发酵工程课件

微生物发酵工程5微生物发酵类型及培养基微生物发酵工程5微生物发酵类型及培养基微生物发酵的类型和方式培养基选择和配制的原则培养基的设计淀粉水解糖的制备基因工程菌的不稳定性及对策5微生物发酵类型及培养基2微生物发酵类型及培养基微生物发酵的类型和方式培养基选择和配制的原则培养基的设计淀粉一．发酵类型：

发酵类型是为了描述菌体生长，碳源利用与代谢产物形成速率变化，以及它们相互间动力学关系而确定的。5.1微生物发酵的类型和方式3微生物发酵类型及培养基一．发酵类型：5.1微生物发酵的类型和方式3微生物发酵类型1．动力学描述参数菌体生长速率比生长速率菌体得率系数产物得率系数（Vx）：单位体积，单位时间里生长的菌体量g/(Lh)（µ）：

菌体浓度除菌体生长速率或繁殖速率h-1（Yx/s）:消耗1g或1mol营养物质生成的菌体的g数或mol数（Yp/s）：消耗1g或1mol营养物质生成的产物的g数或mol数4微生物发酵类型及培养基1．动力学描述参数菌体生长速率比生菌体得产物得率系数（Vx）231产物形成直接与碳源利用有关产物形成间接与碳源利用有关产物形成表面上与碳源利用有关

2．发酵类型根据产物的形成与基质消耗的关系分5微生物发酵类型及培养基231产物形成直接与碳源利用有关产物形成间接与碳源利用有关产

2．发酵类型IIIIII特点菌体生长，碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰。微生物生长和产物合成是分开的。糖既满足细胞生长所需能量又充作产物合成的碳源。产物形成一般在菌体生长接近或达到最高生长时期。产物形成与碳源利用无准量关系。6微生物发酵类型及培养基2．发酵类型IIIIII特点菌体生长，碳微生物生长和产物形7微生物发酵类型及培养基7微生物发酵类型及培养基1．分批发酵：是一种准封闭式系统。一次投料，一次接种，一次收获的间歇式培养方式。培养过程中，接种物要经过5个时期。即延迟期、对数生长期、减速期、稳定期和衰亡期。二．发酵方式：分批培养的特点：操作简单、周期短、染菌机会少和生产过程、产品质量易掌握。但是生产率相对较低。8微生物发酵类型及培养基1．分批发酵：是一种准封闭式系统。一次投料，一次接种，9微生物发酵类型及培养基9微生物发酵类型及培养基细胞浓度随培养时间呈指数增长。细胞浓度的变化率与细胞浓度成正比。2对数生长期细胞的比生长速率开始下降3细胞浓度达到最大值，细胞的比生长速率为04活细胞浓度不断下降5细胞浓度的增加不明显。受菌龄和接种量的影响。1延迟期减速期静止期衰亡期特点10微生物发酵类型及培养基2对数生长期细胞的比生3细胞浓度达4活细胞浓5细胞浓度的1延对数生长期：

dX/dt=µX其中：X---细胞干重

t---时间

µ---比生长速率微生物的比生长速率µ与微生物的种类、培养温度、pH、培养基成分及限制性基质浓度等因素有关。11微生物发酵类型及培养基11微生物发酵类型及培养基12微生物发酵类型及培养基12微生物发酵类型及培养基分批培养过程的生产率P:

生产率=产物浓度/发酵时间生产率是评价发酵过程的成本和效率的综合指标。在分批培养时，计算时间还应包括放罐、清洗、装料和消毒的时间等非发酵过程所占用的时间。13微生物发酵类型及培养基分批培养过程的生产率P:13微生物发酵类型及培养基14微生物发酵类型及培养基14微生物发酵类型及培养基2.连续发酵：连续发酵是指在培养过程中，连续地向发酵罐中加入培养基，同时以相同的流速从发酵罐中排出含有产品的培养基的发酵方式。一般连续培养方式很多：搅拌发酵罐和管式反应器；恒化和恒浊；循环式和非循环式；单级和多级。

15微生物发酵类型及培养基15微生物发酵类型及培养基依据培养物的生长率是受到化学环境控制的。即培养基中某一限制性组分的作用。恒化12控制补充的培养基的流速，使培养液的细胞浓度保持恒定。恒浊16微生物发酵类型及培养基依据培养物的恒化12恒浊16微生物发酵类型及培养基连续发酵先作分批培养，让微生物生长繁殖达到一定程度，并进入产物合成期，然后开始以恒定的流量向发酵罐流加培养基，同时以相同的流量排放培养液，使发酵罐内培养液的体积保持恒定，微生物能持续生长并合成产物。进行单级连续培养时，流出的培养液进行固液分离后，经浓缩的细胞悬液再被送回发酵罐中的方法。把多个发酵罐串连起来，第一个罐的情况与单罐培养相同，以后下一罐的进料便是前一发酵罐的出料，这样就组成了多级串联连续培养。循环式

单级连续培养多级串联连续培养非循环式：17微生物发酵类型及培养基连续发酵先作分批培养，让单级连续培养进入稳定状态后，细胞的比生长速率与稀释率相等。连续培养的最大特点：微生物细胞的生长速率、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速培养微生物细胞或生产大量的代谢产物的目的。生产率得以提高。18微生物发酵类型及培养基单级连续培养进入稳定状态后，细胞的比生长速率与稀释率相等。13．补料分批发酵

