荧光光谱知识

荧光光谱知识荧光光谱知识荧光光谱知识荧光光谱知识编制仅供参考审核批准生效日期地址：电话：传真:邮编:荧光光谱教程一、化学发光反应的类型1．直接化学发光和间接化学发光化学发光反应可分直接发光和间接发光。直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。表示如下：式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C*，当C*跃迁回基态时，辐射出光子hv。间接发光是被测物A或B通过化学反应后生成初始态C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F，使F处于激发态，当F*跃迁回基态时，产生发光。如下式表示式中C*为能量给予体，而F为能量接受体。例如，用罗丹明B－没食子酸的乙醇溶液测定大气的O3，其化学发光反应就属这一类型。没食子酸被O3氧化时吸收反应所产生的化学能，形成受激中间体A*，而A*又迅速将能量转给罗丹明B，并使罗丹明B分子激发，处于激发态的罗丹明B分子回到基态时，发射出光子。该光辐射的最大发射波长为584nm。2.气相化学发光和液相化学发光按反应体系的状态来分类，如化学发光反应在气相中进行称气相化学发光，在液相或固相中进行称液相或固相化学发光，在两个不同相中进行则称为异相化学发光。本节主要讨论气相和液相化学发光，其中液相化学发光在痕量分析中更为重要。（1）气相化学分光主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、NO2、H2S、SO2和CO等。☆臭氧与乙烯的化学发光反应机理是O3氧化乙烯生成羰基化合物的同时产生化学发光，发光物质是激发态的甲醛。这个气相化学发光的最大波长为435nm，发光反应对O是特效的，线性响应范围为1ng·mL-1～1μg·mL-1。☆一氧化氮与臭氧的气相化学发光反应有较高的化学发光效率，其反应机理为：这个反应的发射光谱范围为600～875nm，灵敏度可达1ng·mL-1。若需同时测定大气中的NO2时，可先将NO2还原为NO，测得NO总量后，从总量中减去原试样中NO的含量，即为NO2的含量。☆SO2、NO、CO等都能与氧原子进行气相化学光反应，他们的反应分别为：此反应的最大发射波长为200nm，测定灵敏度可达1ng·mL-1。发射光谱范围为400～1400nm，测量灵敏度可达1ng·mL-1。发射光谱范围为300～500nm，测定灵敏度可达1ng·mL-1。这些反应的关键是要求有一个稳定的氧原子源，一般可由O3在1000℃的石英管中分解为O2和O而获得。☆火焰化学发光，氮的氧化物（如NO2、NO等）及挥发性的硫化物（如SO2、H2S、CH3SH等）富氢火焰中燃烧都会发生化学发光。（2）液相化学发光用于这一类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉碱等，其中鲁米诺（Lominol）化学发光反应机理研究得最久，其化学发光体系已用于分析化学测量痕量的H2O2以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg和Th等金属离子。鲁米诺是3-氨基苯二甲酰肼，它产生化学发光反应的为～。鲁米诺在碱性溶液中形成叠氮醌（a），叠氮醌在碱性溶液中与氧化剂如H2O2作用生成不稳定的桥式六员环过氧化物中间体（b）。然后再转化为激发态的氨基邻苯二甲酸根离子（c），其价电子从第一电子激发态的最低振动能级层跃迁回基态中各个不同振动能级层时，产生最大发射波长为425nm的光辐射，整个反应历程可表示如下：以上的化学发光反应的速率很慢，但某些金属离子（如在本节开始所提到的金属离子）会催化这一反应，增强发光强度。利用这一现象可以测定这些金属离子。还可将分析物通过酶的转化，生成化学发光反应物，然后再进行化学发光反应，根据化学发光强度间接测定被分析物。例如，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下进行氧化反应，反应产物H2O2可通过鲁米诺化学发光反应进行测定，从而间接测定葡萄糖。氨基酸的测定也一样：H2O2使鲁米诺发光。如果使酶促反应的底物浓度一定，则上述反应可用于酶测定或酶动力学研究。下表中给出其他用于液相化学发光反应的发光试剂：俗名洛粉碱（Lophine）光泽精（Lucigenin）没食子酸（Ⅰ）系统命名2,4,5－三苯基咪唑N,N－二甲基二丫啶硝酸盐焦性没食子酸（Ⅱ）结构式二、化学发光的基本原理某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发到激发态，受激分子由激发态去激化跃迁回基态时以辐射形式发射出一定波长的光。这种吸收化学能使分子激发并发光的过程，称为化学发光。利用化学发光建立起来的分析方法称为化学发光分析法。化学发光也发生在某些生物体系内，称为生物发光。化学发光分析法的特点是，灵敏度高，选择性好，仪器设备简单，分析速度快。但是目前可供发光用的试剂还不多，应用还有限，发光机理有待进一步研究。化学发光是基于化学反应所提供的化学能使分子激发而发射光的，任何一个化学发光反应都包含有化学激发和发光两个关键过程，它必须满足下列条件：1．化学反应必须提供足够的激发能，激发能的主要来源是反应焓，能在可见光范围内发生化学发光的物质，其激发能ΔE通常是在150～400KJ·mol－1范围。许多氧化还原反应的反应焓与此相当，因此大多数化学发光反应为氧化还原反应。2．要有有利的化学反应历程，使反应产生的化学能用于不断地产生激发态分子。对于有机化合物的液相化学发光来说，芳香族化合物和羰基化合物更容易生成激发态的产物。3．激发态分子跃迁回基态时，要能释放出光子，或激发态分子能将能量转移给另一种分子，使该分子受激后发射光子。总之，激发态分子不能以热的形式损失能量。化学发光反应的化学发光效率，又称为化学发光的总量子产率。它决定于生成激发态产物分子的化学激发效率和激发态分子的发射效率。定义为：化学反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由参加反应物质的化学反应所决定。