DB45-T 2031-2019甘蔗白叶病植原体巢式PCR检测技术规程-（高清可复制）

ICS65.020.01B16

DB45广西壮族自治区地方标准DB45/T2031—2019甘蔗白叶病植原体巢式PCR检测技术规程DetectingtechniqueregulationsforphytoplasmaofSugarcaneWhiteLeafbasedonNestedPCR2019-12-052019-12-30广西壮族自治区市场监督管理局发布D4/021前言本标准按照BT109则起草。本标准由广西壮族自治区糖业办公室提出并监督实施。本标准由广西糖业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所、广西甘蔗遗传改良重点实验室。春燕、刘丽敏、吴建明、颜梅新、刘璐。IIDB45/T2031—2019甘蔗白叶病植原体巢式PCR检测技术规程1范围本标准规定了甘蔗白叶病植原体（SugarcaneWhiteLeafPhytoplasma）巢式PCR检测的原理、试剂、主要仪器与设备、样品的采集保存与运输、检测方法和结果描述及判定。本标准适用于甘蔗白叶病病原菌植原体引起的病害及病原物的快速检测。2规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T28067甘蔗黄叶病病毒实时荧光RT-PCR检测方法巢式PCR(NestedPolymeraseChainReaction巢式PCR(NestedPolymeraseChainReaction（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。利用植原体16SrRNA基因序列通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2，作为巢式PCR的外侧和内侧特异引物对，可用于甘蔗白叶病植原体的快速检测。巢式PCR可增加PCR检测的灵敏度和反应特异性。4试剂4.1GB/T6682—2008PCR应符合一级水指标。4.2液氮。DNAGelRed4.52×EasyTaqPCR10mmol/L0.05U/μLTaqDNAPolymerase、0.4MmdNTPMixture、4mMMg、2×PCRBuffer。4.61×TE缓冲液：市售产品。1500bpDNA琼脂糖，电泳级。内外检测引物序列：外引物对：P1：5‘-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3’；P7：5‘-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3’。1D4/021内引物对：R16F2n：5‘-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3’；R16R2：5‘-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3’。4.10阳性对照为已确定感染甘蔗白叶病植原体的样品基因对照为确定未感染白叶病植原体的样品基因DNA。5主要仪器与设备PCR凝胶成像系统。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。台式高速冷冻离心机：12000g。恒温水浴锅。5.6冰箱：2℃～4℃、-20℃、-80℃。高压灭菌锅。鼓风干燥箱。5.9电子天平：感量0.001g。5.10微量加样器：0.1μL～2.5μL、0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL、20μL～200μL、50μL～1000μL。6样品的采集、保存及运输6样品的采集、保存及运输6.1样品采集按GB/T28067的要求执行。其中，叶片样品和蔗茎样品参照NY/T2743。采集1.0g～2.0g叶片或蔗茎放于样品袋中，备用。6.2样品保存和运输采集的样品放置于2℃～8℃条件下保存时间≤48需放置在-80℃复冻融。长途运输时，可采用保温箱中加干冰或液氮密封后运送。7检测方法DNA取样品0.1液氮冷冻研磨至粉末状选择的植物基因组DNA提取试剂盒推荐的操作方法进行提取样品DNA。DNA样品DNA提取后，用蛋白/核酸分析仪鉴定样品DNA质量，当A/A比值为1.8～2.0时，适合于PCR扩增。PCRPCR2DB45/T2031—2019按下列方法配制20μLPCR：2×EasyTaqPCR8.0μL，上游外引物P1（10μmol/L）0.3μL，下游外引物P7（10μmol/L）0.3μL，DNA25ng/μL)3.0μL，PCR水8.4μL。第一轮PCR扩增参数：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，25个循环；72℃延伸10min。空白对照用无菌一级水代替样品DNA模板。7.3.2第二轮PCR扩增按下列方法配制20μLPCR：2×EasyTaqPCR8.0μL，上游内引物R16F2n（10μmol/L）0.3μL，下游内引物R16R2（10μmol/L）0.3μL，第一轮PCR产物（稀释30倍）取3.0μL作为模板DNA，PCR8.4μL。第二轮PCR扩增参数：95℃预变性5min，94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。空白对照为无菌一级水。扩增产物的电泳检测1×TAE1.5％的琼脂糖溶液；稍适冷却后倒板，室温下凝固成琼脂糖凝胶。2μL6×5μLPCRPCR，2000g5s。5μLDNAPCR80V30min。凝胶成像分析将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统成像仪上，根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带大小，将电将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统成像仪上，根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带大小，将电泳结果用拍照系统拍照形成图片文件存档。8结果描述及判定8.1质控标准阳性对照出现一条大小为1240bp±5bp条带，阴性对照和空白对照无条带时