在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基，而不从发酵罐中间断地放出培养液的培养方法。工业上利用分批补料培养以消除阻遏并保持通气条件。分批补料培养还可以防止培养基中某一组分的毒性。19微生物发酵类型及培养基3．补料分批发酵19微生物发酵类型及培养基20微生物发酵类型及培养基20微生物发酵类型及培养基培养基：提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。5.2培养基选择和配制的原则21微生物发酵类型及培养基5.2培养基选择和配制的原则21微生物发酵类型及培养基一、培养基的类型和用途基础，繁殖和鉴别培养基天然合成和半合成孢子，种子和发酵培养基根据来源根据目的根据生产工艺22微生物发酵类型及培养基一、培养基的类型和用途基础天然根据来源根据目的根据生22微生二.培养基的选择231从微生物的特点来选择从生产和科研的要求选择从经济效益方面考虑23微生物发酵类型及培养基二.培养基的选择231从微生物的特点来选择从生产和科研的要求对培养基的要求提供合成细胞和发酵产物的基本成分利于减少培养基原料的单耗利于提高培养及产物的浓度利于减少能耗减少副产物，利于产品的分离纯化利于提高产物的合成速率三．培养基的配制原则24微生物发酵类型及培养基对培养基的要求利于减少培利于提高培养减少副产物，利于提高产三适当配比渗透压pH氧化还原电位营养需要原则25微生物发酵类型及培养基渗透压pH营养原则25微生物发酵类型及培养基典型培养基26微生物发酵类型及培养基典型培养基26微生物发酵类型及培养基

完善的培养基设计是实验室的实验，实验工厂的放大和生产规模中的一个重要步骤。

培养基的组成必须满足细胞的生长和代谢所需的元素，并能提供生物合成和细胞维持活力所需要的能量。5.3培养基的设计27微生物发酵类型及培养基5.3培养基的设计27微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分1234能源物质碳源物质氮源物质无机盐和微量元素28微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分1234能源氮源无机盐和微量28微生物发酵类一.培养基的成分5678生长因子前体促进剂和抑制剂水分29微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分5678生长促进剂和29微生物发酵类型光能：光能自养微生物的能源。极端嗜盐菌进行海水淡化，藻类发酵等氢、硫、氨、亚硝酸盐、亚铁盐等是

化能自养微生物的能源。碳水化合物等有机物、石油、天然气及石油化工产品是异养微生物的能源。1能源物质30微生物发酵类型及培养基光能：光能自养微生物的能源。极端嗜盐菌进行海水淡化，藻类发酵。碳源细胞碳骨架产物能源

2.碳源物质主要包括：糖类，脂类，有机酸，低碳糖等31微生物发酵类型及培养基。碳源细胞碳骨架产物能源2.碳源物质主要包括：糖类，蔗糖麦芽糖乳糖糊精淀粉葡萄糖糖类碳源脂类有机酸类32微生物发酵类型及培养基蔗糖麦芽糖乳糖糊精淀粉葡萄糖糖类脂类有机32微生物发酵类型及有机氮和无机氮作用菌体细胞结构含氮代谢产物细胞提供能源3氮源物质33微生物发酵类型及培养基有机氮和无机氮作用菌体细含氮代细胞提3氮源物质33微生物发花生饼粉，黄豆饼粉，棉籽饼粉，酵母粉，麦麸，鱼粉，蚕蛹粉，玉米浆，蛋白胨，尿素，废菌体和酒糟氨水，铵盐和硝酸盐有机氮

无机氮34微生物发酵类型及培养基花生饼粉，黄豆饼粉，氨水，有机氮无机氮344．无机盐和微量元素磷，镁，硫，铁，钾，钠，铅，氯，锌，钴，锰等。较低浓度对细胞的生长和产物合成有促进作用，而在高浓度时常表现出显著的抑制作用35微生物发酵类型及培养基4．无机盐和微量元素磷，镁，硫，铁，钾，钠，铅，氯，锌，钴，作用酶的激活剂生理活性物质的调节剂生理活性物质的组成36微生物发酵类型及培养基作用酶的激活剂生理活性生理活性36微生物发酵类型及培养基辅酶的组成成分高能化合物缓冲剂细胞结构磷酸盐的作用37微生物发酵类型及培养基辅酶的组高能缓冲剂细胞结构磷酸盐37微生物发酵类型及培养基硫含硫氨基酸许多酶的辅酶的活性基

产物硫酸钠硫代硫酸钠38微生物发酵类型及培养基硫含硫氨基酸许多酶的辅酶的活性基产物硫酸钠硫代38微己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶，羧化酶等的激活剂。2是链霉素发酵的必需元素3锌是维生素B12的激活剂，可以促进产物合成4钴维持细胞渗透压5钾和钠影响细胞膜的透性；钙还影响磷酸盐的浓度6细胞色素，细胞色素氧化酶，过氧化物酶等的组成成分，是微生物有氧氧化的必不可少的元素1铁镁钾和钙39微生物发酵类型及培养基己糖磷酸化2是链霉素3锌是维生素4钴维持细5钾和钠影响细6细微生物生长不可缺少的微量有机物，称为生长因子。如氨基酸，嘌呤，嘧啶，维生素等。作用：构成细胞的组成成分，促进生命活动的进行。

5．生长因子40微生物发酵类型及培养基5．生长因子40微生物发酵类型及培养基1）生物素

作用：影响产生菌细胞膜的通透性，同时影响菌体的代谢途径。一般5μg/L。41微生物发酵类型及培养基1）生物素41微生物发酵类型及培养基生物素过量

不足不产或少产谷氨酸产乳酸或琥珀酸长菌快，pH低，尿素消耗多菌体生长不好谷氨酸产量低弱发酵向乳酸发酵转换42微生物发酵类型及培养基生过量不足不产或少产谷氨酸菌体生长不好42微生物发2）维生素B1：对某些菌种发酵有促进作用。3）天然原料：玉米浆，0.4-0.8%