每一个化学发光反应都有其特征的化学发光光谱及不同的化学发光效率。化学发光反应的发光强度ICl以单位时间内发射的光子数表示，它与化学发光反应的速率有关，而反应速率又与反应分子浓度有关。可以下式表示：式中表示t时刻的化学发光强度，是与分析物有关的化学发光效率，dc/dt是分析物参加反应的速率。如果反应是一级动力学反应，t时刻的化学发光强度与该时刻的分析物浓度成正比，就可以通过检测化学发光强度来定量测定分析物质。在化学发光分析中通常用峰高表示发光强度，即峰值与被分析物浓度成线性关系。另一种分析方法是利用总发光强度与分析物浓度的定量关系。就是在一定的时间间隔里对化学发光强度进行积分，得到：如果取t1=0，t2为反应结束所需的时间，则得到整个反应产生的总发光强度，它与分析物浓度存在线性关系。三、化学发光分析的应用化学发光分析最大的特点是灵敏度高，对气体和痕量金属离子的检出限都可达ng·mL－1级。在环境检测中化学发光法比吸收光谱法和微库仑法具有更高的灵敏度，又能进行快速连续分析，因此气相化学发光反应已广泛用于空气中有害物质如O3、氮氧化物、CO、SO2、H2S等的监测。其测定灵敏度可达1～3ng·mL－1。液相化学发光反应，如鲁米诺、光泽精、没食子酸等发光体系可测定天然水和废水中的金属离子。在医学、生物学、生物化学和免疫学研究中，化学发光分析也是一种重要的手段。表～列举了一些实例。四、荧光和磷光分析法的基本原理第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家，他于1575年提到，在含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天蓝色。以后逐步有一些学者也观察和描述过荧光现象，但对其本质及含义的认识都没有明显的进展。直到1852年，对荧光分析法具有开拓性工作的Stokes在考察奎宁和绿色素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，而不是由光的漫反射引起的，从而导入荧光是光发射的概念，并提出了“荧光”这一术语，他还研究了荧光强度与荧光物质浓度之间的关系，并描述了在高浓度或某些外来物质存在时的荧光猝灭现象。可以说，他是第一个提出应用荧光作为分析手段的人。1867年，Goppelsrde应用铝一桑色素配位化合物的荧光测定铝，这是历史上首次进行的荧光分析工作。进入二十世纪以来，荧光现象被研究得更多了，在理论和实验技术上都得到极大的发展。特别是近几十年来，在其他学科迅速发展的影响下，随着激光、计算机和电子学的新成就等一些新的科学及技术的引入，大大推动了荧光分析法在理论上及实验技术上的发展，出现了许多新的理论和新的方法。在我国，二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作者从事荧光分析方面的研究工作。到了七十年代以后，已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队伍。目前，研究内容已从经典的荧光分析方法扩展到新近发展起来的一些新方法和新技术。磷光也是某些物质在紫外光照射下所发射的光，早期并没有与荧光明确的区分。1944年Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念，指出磷光是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光，它有别于从激发单重态跃迁回基态所发射的荧光。磷光分析法由于其有某些特点，几十年来的理论研究及应用也不断得到发展。五、荧光和磷光的产生在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发为激发态。激发态是很不稳定的，它将很快地释放出能量又重新跃迁回基态。若分子返回基态时以发射电磁辐射(即光)的形式释放能量，就称为“发光”。如果物质的分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。现从分子结构理论来讨论荧光和磷光的产生机理。每个分子中都具有一系列严格分立相隔的能级，称为电子能极，而每个电子能级中又包含有一系列的振动能级和转动能级。分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外，还包含有电子的多重态，用M=2S+1表示，S为各电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。若分子中所有电子都是自旋配对的，则S=0，M=1，该分子便处于单重态(或叫单重线)，用符号S表示。大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中，不发生自旋方向的变化，这时仍然是M=1，分子处于激发的单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这时分子中便具有两个自旋不配对的电子，即S=1，M=3，分子处于激发的三重态，用符号T表示。图为电子重态示意图。处于分立轨道上的非成对电子，自旋平行要比自旋配对更稳定些(洪特规则)，因此在同一激发态中，三重态能级总是比单重态能级略低。图为能级及跃迁示意图，其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态；T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。图

单重态系三重态激发示意图图

