药品生产验证指南

第三篇检验方法和清洁验证、无菌保证第一章检验方法验证第一节概述一、引言药品的生产过程中，原料、中间体、成品均需进行检验，检验结果既是过程受控的依据，也是评价产品质量的重要依据，检验结果应具有准确可靠。而检验方法的验证为检验结果的准确及可靠提供了有力保障。国内外在检验方法的验证方面已有了许多法规、规定。如美国食品药品管理局(FoodandDrugAdministration,简称FDA)1994年11月公布了《色谱方法的验证》(ValidationofChromatographicMethods)；1987年2月公布新品注册相关的《送样及上报检验方法验证资料扌旨南》［(GuidanceforSubmittingSamplesandAnalyticalDataforMethodsValidation)；人用药品注册技术要求国际互认协会(theInternationalConferenceonHarmonizationofTechnicalRequirementsforRegistrationofPharmaceuticalsforHumanUse简称ICH)1995年3月颁布了《分析方法的验证》》(TextonValidationofAnalyticalProcedures)规定了需进行验证的方法的种类和应考察的项目,还对分析方法、专属性、准确度、精密度、重现性作出明确定义,从而统一了各国药典和法规对这些术语的解释；作为对《分析方法的验证》的补充、扩展，ICH于1996年11月颁了《分析方法的验证：方法学》(ValidationofAnalyticalProcedures.Methodology)；美国药典第24版＜1225＞规定了《药典方法的验证))(ValidationofCompendialMethods)；中国药典2000版附录XIXA规定了《药品质量标准分析方法验证》。这些法规、规定从不同方面对检验方法的验证作了规定，它们是实施检验方法验证的重要依据。本章将着重讨论检验方法验证的基本内容，并以示例形式介绍验证的基本实践，以使本章的内容具有可操作性。方法验证有以下几个先决条件，在进行方法验证以前，必须逐条进行检查［1］。仪器已经过校正且在有效期内。人员人员应经过充分的培训，熟悉方法及所使用的仪器。参照品参照品的来源一般有3个：购自法定机构(如中国生物制品检定所)的法定参照品；购自可靠的供应商，如Sigma,Merck等；自备参照品，其纯度和性能可自行检测或由法定检验机构检测。材料所用材料，包括试剂、实验用容器等，均应符合试验要求，不给实验带来污染、误差。如进行高效液相色谱分析时，所用试剂应为色谱级；检查铁盐时使用的盐酸不得含有铁盐等。稳定性应在开始进行方法验证前考察试验溶液和试剂的稳定性，确保在检验周期内试验溶液和试剂是稳定的。使用自动进样器，一般是预先配制好一系列样品溶液置进样器中，依次进样。这时要确保进样周期内样品溶液是稳定的。随着科学技术的发展，仪器分析在检验方法中所占的比例越来越大。为保证分析数据的可靠性，仪器的确认也就显得越来越重要。仪器的确认一般分为安装确认、运行确认、性能确认、预防性维修和再确认5个方面。本章将用一定篇幅对这5方面进行介绍。常规化验中常用的容量仪器、分析天平的校正以附录形式附后，便于验证中使用。二、检验方法验证的意义检验方法的验证是质量保证体系的重要组成部分，它的必要性至少可从以下4个方面来认识。（一）药品标准的建立和执行需要经验证的检验方法144《中华人民共和国药品管理法》[2]第五章“药品管理”第三十二条明文规[2]定“药品必须符合国家药品标准”。第二章“药品生产企业管理”第十二条明文规定“药品生产企业必须对其生产的药品进行质量检验；不符合国家药品标准或者不按照省、自治区、直辖市人民政府药品监督管理部门制定的中药饮版炮制规范炮制的，不得出厂”。众所周知，药品标准由两部分基本内容组成：一是项目的规格标准或限度；二是相应的检验方法和操作步骤。新品开发建立的药品质量标准必须同时包括这两个方面的内容。只有项目的规格标准或限度，没有具备一定准确度、精密度和重现性的检验方法、操作步骤，就不成其为药品质量标准。