麸皮水解液，1%

糖蜜，0.1-0.4%

酵母43微生物发酵类型及培养基43微生物发酵类型及培养基

某些化合物被加到培养基后，能够直接在生物合成过程中结合到产物分子中去，而自身的结构并未发生太大的变化，却能提高产品的产量。这类小分子物质称为前体。6．前体44微生物发酵类型及培养基某些化合物被加到培养基后，能够直接在生物合成过程中结45微生物发酵类型及培养基45微生物发酵类型及培养基7．促进剂和抑制剂促进剂是一类刺激因子，他们并不是前体或营养，其加入可以影响微生物的正常代谢，或促进中间代谢产物的积累，或提高次级代谢产物的产量。常用的促进剂诱导物，表面活性剂，乙二胺四乙酸，大豆油抽提物等。46微生物发酵类型及培养基7．促进剂和抑制剂促进剂是一类刺激因子，他们并常用的促进剂诱在发酵过程中，加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以至于可以改变微生物的代谢途径。47微生物发酵类型及培养基47微生物发酵类型及培养基48微生物发酵类型及培养基48微生物发酵类型及培养基8．水分参与细胞内一系列化学反应2有效控制细胞内的温度变化3维持大分子的天然构象4脱水作用和水合作用控制有多亚基组成的结构5溶剂和运输介质的作用149微生物发酵类型及培养基8．水分参与细2有效控3维持大4脱水作用5溶剂和149微生物微生物发酵工程5微生物发酵类型及培养基微生物发酵工程5微生物发酵类型及培养基微生物发酵的类型和方式培养基选择和配制的原则培养基的设计淀粉水解糖的制备基因工程菌的不稳定性及对策5微生物发酵类型及培养基51微生物发酵类型及培养基微生物发酵的类型和方式培养基选择和配制的原则培养基的设计淀粉一.培养基的成分1234能源物质碳源物质氮源物质无机盐和微量元素52微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分1234能源氮源无机盐和微量52微生物发酵类一.培养基的成分5678生长因子前体促进剂和抑制剂水分53微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分5678生长促进剂和53微生物发酵类型

严格控制营养物质的浓度和比例，不仅仅是为了维持正常的渗透压，节约原料，而且直接影响到菌体的繁殖和产物积累。二．营养物质的调节54微生物发酵类型及培养基严格控制营养物质的浓度和比例，不仅仅是为了维持正1不同碳源的利用速度2氮源利用和碳源利用的关系3

碳氮比例的调节4前体的控制5补料55微生物发酵类型及培养基1不同碳源的利用速度2氮源利用和碳源利用的关系31).不同碳源的利用速度

能够被微生物快速利用的碳源称为速效碳源，反之为迟效碳源。利用速度依次为：葡萄糖---乳酸----乳糖56微生物发酵类型及培养基1).不同碳源的利用速度56微生物发酵类型及培养基

微生物对氮源的利用速度为：氨态氮----硝态氮----有机氮。

氨的过高过低都会对产物形成造成不良的影响。

氮源的利用速度与碳源的利用速度是很有关系的。

糖代谢的许多中间产物是氨基酸合成的前体。2).氮源利用和碳源利用的关系57微生物发酵类型及培养基2).氮源利用和碳源利用的关系57微生物发酵类型及

生产上多采用控制碳氮比例以满足菌体的大量繁殖，又能大量形成产物。

酵母细胞的碳氮比为：100：20；霉菌细胞的碳氮比为：100：10。

发酵培养基的碳氮比约为：100：0.2-2.0。

谷氨酸生产中的碳氮比约为：100：15-21。3).碳氮比例的调节58微生物发酵类型及培养基生产上多采用控制碳氮比例以满足菌体3).碳氮比例的4).前体的控制

加入量加入方式菌种前体59微生物发酵类型及培养基4).前体的控制加入量加入方式菌种前体59微生物发酵类型及培补料丰富培养基产物合成的旺盛期延长控制pH和代谢方向改善了通气效果解除终产物反馈5)补料60微生物发酵类型及培养基补料丰富培养基控制pH和代谢方向改善了通气效果解除终产物反馈补料的物质碳，氮和水及其他物质。碳源有葡萄糖，饴糖，蔗糖，糊精，淀粉，油脂等。补料氮源有氨水，硫酸铵，硝酸钠，蛋白胨，花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆和尿素等。补料的方法关键是控制补料时间，速率和配比。其目的是不使菌体生长过快，仅仅维持呼吸，但是仍能合成产物。61微生物发酵类型及培养基补料的物质碳，氮和水及其他物质。碳源补料的方法关键是控制补料碳源和能源+氮源+其他需要

细胞+产物+CO2+H2O＋热量

组成微生物的元素包括Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｍｇ和Ｋ，这些元素都要在方程中予以平衡。培养基中还需要微量元素(Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｂ等)。三．培养基的设计62微生物发酵类型及培养基碳源和能源+氮源+其他需要三．培养基的设计62微生物发酵类63微生物发酵类型及培养基63微生物发酵类型及培养基

对于无力合成的生长因子，要通过在培养基中加入适量的纯净物或含有该物质的混合物。

碳源具有生物合成的底物和能源的双重作用。在需氧的条件下对碳源的需要量可以通过菌体得率系数推算而得64微生物发酵类型及培养基对于无力合成的生长因子，要通过在培养基中加入适量的纯

