembraneprotein，OMP）、铁调节蛋白、脂寡糖、还有菌毛抗原等。特异性荚膜多糖是分群的基础，而外膜蛋白和脂多糖是分型的物质，对人的致病性及免疫性起重要作用。

根据荚膜多糖抗原的不同，可将Nm分为13群：A、B、C、D、X、Y、Z、29E、W135、H、I、K、L13个血清群。我国流行菌株以A群为主，C群在某些省份已成为发病的优势菌群。流脑流行病学传染源病人Nm的宿主是人，病人和带菌者是传染源，只在人间传播。病原菌存在于病人或带菌者的鼻咽部。敏感抗生素治疗24h后，不具有传染性。病后带菌者约有10%～20%，其排菌时间可达数周至2年。带菌时间超过3个月以上者，称慢性带菌者，所带多为耐药菌株，常存在于带菌者鼻咽部深层淋巴组织内。带菌者或隐性感染者因不易发现，对周围人群的危险性大于病人。流脑流行病学带菌者人群带菌率＞20%，提示可能发生流行；流行期间人群带菌率可达50%。非流行期的带菌菌群常以B群为主，流行期间则A群所占百分比较高。流脑流行病学易感者人群普遍易感：未有效接种过流脑疫苗，未患过流脑的人，都是Nm的易感者，约1%的被感染者可能发病。新生儿出生时有来自母体的杀菌抗体，故很少发病，2～3月龄以后婴儿即有发病者，6个月～2岁婴儿发病率最高，以后又逐渐下降。在6～24个月时抗体水平下降至最低点，以后又逐渐增高，至20岁左右达到成人水平，人群的易感性与抗体水平密切相关。流脑流行病学由于相隔一定时间后人群免疫力下降，新的易感者逐渐积累增加，所以平均每隔10年左右有一次流行高峰。多年来国内外对带菌问题进行了广泛的调查。一般带菌规律为流行期高，非流行期低；城市高，郊区低；成人高，儿童低；与病人密切接触者高；流行地区高，非流行地区低。一般带菌以B群为最高，占60%～70%，其次为C群，流行期内A群带菌率上升，爆发流行点A群的带菌率可达25%～50%以上。流脑流行病学流行概况流脑早在16世纪即被发现，其流行的地域分布极广，几乎遍及各大洲。各国之间流脑的发病水平差异很大，一般地讲，在发达国家中发病率较低，在发展中国家发病率相对较高而在非洲流脑流行带其发病率最高。我国是流脑的高发国家，20世纪初各地均有流行的报告，近百年来我国曾有过5次全国性大流行即1938年、1949年、1959年、1967年和1977年。流脑流行病学发病年龄以15岁以下儿童为主，5岁以下发病率最高，发病年龄与地域及免疫抗体的水平有关。一般大城市多为散发，以2岁以下发病率最高。中、小城市以2～9岁组为主，2～4岁最高。在偏僻山区，一旦有传染源介入，常导致暴发流行。男女发病率大致相等。近年来由于A群脑膜炎球菌多糖疫苗的广泛应用，大年龄组儿童的发病率得到了有效的控制，但由于多糖类疫苗为T细胞非依赖性抗原，对小于18月龄以下婴幼儿效果差，故小年龄组儿童没有得到有效的保护。内容提要流脑疾病简介流脑流行情况流脑的病原学流脑流行病学流脑诊断与鉴别诊断流脑实验室监测诊断与鉴别诊断一、发病机理

病原菌自鼻咽部侵入人体，如人体免疫力强，则可迅速将病原菌杀灭，或成为带菌状态；若体内缺乏特异性杀菌抗体，或细菌毒力较强时，则病菌可从鼻咽部黏膜进入血液，发展为败血症，继而累及脑脊髓膜，形成化脓性脑脊髓脑炎。

诊断与鉴别诊断二、临床表现（1）突然寒战、高热、恶心、呕吐、流涕、鼻塞、咽痛、全身疼痛、头痛加重。（2）面色苍白、四肢发凉、皮肤发花并有散在的小出血点、唇周及指端青紫、唇周单纯疱疹。（3）烦躁不安、谵妄、昏迷或惊厥。（4）皮肤、黏膜瘀点典型或融合成瘀斑，血压明显下降、脉搏细速、脉压差缩小。（5）颈项强直、角弓反张、克氏征和布氏征阳性。（6）瞳孔大小不等、边缘不整、对光反应迟钝、眼球常凝视。（7）呼吸快慢及深浅不均或呼吸暂停。（8）幼儿发病多不典型，常见高热、呕吐、嗜睡外，还多见极度不安与惊厥、拒乳、尖叫、腹泻、咳嗽、双目凝视、颈项强直和布氏征阳性，其他脑膜刺激征可能缺项。前囟未闭者多见隆起，呕吐频繁而失水者也可出现囟门下陷。