对于现行版药典收载品种的质量标准，我国2000年版药典二部“凡例”第十四条有明确规定“本版药典收载的原料药及制剂，均应按规定的方法进行检验如采用其他方法，应将该方法与规定的方法做比较试验，根据试验结果掌握使用，但在仲裁时仍以本版药典规定的方法为准。”这里所说的与规定方法的比较试验，其实际含义即是用其他方法进行分析时，必须对该方法进行验证并确认该方法可靠准确时方能使用。工艺过程的监控需要经验证检验方法从质量保证的观点出发，厂房、设备、工艺经过验证投入正常运行后，应当对已验证过的状态进行监控。这种监控包括以下方面。工艺环境例如，冻干制及粉针无菌分装区洁净级别的监控。生产作业如无菌过滤器使用前后的完好性检查；又如对输液产品而言，能综合反映工艺环境、生产作业、人员个人卫生等状况的灭菌前药液含菌量的监控。介质如氮气的纯度控制、生产用水的质量控制。原料和辅料的质量监控如药用级大豆油中脂肪酸组分的测定；气雾剂生产用的氟里昂中水分的检查；某些原料晶形的检查以及往往被忽视的原辅料细度的检查等。另外，成品检验结果的统计分析可用于证明已验证工艺的受控状态，如一些固休制剂含量均匀度检查、含量测定、溶出度测定、崩解时限、注射剂的澄明度等都能从某个方面反映工艺过程的受控状态。所有这些都离不开检查方法，没有经过验证的、可靠的检验方法，药品质量保证将是一句空话。药品的商业交换需要经验证的检验方法药品的商业交换需要验证的检验方法是不言而喻的，生产单位的检验结果与145145145145使用单位或监控管理部门的检验结果应在允许范围之内。如抗生素、肝素钠的商业交换以效价为单位结算费用，如果检验结果不准确，不仅可能带来经济上的损失，更重要的是影响到企业的信誉。由于方法没有验证，厂方自己的内控方法没有和法定的方法进行验证和对照，供需双方检验结果不一致，引起纠葛，甚至导致客户大批退货事件的发生也是不足为怪的。总之，法定的、经过验证的方法是药品进行商业交换的必要条件。（四）药品生产验证需要经验证的检验方法药品生产验证中不论何种剂型都涉及到检验方法的检验。分析检验工作通常被人们比作一个人的眼睛，通过分析检验才能对药品质量作出判断。如果检验方法没有经过检验，在准确性和重现性上存在问题，无论如何进行检验都是徒劳的，对药品质量的评价是盲目的。药品生产验证中使用的检验方法应经过验证后方能使用。GMP的基本实践告诉我们，为确保工艺的可靠性和重现性，工艺必须验证；同样，为确保检验方法的准确性和重现性，检验方法同样必须进行验证。第二节验证的定义及分类一、验证的定义WHO1992年版的GMP对验证的定义为：“能证实任何程序、生产过程、设备、物料、活动或系统确实能导致预期结果的有文件证明的行动。”按此定义来理解，工艺验证和检验方法验证两者之间有相同或相似的特点。（一）目标相似对工艺验证的要求是实现工艺的可靠性和重现性，始终如一地生产出符合预定规格及质量的产品为最终目标。对检验方法验证的要求则是检验方法的准确度和重现性，始终如一地获得符合客观实际的数据或结果为最终目标。（二）手段相似工艺验证以关键工艺变量的控制为手段，检验方法的验证则以控制检验的试验条件为手段。（三）主体相同都必须包括GMP中最为活跃的因素——人员。验证的过程也同时是一个人员在职培训的过程。（四）前提相同工艺验证的前提是在产品开发阶段已完成配方及工艺条件的优化工作。检验方法验证的前提是在检验方法开发阶段已完成方法的测试条件的优选工作，排除了干扰因素。（五）类型相同两者都有3种基本的验证类型：前验证、回顾性验证和再验证。二、验证的分类检验方法的验证工作可分为3种类型：前验证、回顾性验证和再验证。（一）前验证检验方法的前验证系指在方法正式投入使用前按照设定的方案进行试验，收集证据以证实检验方法达到预期要求的一系列活动。前验证的基本步骤和内容可参见第一篇第三章第四节。（二）回顾性验证检验方法的回顾性验证系指利用对现有的历史数据进行统计分析，收集证据，以证明检验方法达到预期要求的行为。对以下两种情况可实施回顾性验证。