二糖低聚糖葡萄糖淀粉水解糖

工业上，将淀粉水解成葡萄糖的过程称为淀粉的糖化。5.4淀粉水解糖的制备65微生物发酵类型及培养基二糖低聚糖葡萄糖淀粉工业上，将淀粉水解成葡萄糖的过程称为发酵用淀粉水解糖的要求：还原糖含量要高，不含糊精；外观要洁净，透明，呈淡黄色；不可变质。制备淀粉水解糖的原料主要有玉米，小麦，大米和薯类等。66微生物发酵类型及培养基发酵用淀粉水解糖的要求：还原糖含量要高，不含糊精；外水解适度控制蛋白量新鲜洁净质量67微生物发酵类型及培养基水解控制新鲜质量67微生物发酵类型及培养基方法酸解法酶解法酸酶结合法68微生物发酵类型及培养基方法酸解法酶解法酸酶68微生物发酵类型及培养基1.淀粉水解糖对发酵的影响水解不完全：浪费，逃液，染菌。水解过度：产生羟甲基糠醛，进而形成类黑素，不仅浪费，而且抑制菌体生长。

淀粉原料中蛋白含量过多，当糖液中和，过滤时除去不彻底，会引起发酵逃液和染菌。69微生物发酵类型及培养基1.淀粉水解糖对发酵的影响69微生物发酵类型及培养基葡萄糖的理论收率：111%指标实际收率葡萄糖值淀粉转化率2.淀粉制糖过程中考察的指标70微生物发酵类型及培养基葡萄糖的理论收率：111%指实际葡萄糖值淀粉2.淀粉制糖过程

实际收率=[糖液体积（L）X葡萄糖含量（%）/淀粉量（Kg）X原料中纯淀粉的含量（%）]X100%

转化率=[糖液体积（L）X葡萄糖含量（%）/淀粉量（Kg）X原料中纯淀粉的含量（%）X1.11]X100%

DE值=还原糖（%）/干物质含量（%）71微生物发酵类型及培养基71微生物发酵类型及培养基以酸为催化剂，在高温高压下，将淀粉转化为葡萄糖的方法。优点：生产简单，方便，水解时间短，设备生产能力大。缺点：要求特殊设备；易产生副反应；对原料要求高原理：淀粉各种糊精麦芽糖

葡萄糖

二淀粉酸水解法72微生物发酵类型及培养基以酸为催化剂，在高温高压下，将淀粉转化为葡萄糖的方法。二淀粉

影响水解反应速率的关键因素：

温度酸的浓度多糖的水解常数酸的种类因素73微生物发酵类型及培养基

影响水解反应速率的关键因素：

多糖的酸的种类因素淀粉５’－羟甲基糠醛乙酰丙酸+蚁酸+有色物质等。

其它副反应缩短反应时间，控制反应ｐＨ，降低葡萄糖的浓度减少74微生物发酵类型及培养基其它副反应缩短反应时间，减少74微生物发酵类型及培养基

葡萄糖二糖，三糖和其他低聚糖酸和热

复合反应异麦芽糖和龙胆二糖降低葡萄糖的收率，发酵的残糖增加，抑制菌体生长和产物形成，增加提取和精制的难度75微生物发酵类型及培养基葡萄糖二糖，酸和热复合反应异麦芽糖和龙２．工艺原料中和脱色过滤除杂糖液调浆糖化冷却10.5-12Bé0.6-0.7%，

pH1.5左右糖化时间=达到最大葡萄糖值时的时间-放料时间。烧碱或纯碱中和温度为60-70℃，中和pH4.6-5.0.活性炭，淀粉量的0.6-0.8%。65C。，pH4.6-5.0。d=144.3/144.3±Bé76微生物发酵类型及培养基２．工艺原料中和过滤糖液调浆糖化冷却10.5-12Bé糖化时三．双酶水解法

淀粉酶和糖化酶优点缺点条件温和，无需特殊设备无副反应，产品纯度高，淀粉转化率高。可在高淀粉浓度下水解时间长，设备多，过滤难。77微生物发酵类型及培养基三．双酶水解法淀优点缺点条件温和，无需特殊设备时间长，77微淀粉a-淀粉酶葡萄糖，麦芽糖和麦芽三糖。异麦芽糖和低聚糖。（一）液化78微生物发酵类型及培养基淀粉a-淀粉酶葡萄糖，（一）液化78微生物发酵类型及培养基1.淀粉液化的条件及液化程度的控制淀粉糊化老化受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现象。60-75℃。

分子间氢键已经断裂的糊化淀粉又重新排列成新的氢键的过程。淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作用，使淀粉很难液化淀粉的种类，酸碱度，温度及加热方式，淀粉糊的浓度有关系。79微生物发酵类型及培养基1.淀粉液化的条件及液化淀糊化老化受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体液化的方法80微生物发酵类型及培养基液化的方法80微生物发酵类型及培养基1）、工艺流程------------------------调浆高温维持二次液化冷却糖化配料一次喷射液化液化保温二次喷射2、蒸气喷射液化工艺及条件81微生物发酵类型及培养基调浆高温二次冷却糖化配料一次喷液化二次2、蒸气喷射液化工艺及

2）、液化的控制液化低高液化液的黏度太大，难于操作；淀粉易老化，不利于糖化。糖液的葡萄糖值低，淀粉会老化，影响糖化酶的作用效果。葡萄糖值为10-20液化结束要灭酶。82微生物发酵类型及培养基2）、液化的糖化酶的水解作用

糖化是利用糖化酶将淀粉液化产物糊精和低聚糖进一步水解成葡萄糖的过程。

糖化过程葡萄糖含量不断增加。糖化酶对底物的作用是从非还原性末端开始的。产生a-葡萄糖。糖化酶对a-1,4和a-1,6糖苷键都能水解。（二）糖化83微生物发酵类型及培养基糖化酶的水解作用（二）糖化83微生物发酵类型及培养基液化---糖化---灭酶---过滤---贮糖计量---发酵