诊断与鉴别诊断三、诊断

中华人民共和国国家标准GB16884-1997，规定了流行性脑脊髓膜炎诊断标准及处理原则。诊断原则（1）应根据流行病学资料和临床表现及实验室检验结果做出临床诊断。（2）确诊需要培养Nm或检测Nm群特异多糖抗原或Nm的DNA特异片段或检测病人急性期和恢复期血清中抗Nm特异抗体。

诊断与鉴别诊断四、鉴别诊断（1）其他化脓性脑膜炎：依侵入途径可初步区别。（2）流行性乙型脑炎：其发病季节多在7～9月，脑实质损害严重，昏迷、惊厥多见，皮肤一般无瘀点。（3）虚性脑膜炎：败血症、伤寒、大叶性肺炎等急性感染病人有严重毒血症时，可出现脑膜刺激征，但脑脊液除压力稍增高外，余均正常。（4）中毒型细菌性痢疾：主要见于儿童，发病季节在夏秋季。短期内有高热、惊厥、昏迷、休克、呼吸衰竭等症状，但无瘀点，脑脊液检查正常。确诊依靠粪便细菌培养。（5）蛛网膜下腔出血：成人多见，起病突然，以剧烈头痛为主，重者继以昏迷。

内容提要流脑疾病简介流脑流行情况流脑的病原学流脑流行病学流脑诊断与鉴别诊断流脑实验室监测流脑实验室监测实验室监测病原学监测健康人带菌监测人群免疫水平监测耐药监测流脑实验室监测一、病原学监测标本采集、保存、运送及检测工作要严格遵守《病原微生物实验室生物安全管理条例》的规定。标本的运送各地市要将分离的阳性菌株送省级进行复核鉴定。一部分保存于脱脂奶中----冷冻运送。一部分保存在巧克力平板中-----冷藏运送。

巧克力平板保存：将分离的流脑阳性菌株接种于巧克力平板中，置5%C02，37℃培养24小时后保存于4度。流脑实验室监测医疗机构标本采集转运流程医疗机构防保科或医务科发现病例报告采集标本院内检验科室送达是否有能力开展检测是否院内检验科室保存1份标本自行检测另1份标本县CDC立即报告24小时内病例调查收集标本流脑实验室监测标本采集脑脊液(CSF)：如果怀疑为脑膜炎，CSF是用于分离和鉴定病原体最好的标本。取患者CSF2-3ml，注入无菌的试管内。3000转/分，离心20分钟，用无菌吸管取沉淀物直接接种到10%羊血巧克力色琼脂平皿上做细菌培养。CSF沉渣还可涂片，作革兰氏染色镜检。CSF离心后的上清液可置-20℃，供做血清学检查脑膜炎奈瑟氏菌（Nm）群特异性抗原。流脑实验室监测血液：疾病早期，病人高热时采取静脉血

5～7ml，往盛有50ml葡萄糖肉汤的三角瓶内注入3～5ml血做增菌培养。留2ml血注入无菌试管内分离血清，做血清学检查脑膜炎奈瑟氏菌（Nm）群特异抗原和急性期抗体。在病人病后1～3周采取第二次血液2ml，注入无菌试管内分离血清，检查病人恢复期抗体。若恢复期抗体的滴度比急性期升高4倍或4倍以上，具有追溯诊断的意义。流脑实验室监测淤血点：选病人皮肤上的新鲜淤斑或淤血点，消毒后用针头挑破，挤出组织液，用无菌棉签蘸取先接种含双抗的葡萄糖增菌肉汤管中增菌8~12小时后分离培养或直接接种EPV平板，再涂片染色直接镜检。涂片也可做免疫荧光检查。流脑实验室监测鼻咽拭子：对健康人群或病人密切接触者进行带菌检验时一般采咽拭子。咽拭子直接接种到10%巧克力色双抗血琼脂平皿或卵黄双抗琼脂平皿上分离Nm。咽拭子也可以插入卵黄双抗液体培养基或双抗兔血清肉汤中37℃，5%CO2增菌后再分离。流脑实验室监测尿液标本：取病人急性期尿液5ml加20ml无水乙醇，置4℃2小时，离心（3000转/分钟，15分钟），弃上清，收集沉淀部分加0.25ml磷酸盐缓冲液将其溶解，同前离心，吸取上清液检测脑膜炎奈瑟氏菌（Nm）群特异抗原。流脑实验室监测Nm的分离与鉴定1、脑膜炎双球菌为专性需氧菌，初次分离时需5~10%的二氧化碳环境才能生长，最适生长温度为37℃。2、通过菌落肉眼形态学特征来判定是否对细菌进一步研究。