荧光和磷光体系能级图处于激发态的分子是很不稳定的，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁的形式去活化(去激发)释放出多余的能量而返回基态。辐射跃迁主要涉及到荧光，延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁是指以热的形式释放多余的能量，包括振动弛豫、内部转移、系间跨越及外部转移等过程。图表示分子激发和去活化的能量传递过程：1．振动弛豫（Vibrationrelaxation，简写为VR）当分子吸收光辐射(为图中的λ1、λ2)后可能从基态的最低振动能级(V=0)跃迁到激发单重态Sn(如图中S1、S2)的较高振动能级上。然后，在液相或压力足够高的气相中，分子间的碰撞几率很大，分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周围环境，而自身从激发态的高振动能级跃迁至该电子能级的最低振动能级上，这个过程称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间为10－12s数量级。2．内部转移（Internalconversion，简写为IC）当高电子能级中的低振动能级与低电子能级中的高振动能级发生重叠时，常发生电子从高电子能级以无辐射跃迁形式转移至低电子能级。如图中，S2和T2中的低振动能级与S1和T1中的高振动能级重叠，电子可以通过振动能级的重叠从S2跃迁至S1，或从T2跃迁至T1。这个过程称为内部转移。内部转移的时间为10－11s～10－13s数量级。振动弛豫及内部转移的速率比由高激发态直接发射光子的速率快得多，所以，分子吸收辐射能后不管激发到哪一个激发单重态，都能通过振动弛豫及内部转移而跃迁到最低(第一)激发单重态的最低振动能级。3．荧光发射（Fluorescenceemission，FE）处于激发单重态的电子经振动弛豫及内部转移后到达第一激发单重态(S1)的最低振动能级(V=0)后，以辐射的形式跃迁回基态(S0)的各振动能级，这个过程为荧光发射，发射的荧光波长为。由于经过振动弛豫和内部转移的能量损失，因此荧光发射的能量比分子吸收的能量要小，荧光发射的波长比分子吸收的波长要长，即。第一激发单重态最低振动能级的平均寿命约为10－9～10－4s，因此荧光寿命也在这一数量级。4．系间跨跃（IntersystemCrossing，ISC）系间跨跃是指不同多重态之间的无辐射跃迁过程，它涉及到受激发电子自旋状态的改变。如由第一激发单重态S1跃迁至第一激发三重态T1，使原来两个自旋配对的电子不再配对。这种跃迁是禁阻的(不符合光谱选律)，但如果两个能态的能层有较大重叠时，如图中S1的最低振动能级与T1的较高振动能级重叠，就有可能通过自旋一轨道耦合等作用实现这一跃迁。系间跨跃的速度较慢，经历的时间较长。5．磷光发射（Phosphorescenceemission，PE）激发态的电子经系间跨跃后到达激发三重态，经过迅速的振动弛豫而跃迁至第一激发三重态的最低振动能级，然后以辐射形式跃迁回基态的各振动能级，这个过程为磷光发射。磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻的，所以发光速度很慢。磷光的寿命为10－4～100s。因此，外光源照射停止后，磷光仍可持续一短时间。由于经过系间跨跃及T1中振动弛豫丢失了一部分能量，所以磷光波长比荧光波长要长，即必须指出的是，T1还可能通过热激发而重新跃回S1即T1S1，然后再由S1经辐射跃迁回S0，即S1S0，发出荧光，这种荧光称为延迟荧光，其寿命与磷光相近，但波长比磷光短。6．外部转移（Externalconvertion，EC）激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子相互碰撞，并发生能量转移的过程称为外部转移。外部转移能使荧光或磷光的强度减弱甚至消失，这种现象称为猝灭或熄灭。六、激发光谱和发射光谱荧光和磷光均属于光致发光，所以都涉及到两种辐射，即激发光(吸收)和发射光，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。它们是荧光和磷光定性和定量分析的基本参数及依据。1.激发光谱通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(即强度)随激发光波长的变化而获得的光谱，称为激发光谱。激发光谱的具体测绘方法是，通过扫描激发单色器，使不同波长的入射光照射激发荧光(磷光)体，发出的荧光(磷光)通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上，检测其荧光(磷光)强度，最后通过记录仪记录光强度对激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。通过激发光谱，选择最佳激发波长——发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长，常用λex表示。2.发射光谱，也称荧光光谱或磷光光谱通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(强度)随发射光波长的变化而获得的光谱，称为发射光谱。其测绘方法是，固定激发光的波长，扫描发射光的波长，记录发射光强度对发射光波长的关系曲线，即为发射光谱。通过发射光谱选择最佳的发射波长——发射荧光(磷光)强度最大的发射波长，常用λem表示。磷光发射波长比荧光来得长，图为萘的激发光谱及荧光和磷光的发射光谱。图

萘的激发光谱、荧光和磷光光谱3.荧光激发光谱和发射光谱的特征★斯托克斯位移在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光发射波长总是大于激发波长，λem>λex。Stokes于1852年首次发现这种波长位移现象，故称Stokes位移。斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存在着一定的能量损失。激发态分子由于振动弛豫及内部转移的无辐射跃迁而迅速衰变到S1电子激发态的最低振动能级，这是产生其位移的主要原因；其次，荧光发射时，激发态的分子跃迁到基态的各振动能级，此时，不同振动能级也发生振动弛豫至最低振动能级，也造成能量的损失；第三，溶剂效应和激发态分子可能发生的某些反应，也会加大斯托克斯位移。★荧光发射光谱的形状与激发波长无关由于荧光发射是激发态的分子由第一激发单重态的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级所产生的，所以不管激发光的能量多大，能把电子激发到哪种激发态，都将经过迅速的振动弛豫及内部转移跃迁至第一激发单重态的最低能级，然后发射荧光。因此除了少数特殊情况，如S1与S2的能级间隔比一般分子大(如)及可能受溶液性质影响的物质外，荧光光谱只有一个发射带，且发射光谱的形状与激发波长无关。★荧光激发发光谱与吸收光谱的形状相近似，荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系