80-100U/g淀粉pH4.2-4.5,60℃数小时pH4.8-5.090℃30min60-70℃过滤糖化工艺条件及控制84微生物发酵类型及培养基80-100U/g淀粉pH4.8-5.060-70℃糖85微生物发酵类型及培养基85微生物发酵类型及培养基基因工程菌的稳定性是高水平发酵生产的基本条件。5.5基因工程菌的不稳定性及对策86微生物发酵类型及培养基基因工程菌的稳定性是高水平发酵生产的基本条件。5.5基因工程一、质粒不稳定性分裂不稳定性工程菌分裂时出现一定比例的不含质粒的子代菌的现象

结构不稳定性由于DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变87微生物发酵类型及培养基一、质粒不稳定性分裂不稳定性工程菌分裂时出现一定比结构不稳定含低拷贝质粒者产不含质粒菌概率大；比生长速率关键2抗生素3选择压力生长阶段使外源基因处于阻遏状态4分阶段控制培养温度、pH、溶氧、限制性营养5控制培养条件影响细胞膜的透性；钙影响磷酸盐的浓度6比生长速率；基因重组系统的特性；染色体上是否有与质粒和外源基因同源的序列1合适的宿主合适的载体固定化提高质粒稳定性的方法88微生物发酵类型及培养基含低拷贝质2抗生素3选择生长阶段4分阶段控5控制培影响细6比基因工程菌的培养补料分批连续培养透析培养固定化培养延长对数期获得高密度菌体难；分段，进行两阶段连续连续培养；优化诱导水平，稀释率；细胞比生长速率利用膜的半透性使培养物和培养基分离质粒的稳定性提高89微生物发酵类型及培养基基因工程菌的培养补料分批连续透析固定化培养延长对数期难；分高密度培养高密度培养是一个相对概念，一般是指培养液中工程菌的菌体浓度在50g/L干重以上，理论上最高值可达200g/L。高密度培养是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺过程高密度培养可以提高菌体密度，提高单位体积的生产能力，降低生物量的分离费用，缩短生产周期，从而降低生产成本，提高生产效率。90微生物发酵类型及培养基高密度培养高密度培养是一个相对概念，一般是指培养液中工程菌的影响高密度培养的因素对氧气的需求更高对营养源的种类和含量要求高精确调控培养基溶氧浓度pH91微生物发酵类型及培养基影响高密度培养的因素对氧气的需求更高对营养源的种类和含量要求影响高密度培养的因素保持高溶氧，流加补料，适当的比生长速率分段控制温度生长抑制物的生成92微生物发酵类型及培养基影响高密度培养的因素保持高溶氧，流加补料，适当的比生长速率分如何达到高密度培养231培养条件的改进构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌93微生物发酵类型及培养基如何达到高密度培养231培养条件的改进构建出产乙酸能力低的工微生物发酵工程5微生物发酵类型及培养基微生物发酵工程5微生物发酵类型及培养基微生物发酵的类型和方式培养基选择和配制的原则培养基的设计淀粉水解糖的制备基因工程菌的不稳定性及对策5微生物发酵类型及培养基95微生物发酵类型及培养基微生物发酵的类型和方式培养基选择和配制的原则培养基的设计淀粉一．发酵类型：

发酵类型是为了描述菌体生长，碳源利用与代谢产物形成速率变化，以及它们相互间动力学关系而确定的。5.1微生物发酵的类型和方式96微生物发酵类型及培养基一．发酵类型：5.1微生物发酵的类型和方式3微生物发酵类型1．动力学描述参数菌体生长速率比生长速率菌体得率系数产物得率系数（Vx）：单位体积，单位时间里生长的菌体量g/(Lh)（µ）：

菌体浓度除菌体生长速率或繁殖速率h-1（Yx/s）:消耗1g或1mol营养物质生成的菌体的g数或mol数（Yp/s）：消耗1g或1mol营养物质生成的产物的g数或mol数97微生物发酵类型及培养基1．动力学描述参数菌体生长速率比生菌体得产物得率系数（Vx）231产物形成直接与碳源利用有关产物形成间接与碳源利用有关产物形成表面上与碳源利用有关

2．发酵类型根据产物的形成与基质消耗的关系分98微生物发酵类型及培养基231产物形成直接与碳源利用有关产物形成间接与碳源利用有关产

2．发酵类型IIIIII特点菌体生长，碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰。微生物生长和产物合成是分开的。糖既满足细胞生长所需能量又充作产物合成的碳源。产物形成一般在菌体生长接近或达到最高生长时期。产物形成与碳源利用无准量关系。99微生物发酵类型及培养基2．发酵类型IIIIII特点菌体生长，碳微生物生长和产物形100微生物发酵类型及培养基7微生物发酵类型及培养基1．分批发酵：是一种准封闭式系统。一次投料，一次接种，一次收获的间歇式培养方式。培养过程中，接种物要经过5个时期。即延迟期、对数生长期、减速期、稳定期和衰亡期。二．发酵方式：分批培养的特点：操作简单、周期短、染菌机会少和生产过程、产品质量易掌握。但是生产率相对较低。101微生物发酵类型及培养基1．分批发酵：是一种准封闭式系统。一次投料，一次接种，102微生物发酵类型及培养基9微生物发酵类型及培养基细胞浓度随培养时间呈指数增长。细胞浓度的变化率与细胞浓度成正比。2对数生长期细胞的比生长速率开始下降3细胞浓度达到最大值，细胞的比生长速率为04活细胞浓度不断下降5细胞浓度的增加不明显。受菌龄和接种量的影响。1延迟期减速期静止期衰亡期特点103微生物发酵类型及培养基2对数生长期细胞的比生3细胞浓度达4活细胞浓5细胞浓度的1延对数生长期：

dX/dt=µX其中：X---细胞干重

t---时间

µ---比生长速率微生物的比生长速率µ与微生物的种类、培养温度、pH、培养基成分及限制性基质浓度等因素有关。104微生物发酵类型及培养基11微生物发酵类型及培养基105微生物发酵类型及培养基12微生物发酵类型及培养基分批培养过程的生产率P:

生产率=产物浓度/发酵时间生产率是评价发酵过程的成本和效率的综合指标。在分批培养时，计算时间还应包括放罐、清洗、装料和消毒的时间等非发酵过程所占用的时间。106微生物发酵类型及培养基分批培养过程的生产率P:13微生物发酵类型及培养基107微生物发酵类型及培养基14微生物发酵类型及培养基2.连续发酵：连续发酵是指在培养过程中，连续地向发酵罐中加入培养基，同时以相同的流速从发酵罐中排出含有产品的培养基的发酵方式。一般连续培养方式很多：搅拌发酵罐和管式反应器；恒化和恒浊；循环式和非循环式；单级和多级。

108微生物发酵类型及培养基15微生物发酵类型及培养基依据培养物的生长率是受到化学环境控制的。即培养基中某一限制性组分的作用。恒化12控制补充的培养基的流速，使培养液的细胞浓度保持恒定。恒浊109微生物发酵类型及培养基依据培养物的恒化12恒浊16微生物发酵类型及培养基连续发酵先作分批培养，让微生物生长繁殖达到一定程度，并进入产物合成期，然后开始以恒定的流量向发酵罐流加培养基，同时以相同的流量排放培养液，使发酵罐内培养液的体积保持恒定，微生物能持续生长并合成产物。进行单级连续培养时，流出的培养液进行固液分离后，经浓缩的细胞悬液再被送回发酵罐中的方法。把多个发酵罐串连起来，第一个罐的情况与单罐培养相同，以后下一罐的进料便是前一发酵罐的出料，这样就组成了多级串联连续培养。循环式

单级连续培养多级串联连续培养非循环式：110微生物发酵类型及培养基连续发酵先作分批培养，让单级连续培养进入稳定状态后，细胞的比生长速率与稀释率相等。连续培养的最大特点：微生物细胞的生长速率、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速培养微生物细胞或生产大量的代谢产物的目的。生产率得以提高。111微生物发酵类型及培养基单级连续培养进入稳定状态后，细胞的比生长速率与稀释率相等。13．补料分批发酵

在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基，而不从发酵罐中间断地放出培养液的培养方法。工业上利用分批补料培养以消除阻遏并保持通气条件。分批补料培养还可以防止培养基中某一组分的毒性。112微生物发酵类型及培养基3．补料分批发酵19微生物发酵类型及培养基113微生物发酵类型及培养基20微生物发酵类型及培养基培养基：提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。5.2培养基选择和配制的原则114微生物发酵类型及培养基5.2培养基选择和配制的原则21微生物发酵类型及培养基一、培养基的类型和用途基础，繁殖和鉴别培养基天然合成和半合成孢子，种子和发酵培养基根据来源根据目的根据生产工艺115微生物发酵类型及培养基一、培养基的类型和用途基础天然根据来源根据目的根据生22微生二.培养基的选择231从微生物的特点来选择从生产和科研的要求选择从经济效益方面考虑116微生物发酵类型及培养基二.培养基的选择231从微生物的特点来选择从生产和科研的要求对培养基的要求提供合成细胞和发酵产物的基本成分利于减少培养基原料的单耗利于提高培养及产物的浓度利于减少能耗减少副产物，利于产品的分离纯化利于提高产物的合成速率三．培养基的配制原则117微生物发酵类型及培养基对培养基的要求利于减少培利于提高培养减少副产物，利于提高产三适当配比渗透压pH氧化还原电位营养需要原则118微生物发酵类型及培养基渗透压pH营养原则25微生物发酵类型及培养基典型培养基119微生物发酵类型及培养基典型培养基26微生物发酵类型及培养基

完善的培养基设计是实验室的实验，实验工厂的放大和生产规模中的一个重要步骤。

培养基的组成必须满足细胞的生长和代谢所需的元素，并能提供生物合成和细胞维持活力所需要的能量。5.3培养基的设计120微生物发酵类型及培养基5.3培养基的设计27微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分1234能源物质碳源物质氮源物质无机盐和微量元素121微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分1234能源氮源无机盐和微量28微生物发酵类一.培养基的成分5678生长因子前体促进剂和抑制剂水分122微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分5678生长促进剂和29微生物发酵类型光能：光能自养微生物的能源。极端嗜盐菌进行海水淡化，藻类发酵等氢、硫、氨、亚硝酸盐、亚铁盐等是

化能自养微生物的能源。碳水化合物等有机物、石油、天然气及石油化工产品是异养微生物的能源。1能源物质123微生物发酵类型及培养基光能：光能自养微生物的能源。极端嗜盐菌进行海水淡化，藻类发酵。碳源细胞碳骨架产物能源

2.碳源物质主要包括：糖类，脂类，有机酸，低碳糖等124微生物发酵类型及培养基。碳源细胞碳骨架产物能源2.碳源物质主要包括：糖类，蔗糖麦芽糖乳糖糊精淀粉葡萄糖糖类碳源脂类有机酸类125微生物发酵类型及培养基蔗糖麦芽糖乳糖糊精淀粉葡萄糖糖类脂类有机32微生物发酵类型及有机氮和无机氮作用菌体细胞结构含氮代谢产物细胞提供能源3氮源物质126微生物发酵类型及培养基有机氮和无机氮作用菌体细含氮代细胞提3氮源物质33微生物发花生饼粉，黄豆饼粉，棉籽饼粉，酵母粉，麦麸，鱼粉，蚕蛹粉，玉米浆，蛋白胨，尿素，废菌体和酒糟氨水，铵盐和硝酸盐有机氮