巧克力色血琼脂平板：5%CO2，37℃培养24小时后，其菌落直径约1mm，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。培养时间延长，菌落增大、变成黄色、不透明、并可出现颗粒状中心和放射性周边。（巧克力色血琼脂平板）流脑实验室监测3、革兰氏染色：挑取可疑菌落作革兰氏染色。脑膜炎奈瑟氏菌（Nm）应为脑膜炎革兰氏阴性球菌，成对排列，两球面接触平坦或略向内凹，呈卵圆形和肾形或咖啡豆状。菌体直径约0.6~0.8m大小、无鞭毛、无芽胞，此菌可产生自溶酶涂片检查可常见破碎的菌体。在光学显微镜下，脑膜炎球菌和淋球菌不容易分辩。细菌染色的基本步骤为涂片—›干燥

—›固定—›染色。涂片：取一张清洁无油脂的载玻片，加上一环生理盐水，用灭菌的接种环取菌落少许，与生理盐水混匀，涂布成薄膜。干燥：一般在室温中使自然干燥。若须加速干燥，可在火焰上方的热空气中加温干燥，但切勿紧靠火焰，以免标本烤焦，不堪检视。固定：一般用加热法，即将涂片迅速通过火焰2～3次，以玻片反面接触，热而不烫为度。初染：将结晶紫染液滴加在已固定的涂片上，染1分钟后，用水冲洗。媒染：滴加碘液，1分钟后水洗。脱色：滴加95％酒精，摇动玻片至紫色不再为酒精脱退为止（根据涂片之厚薄约需0.5～1分钟），用水冲洗。复染：滴加复红，1分钟后水洗，待干，镜检。在光学显微镜下观察：（革兰染色，放大1000倍）流脑实验室监测4、生长及抗原特性：绝大多数Nm菌株分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。不分解蔗糖、果糖和乳糖。过氧化酶和氧化酶阳性。（1）生化管：每一种糖接种之间要将灭菌环灭菌。置37℃培养24小时观察结果。若不发酵时，应连续观察7天。（2）氧化酶试验：可用市售氧化酶试剂或新鲜配制的氧化酶试剂。用牙签挑取一部分待检菌落涂布到滤纸片上，再滴上试剂，阳性者立即出现红色，并且以后颜色逐渐加深。Nm菌株分解葡萄糖和麦芽糖，生化反应管颜色变为黄色不分解蔗糖和乳糖，生化反应管颜色不变流脑实验室监测5、血清分型鉴定（玻片凝集试验）（1）目的是应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。（2）材料①待检的Nm菌株纯培养物。流脑实验室监测②Nm诊断血清。多价I（包含A，B，C，D群），多价Ⅱ〔包含1889（Y），1890（H），1892（29E）〕，多价Ⅲ［包含319（W135），1916（X），1486（I），1811（K）群］及各群单价血清，共计14种。③洁净载玻片。④生理盐水。流脑实验室监测（3）试验方法①先将诊断血清按说明书稀释成所需的浓度，滴一滴在洁净的玻片上。②用白金耳刮取具有脑膜炎奈瑟氏菌典型形态及生化特性的待检菌苔少许，在玻片上蘸取少量血清，在一旁研磨均匀，再与血清混匀。③轻轻摇动玻片数次，在1～2min内出现明显凝集者，即为阳性。④检查从病人分离的疑似Nm时，先试A群血清，若不与其发生凝集，则试用B或C群血清，仍不凝集时，则试用多价Ⅱ或多价Ⅲ血清。若发生凝集，再用单价血清定群。⑤在玻片上与各群诊断血清、盐水或正常兔血清皆发生凝集者，即定为自凝菌。

检测时应注意：从病人分离的疑似Nm对现有诊断血清皆不凝集者则应作进一步检查或送有条件研究单位进一步鉴定。流脑实验室监测菌种保存（1）保温运送：脑膜炎双球菌对温度较为敏感，温度过低或过高均可导致菌株死亡。在运送样品及培养物（葡萄糖肉汤或平板培养基）时，应保持样品处于20－36℃之间，切记不能低温运送（检测抗体的血清标本除外）。（2）分离出脑膜炎双球菌的保存与运送：将鲜牛奶煮沸三次，每次煮沸后冷却，去除奶液上层的油脂（奶液上层的奶皮），8磅15分钟高压后分装成小管。将脑膜炎双球菌挑入含1ml脱脂牛奶中，将菌