物质的分子只有对光有吸收，才会被激发，所以，从理论上说，某化合物的荧光激发光谱的形状，应与它的吸收光谱的形状完全相同。然而实际并非如此，由于存在着测量仪器的因素或测量环境的某些影响，使得绝大多数情况下，“表观”激发光谱与吸收光谱两者的形状有所差别。只有在校正仪器因素后，两者才非常近似，而如果也校正了环境因素后，两面的形状才相同。如果把某种物质的荧光发射光谱和它的吸收光谱相比较低，便会发现两者之间存在着“镜像对称”关系。如图分别表示苝的苯溶液和硫酸奎宁的稀硫酸溶液的吸收光谱和荧光发射光谱。为什么两种光谱会互为镜像关系呢这不难由荧光发射光谱和吸收光谱的成因来解释。吸收光谱中的第一吸收带(波长较长的吸收带)是由于基态分子吸收光能量被激发到第一电子激发态的各不同振动能级，所以，其形状取决于第一电子激发态中各振动能级的分布情况(即能量间隔情况)，而荧光光谱是激发态分子从第一电子激发单重态的最低振动能级跃回基态中的各不同振动能级所致，所以荧光光谱的形状取决于基态中各振动能级的分布情况。一般情况下，基态和第一电了激发单重态中振动能级的分布情况是相同的，所以荧光发射光谱与吸收光谱的形状是类似的。图

镜像对称规则另一方面，吸收时由基态的最低振动能级跃迁到第一电子激发态的各振动能级，振动能级越高，所吸收的能量越大，即吸收峰的波长越短；而相反，荧光发射是由第一电子激发单重态的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级，振动能级越大，所释放的能量越小，即发射的荧光峰波长越长。另外，由于电子跃迁的速率非常之快，以致于跃迁过程中分子中原子核的相对位置没有明显发生变化，其结果是，假如吸收时由S0的V=0与第一激发态S1的V=2之间的跃迁几率最大(即强度最大)，那么在荧光发射时，由S1的V=0跃回S0的V=2的几率也应该最大，如图所示。基于上述原因，荧光发射光谱与吸收光谱之间显现镜像对称关系。七、有机化合物的荧光在已知大量的有机化合物当中，仅有一小部分会发射强的荧光，这与有机化合物的结构密切相关。能发射强荧光的有机化合物通常具有以下的结构特征√：1.具有电子跃迁类型的结构实验表明，大多数能发荧光的化合物都是由或跃迁激发，然后经过振动弛豫等无辐射跃迁，再发生或跃迁而产生荧光。而其中吸收时跃迁的摩尔吸光系数比跃迁的大102～103倍，跃迁的寿命(10－7～10－9)比跃迁的寿命(10－5～10－7)短，因此荧光发射的速率常数Kf值较大，荧光发射的效率高。因此，跃迁发射荧光的强度大。此外，在跃迁过程中，通过系间跨跃从单重态跃迁至三重态的速率常数KISC也比较小，有利于荧光的发射。总之，跃迁的类型是产生荧光的最主要跃迁类型。2.具有大的共轭π键结构发生荧光(或磷光)的物质，其分子都含有共轭双键(π键)的结构体系。共轭体系越大，电子的离域性越大，越容易被激发，荧光也就越容易发生，且荧光光谱向长波移动。大部分荧光物质都具有芳环或杂环，芳环越大，其荧光(或磷光)峰越向长波移动，且荧光强度往往也较强。例如苯和萘的荧光位于紫外区，蒽位于蓝区，丁省位于绿区，戊省位于红区,见表。同一共轭环数的芳族化合物，线性环结构者的荧光波长比非线性者要长，如蒽和菲，其共轭环数相同，前者为线性环结构，后者为“角”形结构，前者λem为400nm，后者λem为350nm。3.具在刚性平面结构实验发现，多数具有刚性平面结构的有机化合物分子都具有强烈的荧光，因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其他溶质分子之间的相互作用减少，即可减少能量外部转移的损失，有利于荧光的发射。而且平面结构可以增大分子的吸光截面，增大摩尔吸光系数，增强荧光强度。酚酞与荧光黄(亦称荧光素)的结构十分相近(下图所示)，只是由于荧光黄分子中的氧桥使其具有刚性平面结构，因而在溶液中呈现强烈的荧光，在·L-1的NaOH溶液中，荧光效率达，而酚酞却没有荧光。又如芴与联二苯(下图所示)，由于芴中的亚甲基使分子的刚性平面增加，导致两者在荧光性质上的显著差别，前者荧光产率接近于1，后者仅为。萘与维生素A都具有5个共轭π键(下图所示)，而前者为平面结构，后者为非刚性结构，因而前者的荧光强度为后者的5倍。八、无机化合物的荧光无机化合物的荧光有无机盐类的荧光和金属螯合物的荧光两种：★某些无机盐类的荧光无机化合物本身能发荧光(或磷光)的不多，常见的主要有镧系元素(Ⅲ)的化合物，U(Ⅵ)化合物，类汞离子化合物Tl(Ⅰ)、Sn(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、As(Ⅲ)、Sb(Ⅲ)、Bi(Ⅲ)、Se(Ⅳ)、Te(Ⅳ)等，以及某些过渡金属离子，如Cr(Ⅲ)等。这些化合物在低温(液氮)下都有较高的荧光效率和选择性，因此常用低温荧光法进行测定。★金属螯合物的荧光不少不发荧光的无机离子与具有吸光结构的有机试剂发生配合作用，生成会发荧光的螯合物，可以进行荧光测定。这种能发荧光的螯合物可能是螯合物中配位体的发光，也可能是螯合物中金属离子的发光。●螯合物中配位体的发光。这一类螯合物中金属离子的外电子层具有与惰性气体相同的结构，为抗磁性的离子，它与含有芳基的有机配位体形成螯合物时多数会发射较强的荧光。这是因为原来的配位体虽有吸收光构型，但其最低激发单重态的S1是n—型，及缺乏刚性平面结构，所以并不发荧光，而与金属离子配合后，配位体变为最低激发单重态的—型，且由于螯合物的形成，而具有刚性平面结构，因此能发射荧光。如下列例子所示●螯合物中金属离子的荧光。这些金属离子的次外层中具有未充满电子的d轨道或f轨道，它们吸收光时，会发生或的吸收跃迁。也会发生或的发光跃迁，但跃迁几率很小，吸光及发光很弱。