一检验方法已长期使用，结果稳定，由于方法投入使用时，法规尚无方法验证方面的要求，因而缺乏必要的原始验证资料。对某一方法的验证数据表示怀疑时。这类验证的先决条件是生产的工艺条件没有变更，有完整的批生产记录和批检验记录可进行追溯。每批的投料量和检验的结果，生产作业中出现的偏差和纠正措施以及检验过程中出现的异常情况等均有据可查。如果一个方法在使用过程中曾做过若干次修改，相应的数据应分段进行统计分析。在回顾性验证中，可以把产品各批的样品作为一个系列具有目标值的“标准”来看待，把相应的检验结果与之比较，如果检验结果的平均值是目标值且处在一个统计的控制状态，便证明了检验方法的可靠性和重现性。对上述历史数据进行汇总，统计分析及综合评价并经过批准的报告即是回顾性验证的文件。第二个进行回顾性验证的方法是利用对照品和相应的辅助材料在实验室配制“检验标准”，得到一系列已知浓度的样品，进行常规检验，把分析结果记录于控制图上。如果分析结果的平均值接近“标准”，并处在统计的控制状态，那么这些结果可用于验证的目的。另外，由于实验室不具备生产车间的工艺条件，如车间制粒、灭菌等，这些因素对结果可能产生的影响也应加以考虑。实际上，在实验室配制“检验标准”将结果和标准比较的方法是一种后补措施，用现实来推断历史。在可能条件下应尽可能采取前验证的方法进行验证，以减少质量及经济方面可能的风险，提高质量保证的可信度。（三）再验证出现下述情况时需对检验方法进行再验证。①仪器更新或大修。检验方法获得的结果作趋势分析，发现系统性偏差。146对检验方法进行了修订或检测条件发生了变更。经过一段使用时间，对检验方法的再验证。再验证的目的是证实验证的状态没有发生飘移。第三节检验方法验证的基本内容一、检验仪器的确认[3]检验仪器是一统称，它实际分为两类。一类是测量仪器，只进行测量，不涉及分析过程。如计时器、温度计、天平、pH计、分光光度计、HPLC中的检测器等。计量仪器如容量瓶、移液管、滴定管等通常也归人此类。另一类是分析仪器，它不仅进行测量，还有一分析过程。如HPLC系统，它先将样品组分进行分离，然后再用检测器进行检测，即测量。测量仪器只需进行安装确认和校正，无需进行其他确认步骤。分析仪器的确认一般分为安装确认、运行确认、性能确认、预防性维修和再确认5个方面。测量仪器的确认因比较简单，故本章只在示例中讨论中加以说明。以下着重讨论分析仪器的确认。安装确认指资料检查归档、备件验收入库、检查安装是否符合设计和安装要求有记录和文件证明的一系列活动。同工艺验证中生产设备一样，仪器安装确认的主要内容包括如下几点。按订货合同核对所到货物正确无误，并登记仪器代号、名称、型号、生产厂商名称、生产厂商的编号、生产日期、公司内部固定资产设备登记号及安装地点。检查并确保有该仪器的使用说明书、维修保养手册和备件清单，并收集、汇编和翻泽（必要时）仪器使用说明书和维修保养手册。检查安装是否恰当，气、电及管路连接是否符合供货商的要求。制定使用规程和维修保养规程，建立使用日记和维修记录。制定清洗规程。明确仪器设备技术资料（图、手册、备件清单、各种指南及与该机器设备有关的其他文件）的专管人员及存放地点。除上面提到的内容外，在安装确认方案中对仪器的性能用途应有一概述并记录维修服务单位的名称，联系人电话号码、传真号、银行账号等。以利于日后的维修保养活动，这对大型精密仪器尤为重要。进行运行确认前，应有一份安装确认报告，以文件形式来说明安装确认的有关工作已经完成并符合要求。运行确认即为空载试验，它在不使用样品的前提下，确认仪器达到设计的要求。如气相色谱仪的程序升温设定后能否按设定程序执行，溶出仪转速能否达到规定的性能要求，紫外分光光度计的吸收度与透光率的转换是否符合要求等。对于高效液相色谱(HPLC)系统的运行确认，其内容可参见表3—1。运行确认前应确定校验方法及限度。校验方法及限度可参照生产厂家推荐的方法及限度，也可参照使用者的要求。现在许多大型仪器的运行确认都由仪器生产厂家专派技术人员前来进行，此时只需将他们的测试数据记录下来即可，没有必要再单独重复进行一次运行确认。性能确认主要考察仪器运行的可靠性、主要运行参数的稳定性和结果的重现性。