无机氮127微生物发酵类型及培养基花生饼粉，黄豆饼粉，氨水，有机氮无机氮344．无机盐和微量元素磷，镁，硫，铁，钾，钠，铅，氯，锌，钴，锰等。较低浓度对细胞的生长和产物合成有促进作用，而在高浓度时常表现出显著的抑制作用128微生物发酵类型及培养基4．无机盐和微量元素磷，镁，硫，铁，钾，钠，铅，氯，锌，钴，作用酶的激活剂生理活性物质的调节剂生理活性物质的组成129微生物发酵类型及培养基作用酶的激活剂生理活性生理活性36微生物发酵类型及培养基辅酶的组成成分高能化合物缓冲剂细胞结构磷酸盐的作用130微生物发酵类型及培养基辅酶的组高能缓冲剂细胞结构磷酸盐37微生物发酵类型及培养基硫含硫氨基酸许多酶的辅酶的活性基

产物硫酸钠硫代硫酸钠131微生物发酵类型及培养基硫含硫氨基酸许多酶的辅酶的活性基产物硫酸钠硫代38微己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶，羧化酶等的激活剂。2是链霉素发酵的必需元素3锌是维生素B12的激活剂，可以促进产物合成4钴维持细胞渗透压5钾和钠影响细胞膜的透性；钙还影响磷酸盐的浓度6细胞色素，细胞色素氧化酶，过氧化物酶等的组成成分，是微生物有氧氧化的必不可少的元素1铁镁钾和钙132微生物发酵类型及培养基己糖磷酸化2是链霉素3锌是维生素4钴维持细5钾和钠影响细6细微生物生长不可缺少的微量有机物，称为生长因子。如氨基酸，嘌呤，嘧啶，维生素等。作用：构成细胞的组成成分，促进生命活动的进行。

5．生长因子133微生物发酵类型及培养基5．生长因子40微生物发酵类型及培养基1）生物素

作用：影响产生菌细胞膜的通透性，同时影响菌体的代谢途径。一般5μg/L。134微生物发酵类型及培养基1）生物素41微生物发酵类型及培养基生物素过量

不足不产或少产谷氨酸产乳酸或琥珀酸长菌快，pH低，尿素消耗多菌体生长不好谷氨酸产量低弱发酵向乳酸发酵转换135微生物发酵类型及培养基生过量不足不产或少产谷氨酸菌体生长不好42微生物发2）维生素B1：对某些菌种发酵有促进作用。3）天然原料：玉米浆，0.4-0.8%

麸皮水解液，1%

糖蜜，0.1-0.4%

酵母136微生物发酵类型及培养基43微生物发酵类型及培养基

某些化合物被加到培养基后，能够直接在生物合成过程中结合到产物分子中去，而自身的结构并未发生太大的变化，却能提高产品的产量。这类小分子物质称为前体。6．前体137微生物发酵类型及培养基某些化合物被加到培养基后，能够直接在生物合成过程中结138微生物发酵类型及培养基45微生物发酵类型及培养基7．促进剂和抑制剂促进剂是一类刺激因子，他们并不是前体或营养，其加入可以影响微生物的正常代谢，或促进中间代谢产物的积累，或提高次级代谢产物的产量。常用的促进剂诱导物，表面活性剂，乙二胺四乙酸，大豆油抽提物等。139微生物发酵类型及培养基7．促进剂和抑制剂促进剂是一类刺激因子，他们并常用的促进剂诱在发酵过程中，加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以至于可以改变微生物的代谢途径。140微生物发酵类型及培养基47微生物发酵类型及培养基141微生物发酵类型及培养基48微生物发酵类型及培养基8．水分参与细胞内一系列化学反应2有效控制细胞内的温度变化3维持大分子的天然构象4脱水作用和水合作用控制有多亚基组成的结构5溶剂和运输介质的作用1142微生物发酵类型及培养基8．水分参与细2有效控3维持大4脱水作用5溶剂和149微生物微生物发酵工程5微生物发酵类型及培养基微生物发酵工程5微生物发酵类型及培养基微生物发酵的类型和方式培养基选择和配制的原则培养基的设计淀粉水解糖的制备基因工程菌的不稳定性及对策5微生物发酵类型及培养基144微生物发酵类型及培养基微生物发酵的类型和方式培养基选择和配制的原则培养基的设计淀粉一.培养基的成分1234能源物质碳源物质氮源物质无机盐和微量元素145微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分1234能源氮源无机盐和微量52微生物发酵类一.培养基的成分5678生长因子前体促进剂和抑制剂水分146微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分5678生长促进剂和53微生物发酵类型

严格控制营养物质的浓度和比例，不仅仅是为了维持正常的渗透压，节约原料，而且直接影响到菌体的繁殖和产物积累。二．营养物质的调节147微生物发酵类型及培养基严格控制营养物质的浓度和比例，不仅仅是为了维持正1不同碳源的利用速度2氮源利用和碳源利用的关系3

碳氮比例的调节4前体的控制5补料148微生物发酵类型及培养基1不同碳源的利用速度2氮源利用和碳源利用的关系31).不同碳源的利用速度

能够被微生物快速利用的碳源称为速效碳源，反之为迟效碳源。利用速度依次为：葡萄糖---乳酸----乳糖149微生物发酵类型及培养基1).不同碳源的利用速度56微生物发酵类型及培养基