当与配位体螯合时，则首先是发生配位体的吸收跃迁，而通常金属离子的或能层在配位体激发后最低激发单重态S1能层的下方，因而可以发生能量的转移，由S1转移给或，然后发生或跃迁，使跃迁几率增大，发光强度增大。九、荧光（或磷光）量子产率激发态分子的去激发包括两种过程，即无辐射跃迁过程和辐射跃迁过程，辐射跃迁可发射荧光(延迟荧光)或磷光。而有多少比例的激发分子发射出荧光(或磷光)呢。可以用荧光量子产率--有时也叫荧光效率或荧光产率(或磷光量子产率)表示。定义为：荧光物质吸光后所发射荧光的光量子数与所吸光的光量子数之比，即：许多吸光物质并不能发射荧光，这是因为激发态分子的去激发过程中，除发射荧光(磷光)外，还有无辐射跃迁过程与之竞争。所以，荧光量子产率与其他各种过程的速率常数有关。表列出分子吸光及去激发的过程及速率常数。因此，可以表示为：式中，ΣKi为无辐射跃迁各种过程的速率常数之和，即ΣKi＝KIC＋KISC＋KQ[Q]。从上式可以看出，凡是能使Kf值升高而使其它Ki值降低的因素，都可以提高量子产量，增强荧光。对于高荧光分子(如荧光素)来说，接近于1，说明该分子的Kf较大，ΣKi相对于Kf可忽略不计。一般荧光物质小于1，不发荧光的物质Kf为0，＝0。一般说来，Kf主要取决于化学结构(上节已叙述)，Ki则主要取决于化学环境的因素，同时也与化学结构有关。从各种速率常数还可以得到荧光寿命τf:磷光的量子产率与荧光量子产率相似。十、荧光强度与荧光物质浓度的关系荧光强度If正比于吸收的光量(光强)Ia及荧光量子产率：If=Ia吸收的光量(光强)Ia应为入射光的光强I0与透射光的光强It之差，即：Ia＝I0－It根据吸收定律(朗伯-比耳定律)：所以：式中，ε为摩尔吸光系数，b为样品溶液的光程(即液池的厚度)，C为样品的摩尔浓度。而的展开式为：当浓度C很稀，吸收光量不超过总光量的2％时，(约为，则展开式的高次项可忽略，即：所以：当I0及b一定时：If＝KC上式表明，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分析法定量分析的依据。但是，应该注意的是，此式只适合于荧光物质的稀溶液。当C较大，时，线性关系将受到破坏。其原因是受激后的激发态分子与体系中的其他分子所碰撞，使其以非辐射击跃迁的形式去激化，产生荧光猝灭，或者激发态分子所发射的荧光被没受激发的分子所吸收，而又因一般小于1，所以发生所谓的“自吸收”现象而使荧光减弱。为了减少碰撞去激发的机会，可以用降低温度，增大溶液粘度或把荧光(磷光)物质附着在固体支撑物测定的方法，以减少猝灭效应。［特别要指出的是磷光发射，因其平均寿命较长，碰撞去激发的效应更大，所以常采用低温磷光或固体磷光方法。］十一、影响荧光强度的环境因素√影响荧光强度的因素除了荧光物质的本身结构及其浓度以外，环境也是一个很重要的因素，主要是溶剂、温度、介质酸度、氢键的形成及其它的因素。1.溶剂的影响同一种荧光体在不同的溶剂中，其荧光光谱和荧光强度都可能会有显著的差别，尤其是那些在芳环上含有极性取代基的荧光体，它们更容易受到溶剂的影响。溶剂的影响一般分为一般的溶剂效应和特殊的溶剂效应。●一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。这种影响是普遍存在的。一般情况下，折射率加大，将使荧光光谱的Stokes位移减少，而介电常数加大，将使Stokes位移加大，且荧光效率提高。●特殊溶剂效应指的是荧光体与溶剂分子的特殊化学作用，如氢键的形成和某些化合作用。特殊溶剂效应对荧光光谱及强度的影响往往大于一般溶剂效应。对于荧光发射的主要电子跃迁类型跃迁来说，电子激发态比基态具有更大的极性，所以随着溶剂极性的增大，对激发态比对基态产生更大的稳定作用，因此降低了跃迁的能量，荧光光谱发生红移，而且荧光增强。表为8-巯基喹啉在几种不同溶剂中荧光特性。但应该注意到一些相反的情况，如苯胺萘磺酸类化合物随溶剂极性的增大，光谱发生蓝移，且强度降低。如果溶剂分子与荧光物质形成氢键，将使荧光峰明显红移，荧光强度一般增大。如果溶剂分子和荧光物质形成化合物，或溶剂使荧光物质的电离状态或存在型体发生变化，则荧光峰位置和强度都会发生较大的变化。此外，在含有重原子的溶剂(如碘化乙酯、二碘烷、溴化正丙酯等)中，一般也使荧光体的荧光强度降低，而使磷光强度升高，这种现象称为“外重原子效应”。溶剂中重原子的高核电荷引起溶质分子的自旋与轨道之间强烈的耦合作用，结果使的系间跨跃、磷光发射及的系间跨跃等过程的几率增大。因此荧光削弱，而磷光增强。2.温度的影响温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。通常，随着温度的增高，荧光物质溶液的荧光量子产率及荧光强度将降低，图为不同温度下邻菲啰啉的荧光光谱。图

不同温度下邻菲啰啉的荧光光谱（在邻二苯中）当溶液不存在猝灭剂时，荧光的量子产率与去激化的辐射跃迁过程及非辐射跃迁过程的相对速率有关。一般认为辐射过程速率不随温度变化，因此，荧光量子产率的变化反映了非辐射跃迁过程速率的变化。随着溶液温度的升高，介质粘度降低，分子运动速率也变大，从而使荧光分子与溶剂分子或其它分子的碰撞几率增加，外部能量转移速率变大。因此，荧光量子产率降低。溶液温度上升而使荧光强度降低的另一个主要原因是分子的内部能量转化作用。多原子分子的基态和激发态的位能曲线可能相交或相切于一点，如图所示。图

内部能量转化的位能曲线当激发态分子接受到额外热能而沿激发位能曲线AC移动至交点C时，有可能转换至基态的位能曲线NC，使激发能转化为基态的振动能，随后通过振动弛豫而丧失振动能量。3．介质酸度的影响带有酸性基团或碱性基团的大多数芳香族化合物，其荧光特性都与溶液的酸度(pH)有关。这是因为在不同酸度介质条件下，荧光体的存在型体不同，不同的型体(分子与其离子)在电子构型上有所不同，而且基态和激发态所表现出来的酸、碱性也有所差别。因此不同酸度下，荧光光谱和荧光强度都可能发生变化。所以在荧光分析中一般都要较严格地控制溶液的pH值。下列为两个实例：利用金属离子与有机试剂反应生成螯合物而进行荧光测定时，也受到溶液pH的影响。一方面pH会影响螯合物的生成和稳定性，另一方面还可能影响螯合物的组成，因而影响它们的荧光特性。例如，Ga3+与2，2’-二羟基偶氮苯在pH3-4溶液中生成1：1的配合物，它能发射荧光；而在pH6-7溶液中则生成1：2的配合物，它不发射荧光。