通常取某一样品按给定方法进行试验，考察结果是否符合方法设定的要求。性能确认一般与具体分析方法相联系，如系统适用性试验即属于性能确认的范畴。预防性维修(Preventive—maintenance)是许多HPLC生产厂商建议进行的步骤。预防性维修是为了确保仪器处于良好的使用状态，根据仪器的类别、确认的经验制定的维修计划。它可以减少由于仪器故障而引起实验失败的次数。预防性维修的频率取决于仪器的使用情况，一般刚开始时定为12个月，而后根据实际情况延长或缩短。预防性维修的内容一般是对仪器主要的性能参数进行检查，确认其在设定的范围内，实际上是进行一次运行确认。对于不符147合规定的元件，则进行适当的修理或更换，使其达到要求。再确认一般在分析仪器经过较大的变更后进行，如经过修理或其中的元件被更换等，其目的是在证实已确认的状态没有发生飘移。再确认一般只需运行确认和性能确认即可。每件仪器在确认前都应有确认计划，按确认计划进行确认。确认结束后应有仪器确认报告，记录确认过程及原始数据。仪器确认报告应归档保存，以便查阅。表3－1HPLC系统运行确认试验及限度各仪器名称仪器中各组件功能试验项目限度流量控制阀向系统输出流动相流速准确度±5%泵流动相比例控制阀控制各流动相的比例流动相混合比例的准确度土[F（l—F）10%,F为所测流动相组分所占的体积比自动进样器进样体积控制阀将定量体积的样品注入色谱柱精密度RSD应Wl.O%柱温箱温度控制器保持色谱柱的温度准确度精密度W土3.0°C，波动应在1.0°C内单色器从连续光谱中分离出单色光准确度土3nmUV检测器光电管测定样品的吸收度线性相关系数不得小于0.999二、检验方法验证的类型及基本要求（一）概述方法验证的目的是证明所采用的方法达到相应的检测要求。由于分析性质的差异，本节中所讨论的验证内容不适用微生物分析方法，微生物分析方法的验证将在本章第四节中介绍。验证的内容主要包括准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围、粗放性和耐用性9个方面。药典收载的方法一般比较成熟，需验证的内容与新开发的检验方法有很大差异，美国药典中明确规定其所收载的方法需做系统适用性试验，这即是美国药典对方法验证的要求。某一方法需到底须进行哪些项目的验证，应根据实际情况而定，并不是所有的方法都必需进行以上9个方面的验证试验。方法验证的范围，一般来说，可分以下3种情况区别对待。①对于直接弓1用有法定依据的方法，如药典标准和部颁标准，仅做系统适用性试验即可。但若将法定方法用于测定新药，或将某一品种的法定测定方法用于另一品种，就需进行系统的方法验证。②对于已在一实验室验证过但需在另一个实验室使用的分析方法，可采用对照试验法。即取同一批样品，按此方法在两实验室分别进行检验，将结果进行比较(如用t检验法计算),判断是否有显著性差异。这特别适用于大公司(包括跨国公司)的情况。母公司完成了系统的方法验证工作，子公司实验室均可用结果对照的方法进行判断，节省了大量人力、物力。国外称这种做法为“技术转移"(Technicaltransfer)。其他分析方法可分为4种类型，验证要求可参见表3—2[4]。(二)验证的内容及基本要求1．准确度准确度是指用该方法测定的结果与真实值接近的程度，一般用回收率表示。准确度的测定至少要取方法范围内的3个浓度级别，每个浓度级别至少要测定3次。如某方法的范围是80%〜120%，则应取80%、100%、120%3个浓度，每个浓度测定3次，计算9个测定结果的回收率及相对标准偏差，回收率及相对标准偏差均应在规定限度之内。148原料药含量分析可通过分析已知纯度的对照品或样品进行测定；或用本法所得结果与另一已验证的方法所得结果进行比较。制剂中各组分的含量分析按制剂处方取适量各组分进行有机混合得一混合物进表3－2不同分析方法的验证要求类型验证项目类型II类型I定量测定限度试验类型III类型W准确度精密度专属性检测限定量限线性范围要求要求要求要求要求要求要求要求要求要求要求*要求要求**要求*要求注：“－”表示不作要求；“*”表示需根据实验特性决定是否作要求。