微生物对氮源的利用速度为：氨态氮----硝态氮----有机氮。

氨的过高过低都会对产物形成造成不良的影响。

氮源的利用速度与碳源的利用速度是很有关系的。

糖代谢的许多中间产物是氨基酸合成的前体。2).氮源利用和碳源利用的关系150微生物发酵类型及培养基2).氮源利用和碳源利用的关系57微生物发酵类型及

生产上多采用控制碳氮比例以满足菌体的大量繁殖，又能大量形成产物。

酵母细胞的碳氮比为：100：20；霉菌细胞的碳氮比为：100：10。

发酵培养基的碳氮比约为：100：0.2-2.0。

谷氨酸生产中的碳氮比约为：100：15-21。3).碳氮比例的调节151微生物发酵类型及培养基生产上多采用控制碳氮比例以满足菌体3).碳氮比例的4).前体的控制

加入量加入方式菌种前体152微生物发酵类型及培养基4).前体的控制加入量加入方式菌种前体59微生物发酵类型及培补料丰富培养基产物合成的旺盛期延长控制pH和代谢方向改善了通气效果解除终产物反馈5)补料153微生物发酵类型及培养基补料丰富培养基控制pH和代谢方向改善了通气效果解除终产物反馈补料的物质碳，氮和水及其他物质。碳源有葡萄糖，饴糖，蔗糖，糊精，淀粉，油脂等。补料氮源有氨水，硫酸铵，硝酸钠，蛋白胨，花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆和尿素等。补料的方法关键是控制补料时间，速率和配比。其目的是不使菌体生长过快，仅仅维持呼吸，但是仍能合成产物。154微生物发酵类型及培养基补料的物质碳，氮和水及其他物质。碳源补料的方法关键是控制补料碳源和能源+氮源+其他需要

细胞+产物+CO2+H2O＋热量

组成微生物的元素包括Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｍｇ和Ｋ，这些元素都要在方程中予以平衡。培养基中还需要微量元素(Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｂ等)。三．培养基的设计155微生物发酵类型及培养基碳源和能源+氮源+其他需要三．培养基的设计62微生物发酵类156微生物发酵类型及培养基63微生物发酵类型及培养基

对于无力合成的生长因子，要通过在培养基中加入适量的纯净物或含有该物质的混合物。

碳源具有生物合成的底物和能源的双重作用。在需氧的条件下对碳源的需要量可以通过菌体得率系数推算而得157微生物发酵类型及培养基对于无力合成的生长因子，要通过在培养基中加入适量的纯

二糖低聚糖葡萄糖淀粉水解糖

工业上，将淀粉水解成葡萄糖的过程称为淀粉的糖化。5.4淀粉水解糖的制备158微生物发酵类型及培养基二糖低聚糖葡萄糖淀粉工业上，将淀粉水解成葡萄糖的过程称为发酵用淀粉水解糖的要求：还原糖含量要高，不含糊精；外观要洁净，透明，呈淡黄色；不可变质。制备淀粉水解糖的原料主要有玉米，小麦，大米和薯类等。159微生物发酵类型及培养基发酵用淀粉水解糖的要求：还原糖含量要高，不含糊精；外水解适度控制蛋白量新鲜洁净质量160微生物发酵类型及培养基水解控制新鲜质量67微生物发酵类型及培养基方法酸解法酶解法酸酶结合法161微生物发酵类型及培养基方法酸解法酶解法酸酶68微生物发酵类型及培养基1.淀粉水解糖对发酵的影响水解不完全：浪费，逃液，染菌。水解过度：产生羟甲基糠醛，进而形成类黑素，不仅浪费，而且抑制菌体生长。

淀粉原料中蛋白含量过多，当糖液中和，过滤时除去不彻底，会引起发酵逃液和染菌。162微生物发酵类型及培养基1.淀粉水解糖对发酵的影响69微生物发酵类型及培养基葡萄糖的理论收率：111%指标实际收率葡萄糖值淀粉转化率2.淀粉制糖过程中考察的指标163微生物发酵类型及培养基葡萄糖的理论收率：111%指实际葡萄糖值淀粉2.淀粉制糖过程

实际收率=[糖液体积（L）X葡萄糖含量（%）/淀粉量（Kg）X原料中纯淀粉的含量（%）]X100%

转化率=[糖液体积（L）X葡萄糖含量（%）/淀粉量（Kg）X原料中纯淀粉的含量（%）X1.11]X100%

DE值=还原糖（%）/干物质含量（%）164微生物发酵类型及培养基71微生物发酵类型及培养基以酸为催化剂，在高温高压下，将淀粉转化为葡萄糖的方法。优点：生产简单，方便，水解时间短，设备生产能力大。缺点：要求特殊设备；易产生副反应；对原料要求高原理：淀粉各种糊精麦芽糖

葡萄糖

二淀粉酸水解法165微生物发酵类型及培养基以酸为催化剂，在高温高压下，将淀粉转化为葡萄糖的方法。二淀粉

影响水解反应速率的关键因素：

温度酸的浓度多糖的水解常数酸的种类因素166微生物发酵类型及培养基

影响水解反应速率的关键因素：

多糖的酸的种类因素淀粉５’－羟甲基糠醛乙酰丙酸+蚁酸+有色物质等。

其它副反应缩短反应时间，控制反应ｐＨ，降低葡萄糖的浓度减少167微生物发酵类型及培养基其它副反应缩短反应时间，减少74微生物发酵类型及培养基

葡萄糖二糖，三糖和其他低聚糖酸和热

复合反应异麦芽糖和龙胆二糖降低葡萄糖的收率，发酵的残糖增加，抑制菌体生长和产物形成，增加提取和精制的难度168微生物发酵类型及培养基葡萄糖二糖，酸和热复合反应异麦芽糖和龙２．工艺原料中和脱色过滤除杂糖液调浆糖化冷却10.5-12Bé0.6-0.7%，

pH1.5左右糖化时间=达到最大葡萄糖值时的时间-放料时间。烧碱或纯碱中和温度为60-70℃，中和pH4.6-5.0.活性炭，淀粉