4.形成氢键的影响荧光物质与溶剂分子或其他溶质分子所形成的分子间氢键可能有两种情况：一种是在激发之前荧光体的基态所形成的氢键，这种情况一般使摩尔吸光系数ε增大，即吸收增强，因此荧光强度增大。同时也可能发生分子极性及共轭程度的变化，因此吸收光谱(荧光激发光谱)及荧光发射光谱都可能发生变化。另一种情况是激发之后荧光体的激发态所形成的氢键，所以吸收光谱(激发光谱)不受影响，而荧光发射光谱会发生变化。5.其他方面影响表面活性剂的存在对荧光光谱及强度都会产生影响。荧光体在由表面活性剂形成胶束的微环境中，不仅可以减少非辐射去激化过程和猝灭过程的速率，提高荧光量子产率，而且由于表面活性剂参与组成配合物而增大分子的有效吸光截面积，导致摩尔吸光系数的增大。因此，在胶束溶液中，荧光强度增强，测定的灵敏度提高。多元配合物的形成通常也可以增强荧光强度，提高荧光测定的灵敏度。十二、荧光的猝灭荧光的猝灭(熄灭)一词，从广义上说，指的是任何可使某给定荧光物质的荧光强度降低的作用，或者任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用。从狭义上说，指的是荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子之间的相互作用，导致荧光强度降低的现象。与荧光物质发生相互作用而使荧光强度降低的物质，称为猝灭剂。荧光猝灭的形式很多，机理也比较复杂。主要有如下几种类型：1.碰撞猝灭碰撞猝灭是荧光猝灭的主要类型之一。它指的是处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子Q相碰撞，使释放热量给环境，以无辐射的形式跃迁回基态，产生猝灭作用，这种猝灭也称动态猝灭。这一过程可以表示如下：根据荧光量子产率的定义，在无Q时的量子产率φ0及Q存在时的量子产率φq分别为:则无Q时的荧光强度(If)0及Q存在时的荧光强度(If)q之比为:式中，K称为猝灭速率常数，，可以推得，K与热力学温度T成正比，与溶液的粘度成反比。可见，碰撞猝灭效应随温度的升高而增强，而随粘度的增大而降低。2.生成化合物的猝灭生成化合物的猝灭也称为静态猝灭，它指的是基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭，可用下式表示：从上式也容易推导出荧光强度与猝灭剂平衡浓度之间的关系：式中(If)0及(If)q分别为加入猝灭剂Q之前及之后的荧光强度，CM为荧光物质的总浓度。上式与动态猝灭的关系式一样，只是常数K的意义不同。利用上面的关系式可以用于荧光猝灭法的定量分析。3.能量转移猝灭当猝灭剂吸收光谱与荧光体的荧光光谱有重叠时，处于激发单重态的荧光体激发分子的能量就可能转移到猝灭剂分子上，或者猝灭剂吸收了荧光体发射的荧光，使荧光猝灭，而猝灭剂被激发，这种猝灭俗称“内滤作用”。可用下式表示：4.氧的猝灭O2可以说是荧光和磷光的最普遍存在的猝灭剂。对于溶液磷光来说，氧的猝灭作用是十分有效的，通常观察不到溶液的室温磷光现象。而对于溶液荧光来说，不同的荧光物质或同一荧光物质在不同的溶剂中，对氧的猝灭作用的敏感性有所不同。氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，还没有一个完整的确定说法，可能包含着多种机理。有的认为可能是由于三重态的氧分子和激发单重态的荧光分子相互作用形成激发单重态的氧分子和激发三重态的荧光分子所引起的，如下式表示：也有的认为氧和其它顺磁性的物质一样，它们之所以会使荧光猝灭，是由于它们能够促进激发单重态的荧光分子的系间跨跃()以及提高荧光物质基态分子的系间吸收跃迁()的几率；还有的认为荧光猝灭是由于荧光物质受到氧化的缘故。5.转入三重态的猝灭在“重原子效应”段落已经叙述，溴化物和碘化物都能产生“重原子效应”，促使荧光分子的激发单重态转入激发三重态，导致荧光的猝灭。上面也已提及，氧的猝灭作用也可能是O2促使荧光体分子转入激发三重态所致。6.荧光物质的自猝灭当荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低，荧光强度与浓度不成线性关系，称为荧光物质的自猝灭。自猝灭可能有如下几个原因：★荧光物质分子之间的碰撞能量损失，这实际上是能量的外部转移形式。★荧光物质的自吸收，当荧光物质的吸收光谱与荧光发射光谱重叠时，会发生自吸收现象，处于S1激发态的分子发射的荧光被处于基态的分子所吸收，使荧光强度降低。★荧光物质分子的缔合。某些荧光体分子处于基态时会形成二聚体或多聚体，或者激发态分子1M*与基态分子M形成激发态二聚体1(M*M)。这些聚合物与荧光单体一般都会具有不同的荧光特性，有的使荧光强度降低甚至不发射荧光，有的使光谱发生变化。此外，还有电荷转移猝灭，光化学反应猝灭等，不一一叙述。十三、荧光分析仪荧光分析仪器与紫外-可见分光光度计的基本组成部件相同，即有光源、单色器、样品池、检测器和记录显示装置五个部分。荧光仪器的单色器有两个，分别用于选择激发波长和荧光发射波长。除了基本些部件的性能不同外，荧光仪器与紫外-可见分光光度计的最大不同是，荧光的测量通常在与激发光垂直的方向上进行，以消除透射光和杂散光对荧光测量的影响。其结构示意图如图所示。荧光分析仪的各主要部件简要分述如下：1.激发光源激发光源应具有足够的强度、适用波长范围宽、稳定等特点。常用的光源有高压汞灯和氙弧灯。●高压汞灯高压汞灯是以汞蒸气放电发光的光源，主要有365、405、436nm的三条谱线，尤以365nm谱线最强，一般滤光片式的荧光计多采用它为激发光源。●氙弧灯氙弧灯通常就叫氙灯，是目前荧光分光分度计中应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电灯，外套为石英，内充氙气，室温时其压力为506625Pa，工作时压力为2026500Pa，具有光强度大，在200～800nm范围内是连续光源的特点。氙灯的灯内气压高，启动时的电压高（20～40KV），因此使用时一定要注意安全。此外，高功率的可调谐染料激光器是一种新型的荧光激发光源。这种光源不需单色器和滤光片，具有单色性好，强度大，脉冲激光时间短而减少光敏物质的分解等优点。