类型I指用于测定原料药中主要成分或制剂中活性组分（包括防腐剂）的定量分析方法。类型II指用于测定原料药中杂质或制剂中降解产物的分析方法，包括定量分析和限度试验。类型III指用于测定性能特性（如溶解度、溶出度）的分析方法。类型IV指鉴别试验。行测定，从而确定方法的准确度。若不可能得到处方中所有组分，可往制剂中加入已知量的被分析物进行测定；另一方法是把此方法的分析结果与另一已建立准确度的方法的分析结果进行比较。（3）杂质的定量分析往样品中加入已知量的杂质进行测定；若不可能得到某种杂质或降解产物，可把此方法的分析结果与另一已验证的方法的结果进行比较来确定。杂质的量可用杂质与主药响应值的比值来表示。2．精密度精密度指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差（变异系数）表示。精密度又分为重复性、中间精密度、重现性3类。在相同条件下，由同一分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；在同一实验室，不同时间由不同分析员用不同设备测定结果的精密度，称为中间精密度；在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。重复性方法重复性的确定至少要取方法范围内的3个浓度级别，每个浓度级别至少要测定3次；或取100％的样品浓度至少测定6次。应自样品制备开始制备6份样品溶液，所得结果的相对标准偏差即为方法重复性。自动进样器重复性的测试，一般取同一样品溶液至少重复进样10次，其相对标准偏差不应大于l％。中间精密度中间精密度主要是为考察随机变动因素(如时间、人员、设备等)对精密度的影响，但不必对每个可能的影响因素进行单个的考察，可设计方案对其进行统一考察。色谱分析方法由于受外界因素的影响较大，故一般需考察中间精密度，至少应在两种不同条件下进行考察(如不同时间，更换实验人员等)。重现性一般实验室不进行此项考察，只有当分析方法将被法定标准采用时，才进行重现性试验。建立药典分析方法时常需通过协同检查得出重现性的结果。如紫外分光光度法中吸收系数工l%lcm的确定，需通过5个以上实验室分析，测定结果符合数理统计要求，才能采纳使用，收入标准。准确度和精密度之间没有必然的联系。测量的精密度不能说明测量值与真值的关系，精密的测量值不一定是准确的，因为引起测量值远离真值的误差可能会对一系列的测量发生同149样的影响，而不影响精密度，这即是系统误差的概念。3．专属专属性系指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。对于鉴别试验，应证明当样品中含有被分析物时呈正反应，当不含被分析物时呈(阴性)负反应。必要时，需证明与被分析物结构相似或相近的物质均不呈正反应。对于杂质的测定，一般取含一定杂质量的样品进行分析，证明此杂质测定其具有适宜的准确度和精密度即可。对于含量分析，可通过加入一定量的杂质或赋形剂至样品中，通过分析证明结果不受影响。若杂质或降解产物为未知物，可将样品用强光照射、高温、高湿、酸碱水解或氧化的法进行加速破坏，而后将此样品进行分析，将分析结果与另一个经验证的方法或法定方法得结果进行比较。含量测定应比较两方法的分析结果，杂质测定若有色谱图，则应对比杂质峰的形状。检测限指样品中被测物能被检测出的最低量。(1)非仪器分析目视法通过用已知浓度的样品分析来确定可检出的最低水平作为检测限。(2)仪器分析方法可以非仪器分析所用的目视法来确定检测限，也可用已知浓度的样品与空白试验对照，以信噪比为2：l或3：1来确定检测限的最低水平。不论用哪种方法，均需制备相应检测限浓度的样品，反复测试来确定。5．定量限定量限系指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定定量限。非仪器分析方法与检测限的非仪器分析方法所用方法相同，只是所得结果需符合一定的准确度和精密度要求。仪器分析方法一般以信噪比为10：1时相应的浓度作为定量限的估计值，然后配制相应定量限浓度的样品，反复测试来进行确定。