大鼠皮层神经元细胞原代培养课件

皮层神经元细胞原代培养

☞主要内容:

实验原理1

准备工作2

实验步骤3

影响因素4实验原理◆细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一。可分为原代培养和传代培养两种。◆原代培养：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。仪器、材料与试剂无菌操作台，培养箱实验仪器

培养板，青霉素瓶，离心机，计数板冰盒，滤器（200目自制），手术器械新生鼠

DMEMF12培养基（20%血清），025%胰酶多聚赖氨酸，碘酒，75%酒精，PBS，阿糖胞苷

实验准备材料与试剂

实验准备实验前准备工作培养板包被培养基，阿糖胞苷配制制备冰盒0.1%多聚赖氨酸包被胰酶消化法1准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒30分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手及台面。2布局：点燃酒精灯，安装吸管帽；准备离心管；

平皿及器械放置妥当。

实验步骤

实验步骤布局酒精PBS冰盒PBSPBS器械剥离血管及筋膜取脑，分离皮层神经元清洗血液断头剪碎组织块3断头取脑：超净台内，断头取脑，置于盛有PBS的培养皿内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于无菌的生理盐水冰浴上。4剥离软脑膜：剥离大脑皮层至预冷的PBS中，用两把无齿弯镊仔细剥离软脑膜和血丝，剥离干净后用PBS液洗2-3遍。

实验步骤5剪碎：将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗三次，转移至离心管中离心1000rpm5min。6消化：加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。

实验步骤7终止消化：用含20%血清的DMEM-F12培养液终止消化，轻轻用吸管吹打均匀，离心1000rpm10min。8过筛网：弃去上清液，加入20%血清的DMEM-F12培养液，轻轻用吸管吹打均匀，200目尼龙网过滤。

实验步骤9细胞计数：4个大方格内细胞总数

──────────×10４×n(稀释倍数)

4

10种板：以5×105个/ml接种于用多聚左旋赖氨酸包被过的培养板内，培养板置细胞培养箱中37℃、5%CO2、饱和湿度下进行培养

实验步骤5纯化：培养48小时全量换液，加入终浓10μmol/l阿糖胞苷的培养液。目的：抑制质细胞等非神经元细胞的生长。

实验步骤培养基材料剥膜包被消化低温操作

影响因素材料选择

影响因素胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆★易于操作★有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生影响因素培养基选择不建议血清培养1血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，影响神经元产量；2抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验；3血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。4neurobasal和neurbasal-A被认为是最标准，最好的培养基。需要的添加剂为B27和谷氨酰胺。影响因素培养板选择6孔板是最佳选择大于6孔板（比如6CMDISH）会使得中间很难和周围的细胞密度一样，造成板中间和边缘成熟度不一样，而这会给实验带来很大干扰。96孔或128孔：细胞会倾向于向中间集中也会照成发育不均匀影响因素重点剥膜吹打时候