但是仪器设备较复杂，所以应用还不广泛。2.单色器荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器，称为荧光分光光度计。光栅有两块，第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长，第二块为发射单色器，用于选择荧光发射波长，一般是后者的光栅闪耀波长比前者来得长一些。在比较低档次的荧光计中，采用滤光片作为单色器，多使用干涉滤光片以获得纯度较好的“单色光”。第一滤光片用以分离出所需用的激发光，第二滤光片用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射的荧光。3.样品池荧光分析的样品池通常用石英材料做成，它与吸光分析法的液池不同在于，荧光样品池的四面均为磨光透明面，同时一般仅有一种厚度为1cm的液池。4.检测器简易型的荧光计可用目视检测，或用硒光电池，光电管检测。现在的荧光计多采用光电倍增管进行检测。检测器的方向应与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。在现代的高级仪器中，光导摄象管用来作为光学多道分析器（简称OMA）的检测器。它具有检测效率高、动态范围宽、线性响应好、坚固耐用和寿命长等优点。它的检测灵敏度虽不如光电倍增管，但却能同时接受荧光体的整个发射光谱。5.记录，显示装置荧光仪的读出装置有数字电压表或记录仪。现代仪器都配上计算机，进行自动控制和显示荧光光谱及各种参数。十四、荧光仪器的校正及灵敏度1.仪器的校正人们总希望仪器能记录荧光物质真实的荧光激发光谱和发射光谱，这种理想化的仪器应该是激发光源、单色器及检测器等各部分在所需要的整个波段中，性能都一样，如图所示。但是这种理想化的光学部件实际上并不存在，因此，对于一些较特殊的测定（如荧光量子产率的测定计算，动力学的某些研究等），需对实际测定的“表观光谱”进行校正，以获得真实的光谱。图

理想化仪器的光谱特性对荧光激发光谱和发射光谱的校正比较复杂，如有需要可参考有关专著。在现代仪器上，不少已在荧光分光光度计上装配有光谱校正装置。此外，杂质光对荧光测量也有明显的影响，必须注意加以清除，在不少仪器中也还有杂质光的校正装置。2.荧光仪器的灵敏度荧光分析法的灵敏度包含有两个部分：一是荧光体的本身因素，即荧光体的吸光系数及荧光量子产率；二是荧光仪器因素，它受到光源强度、稳定性、单色器的杂散光水平、光电倍增管的特性、高压电源稳定性及放大器的特性诸因素的影响。与紫外可见分光光度法比较，荧光分析法的灵敏度要高出2～4个数量级，这主要取决于仪器的因素。其一，荧光强度正比于入射光的强度，所以增大光源的强度可以提高灵敏度，降低检测限；其二，荧光的测量是在激发光的垂直方向检测的，即在暗背景中检测，所以只要较好地消除杂散光，采用较灵敏的检测器，很微弱的荧光都可以检测，所以检测限较低。而吸光分析法是在亮背景下检测透射光与入射光强度的比值，所以当强度较小时，透射光与入射光强度相差很小，因此不能准确的检测，所以检测限较高。用检测限来表示荧光法的灵敏度，在实际工作中是比较直观和方便的。荧光分析法的检测限可以有两种表示方法：一是以喹宁表示，在·L－1硫酸中，喹宁的荧光峰为450nm，当喹宁溶液很稀（如μg·L－1）时，溶剂的拉曼峰所造成的对喹宁荧光信号的噪声已相当显著。因此人们常以此时喹宁信号与仪器噪声之比的喹宁浓度定为该仪器的检测灵敏度。多数仪器的检测灵敏度为μg·L－1喹宁，有些灵敏度高的仪器可达μg·L－1喹宁；二是以水的拉曼光信噪比表示，当水分子被激发时，水分子蒙受暂时的畸变，在极短的时间内（10－12－10－15s），会向各个方向发射出与激发光波长相等的瑞利光和波长略长的拉曼光。通过测量拉曼光的信噪比可以衡量仪器的检测灵敏度。由于纯的水易得，用同一波长的光激发水分子所产生的拉曼光波长一样，便于检测，所以用拉曼光信噪比表示仪器的灵敏度已为较多的产家所采用。十五、磷光分析仪与荧光分析仪的差别磷光分析仪器与荧光分析仪器同样由五个基本部件组成，但需要有一些特殊的配件，在比较好的荧光分析仪器上都配有磷光分析的配件，因此两种方法可以用同一仪器。磷光分析仪器与荧光分析仪器的主要区别有两点。1.样品池需配有冷却装置对于溶液磷光的测定，常采用低温磷光分析法，即试样溶液需要低温冷冻。通常把试液装入内径约1-3mm的石英细管（液池）中，然后将液池插入盛有液氮的石英杜瓦瓶内，如图所示。图

低温磷光分析的样品池系统激发光通过杜瓦瓶的没有镀银的部位照射到试样上，所产生的磷光经由直角方向上的类似部位投射到发射单色器后加以检测。2.磷光镜有些物质会同时发射荧光和磷光，因此在测定磷光时，必须把荧光分离去。为此目的，可利用磷光寿命比荧光长的特点，在激发单色器和液池之间及在发射单色器和液池之间各装上一个斩波片，并且由一个同步马达带动。这种装置称为磷光镜，它有转筒式（以图14.12a）和转盘式（如图）两种类型，尤以后者更为通用。图

转筒式磷光镜(a)和转盘式磷光镜(b)这两种类型的工作原理是一样的，现以转筒式磷光镜说明之。转筒式磷光镜是一个空心圆筒，在其周围的面上有两个以上的等向距的狭缝，当马达带动圆筒旋转时，来自激发单色器的入射光断续交替地射到样品池，由试样发射的光也是断续交替（但与入射光异相）地到达发射单色器的入口狭缝。而在磷光镜从遮断激发光转到磷光镜的出光狭缝对准发射单色器的入口狭缝的瞬间，由于散射光及荧光随着激发光被遮断而消失，检测器上便只检测得磷光的信号。此外，通过调节圆筒的转速，可以测出不同寿命的磷光。十六、荧光分析法的特点1.灵敏度高前面已述，荧光分析法的灵敏度比吸光分析法高2～4个数量级，检测下限在～μg·mL－1之间。主要原因有二：一是荧光信号是在暗背景下检测的，噪声小，较微弱的信号也能被检测，且可以高倍放大；二是荧光强度和激发光强度成正比关系，可以提高激发光的光强以增大荧光强度。2.选择性好荧光分析法的光谱比较简单，特征性强，而且有激发光谱和发射光谱，选择的余地大。如果某几种物质的激发光谱相似，就可以从它们发射光谱的差异进行鉴别和分析；相反如果发射光谱相似，可以从它们激发光谱的差异进行鉴别和分析，尤其是有机化合物的分析更是如此。