6．线性线性指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程序。应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液精密稀释或分别精密称样，制备一系列的供试品(至少5份不同浓度的供试品)进行测定。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数线性回归，求出回归方程及相关系数。7．范围范围指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。分析方法的范围应根据具体分析方法以及对线性、准确度、精密度的结果和要求确定。无特殊要求时，通常采用以下标准。对于原料药和制剂的含量测定，范围应为测试浓度的80%〜20%。杂质测定，范围应为测试浓度的50%〜20%。含量均匀度，范围应为测试浓度的70%〜130%,根据某些剂型的特点(如气雾剂)，此范围可适当放宽。溶出度范围应为标准规定范围的土20%。、如某一剂型的溶出度规定，1h后溶出度不得小于20%，24h后溶出度不得小于90%，则考察此剂型的溶出度范围应为0〜110%若含量测定与杂质检查同时测定，用百分归一化法，则线性范围应为杂质规定限度的－20%至含量限度的20%。8．粗放性分析方法的粗放性(Ruggedness)指在不同实验条件下(如不同实验室、不同实验员、不同150仪器、不同批的试剂、不同的分析温度、不同时间等)对同一样品进行分析所得结果重现性。此实验条件应仍在方法规定的限度内。将在不同实验条件下所得结果的重现性与方法的重复性进行比较，来衡量分析方法的粗放性。9．耐用性耐用用性(Robustness)指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成和pH、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等。气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相、柱温、进样器和检测器温度等。如果测试条件要求比较苛刻，则应在方法中写明。三、检验方法验证过程（一）验证方案的制订检验方法的验证方案通常由研究开发实验室提出，由质检实验室会签。没有开发实验室的药厂应由质检实验室负责方法开发的人员或其他有经验的技术人员起草。根据产品的工艺条件、原辅料化学结构、中间体、分解产物查阅有关资料，提出需验证的项目、各项目的指标要求及具体的操作步骤。最后经有关人员审批后方可实施。（二）验证的实施应由有一定理论知识和操作经验的实验室操作人员进行验证。实验室操作人员在接收到已经批准的验证方案后，首先应进行做好以下准备工作。检查所涉及的仪器是否经确认并在有效期内。检查所涉及的参照品是否齐全并在有效期内。检查所用容器、试剂等都符合实验要求。检查样品溶液是否稳定，若不稳定则需首先确认样品溶液的有效期，或采用新鲜配制的方法。准备工作结束后，即可根据验证方案中规定的项目及方法进行验证，得出实验结果。所记录的实验结果应能真实反映实验情况。每个结果后均应有操作人员签名确定，必要时须由第二个人复核。（三）验证报告方法验证结束后，应由方法开发人员写出验证报告，将试验数据资料进行汇总分析，对检验方法作出正确的评价。验证报告需包括实验目的、验证要求、所用仪器名称、品牌及设定条件、所用试剂、具体操作方法、结果及结论。试验中的主要偏差应有适当的解释。原始记录及图谱应附在报告后。报告需由实验室操作人员、方法开发人员签字确认，最后经部门负责人批准方可生效。（四）经验证的检验方法检验方法验证的最终产物是一个经过验证的方法。方法验证结束后，此方法可正式批准，投入日常使用。第四节药品微生物检查方法的验证在化学测试中，药品含量测定方法需要验证，与此相应，微生物检验方法也需要验证。尽管药品的微生物学检验方法在各国药典中均有规定，但是，不同的检品、不同的仪器或材料及实验环境条件等均可能对检验结果产生影响。