对于金属离子的分析来说，往往选择性不太高，这是由于金属离子的分析往往是通过产生具有荧光特性的配合物或荧光猝灭进行测定。而且荧光特性又往往取决于配位体，不同金属离子经常与同一配位体形成相似的配合物，具有相似的荧光特性，故会互相干扰。3.荧光法提供比较多的物理参数可提供包括激发光谱、发射光谱和三维光谱以及荧光强度、荧光效率、荧光寿命等多种物理参数。这些参数反映了分子的各种特性，能从不同角度提供研究对象的分子的信息。荧光分析法的缺点是应用还不够广泛，这是因为本身能发射荧光的物质相对较少，用加入某种试剂使非荧光物质转化为荧光物质来进行分析，其数量也还不多。此外，荧光分析的灵敏度高，测定时对环境因素较为敏感，干扰因素较多。十七、荧光分析法的应用荧光分析法目前还主要用于无机物和有机物的定量分析，但随着其研究的深入，在定性分析、结构分析及作为某些研究领域的手段也日渐增多，具有较为广阔的应用前景。荧光定量分析的方法主要有校正曲线法，依据荧光强度与荧光物质浓度成正比的关系，首先绘制校正曲线，再进行未知的分析；其次还有比较法，在同样条件下，测定试样溶液和一标准溶液的荧光强度，直接通过比例计算求得试样中荧光物质的含量。1.无机化合物的分析无机化合物荧光分析有直接荧光法、荧光猝灭法、间接荧光法及催化荧光法等。☆直接荧光法直接能应用无机化合物自身的荧光进行测定的为数不多，无机化合物的荧光测定主要依赖于待测元素与有机试剂所组成的能发荧光的配合物，通过检测配合物的荧光强度以测定该元素的含量。这种方法称为直接荧光法。自从1868年发现桑色素与Al3+离子反应的产物会发荧光，且可以用于铝含量的测定以来，用于荧光分析的试剂日益增多，现在可以利用有机试剂以进行荧光分析的元素已达到70多种。较常用有机试剂进行荧光法测定的元素为铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素等。☆荧光猝灭法某些元素虽不与有机试剂组成会发荧光的配合物，但它们可以从其他会发荧光的金属离子--有机试剂配合物中取代金属离子或有机试剂，组成更稳定的不发荧光配合物或难溶化合物，而导致溶液荧光强度的降低，由荧光强度降低的强度来测定该元素的含量，这种方法称为荧光猝灭法。有些情况下，金属离子与能发荧光配位体反应，生成不发荧光的配位物，导致荧光配位体的荧光猝灭，同样可以测定金属离子的含量，这也属于荧光猝灭法。可以采用该法测定的元素有氟、硫、氰离子、铁、银、钴、镍、铜、钨、钼、锑、钛等。☆间接荧光法间接荧光法常用于某些阴离子如F-、CN-等的分析，它们可以从某些不发荧光的金属有机配合物中夺取金属离子，而释放出能发荧光的配位体，从而测定这些阴离子的含量。☆催化荧光法某些反应的产物虽能发生荧光，但反应速度很慢，荧光微弱，难以测定。若在某些金属离子的催化作用下，反应将加速进行，利用这种催化动力学的性质，可以测定金属离子的含量。铜、铍、铁、钴、锇、银、金、锌、铅、钛、钒、锰、过氧化氢及氰离子等都曾采用这种方法测定。2.有机化合物的分析脂肪族化合物的分子结构较为简单，会发荧光的为数不多。但也有许多脂肪族化合物与某些有机试剂反应后的产物具有荧光性质，可用于它们的测定。芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发射荧光，可以直接进行荧光测定。有时为了提高测定方法的灵敏度和选择性，常使某些弱荧光的芳香族化合物与某些有机试剂反应生成强荧光的产物进行测定。例如降肾上腺素经与甲醛缩合而得到强荧光产物，然后采用荧光显微法可以检测组织切片中含量低至10-17g的降肾上腺素。在生理科学研究工作及医疗工作中，所遇到的分析对象常常是分子庞大而结构复杂的有机化合物，如维生素、氨基酸和蛋白质、胺类和甾族化合物、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等，这些复杂化合物许多均能发射荧光，可以用荧光分析法进行测定或研究其结构或生理作用机理。在现代的分离技术中，以荧光法作为检测手段，常可以测定这些物质的低微含量，荧光免疫分析法也是医学研究的一种重要手段。表列出一些有机物的荧光分析法。十八、荧光分析法新技术简介荧光技术作为一种分析方法，一百多年来，得到很大的发展，特别是近几十年来许多新的荧光分析技术的出现和应用，这些新技术灵敏度高、选择性好、取样量少、方法快速简便等，已成为多种研究领域中进行痕量和超痕量甚至分子水平上分析的一种重要工具。现在很扼要地介绍如下几种目前应用较多的方法。1.同步荧光测定法常规的荧光激发光谱和发射光谱是分别在固定荧光发射光波长和激发光波长下，扫描荧光激发光波长和发射光波长所得到的光谱。同步荧光法是同时扫描激发光和发射光波长下绘制的光谱，由测定的荧光强度信号与对应的激发波长（或发射波长）构成光谱图。根据激发单色器和发射单色器在同时扫描过程中彼此间所应保持的关系，同步荧光测定法还分为三种类型：第一种，在同时扫描过程中使激发波长（λex）和发射波长（λem）保持固定的波长间隔（即λex－λem＝常数），这种方法称为："固定波长同步扫描荧光测定法"，即习惯上讲的同步荧光测定法，是最早提出的同步扫描技术；第二种，以能量代替波长关系，在两个单色器同时扫描过程中，使激发波长和发射波长之间保持固定的能量差（即频率或波数差），这种方法称为"固定能量同步扫描荧光测定法"；第三种，使激发和发射单色器以不同的速率同时扫描（即λex－λem≠常数，而是时间的线性函数），这种方法称为"可变角同步扫描荧光测定法"。同步荧光测定法具有使光谱简单、光谱窄化、减少光谱重叠、减少散射光影响、提高选择性等优点。图为丁省的同步荧光光谱。2.导数荧光测定法自从二十世纪50年代初期导数光谱技术应用于分光光度测定之后，使分光光度法的选择性得到很大的改善。直到1974年，导数技术才引进到荧光分析，在解决荧光测定中的背景干扰和谱带重叠问题上收到良好的效果，已被证明是一种提高荧光分析选择性的有效手段。导数荧光测定法的基本原理与分光光度法类似，这里不再叙述。3.三维荧光光谱测定法普通荧光分析所得的光谱是二维光谱，即荧光强度随波长（激发波长或发射波长）的变化而变化的曲线。如果同时考虑激发波长和发射波长同时对荧光强度的影响，则荧光强度应是激发波长和发射波长两个变量的函