例如，当检品有抑菌性时，它们会掩盖无苗药品已受污染的事实或造成低于实际污染水平的菌检结果；选用不适当的培养基，其促菌生长能力不符合要求，也会造成类似的后果。另外，为了保证药品使用的安全性，有些药品中加了一定的防腐剂，当对防腐剂的防腐性能进行挑战性试验时，微生物的种类、生长的状151态、介质的pH等因素又对试验的结果产生影响。为了使微生物学检验方法的结果准确可靠，需要对每个品种的具体检验方法进行验证。本节重点讨论的药品微生物方法验证包括：微生物限度检查、无菌检查和防腐剂抑菌效力测定方法。同化学检验方法验证的原理相似将药典的微生物学方法具体应用于特殊品种时，需进行方法研究，摸清微生物学检验方法适用的条件，即通过试验，寻找并确定合适的材料、条件和方法。在这一工作的基础上，通过验证试验，最终确认检验条件，批准成为正式方法。一、微生物学检验的影响因素在药品微生物学检验中，不管是微生物限度检查、无菌检查还是药品防腐剂的抑菌效力测定，检验结果受多种因素影响，其中抑菌因素由于其特殊的重要性而备受关注。在药检实践中，以下几种因素均可对微生物学检验产生影响。药品本身的抑菌性。药品中防腐剂的抑菌性。培养基的促菌生长能力。培养条件（温度、湿度及需氧或厌氧）。过滤系统的材质。此外，检查时所用微生物的种类及生长状态等，也会影响微生物的检验结果。众所周知，一些无菌药品中，如多剂量形式的注射剂，往往添加抑菌剂；滴眼剂中，常添加抑菌剂，以保证它们在一段时间可安全使用。抑菌剂的有效性须用微生物挑战试验来证实。挑战试验用微生物菌种的制备方法影响抑菌性产品的检验。因为挑战试验用微生物的生长和制备方式决定着细胞的生理状态，而这种状态又直接影响到抑菌剂抑菌效力测定的结果。美国药典对抑菌剂抑菌效果的检验作了明确规定。测定时所用的微生物，包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、酵母菌和霉菌等。本节文末列出了美国药典和欧洲药典在药品微生物学检查及其验证中常用的菌种名称及其代号。微生物培养条件是影响供试品中菌检计数准确与否的重要因素。应注意影响结果的两个方面：一是培养基本身的性质；二是培养条件。通俗说来，培养基应具备应广谱性，即有助于供试品中所有存活微生物的生长。另外，应注意采用最佳培养条件，以确保微生物充分生长并使计数结果呈现良好的重现性。二、消除抑菌性的方法消除药品抑菌性常见的方法有：化学中和法、稀释法和薄膜过滤淋洗法。在微生物检查中，根据检品的具体情况，也可将此3种方法适当组合使用。（一）化学中和法化学中和法是抑菌效力测定（Antimicrobialefficacy）中首选的方法。药品或其组分具有抑菌作用时，选用一定的化学中和剂，加入其中，以方便而快捷地中和抑菌剂，消除抑菌作用。有些化学中和剂在有效消除抑菌作用的同时，对微生物有轻微的伤害作用，这点应在验证过程中注意。表3—3列举了适用于消除各类种化学抑菌剂的相应中和剂名称以及曾报道过它们（中和剂）对特定微生物所具有的毒害作用。无论是采用薄膜过滤，还是直接接种法，某具体品种进行无菌检查或微生物限度检查所用的微生物方法检验方法必须经过验证。搞清检品是否具有抑菌作用，或检品中是否添加化学抑菌剂是检验方法验证的先决条件。根据检品抑菌作用的大小和药典的通则要求，需设计方案，通过试验确认化学中和剂的浓度、加量及其他有关的检验条件。抗生素对化学抑制剂并不敏感，在无菌检查或微生物限度检查中，应根据具体品种采用不同的酶（如青霉素酶）将抗生素活性破坏后，方能进行检验。这类方法均须验证。（二）稀释法消除药品抑菌性的第二种方法是稀释。实验表明，化学抑菌剂的浓度与其抑菌效果相关。不同抑菌剂在不同浓度下的抑菌作用各不相同。但对某一特定的抑菌剂来说，抑菌剂浓度与抑菌效率呈指数关系，可用下式表示：152Cnt=k式中，C表示抑菌剂的浓度；t表示杀灭标准菌株所需要的时间；k是一个常数；浓度指数n,是lgt与lgc作图所得直线的斜率。抑菌剂的n值越高，越易通过稀释的方法消除检品的抑菌性；抑菌剂的值n越低，则越难通过稀释法消除其抑菌性。3－3抑菌剂常用的化学中和剂中和剂抑菌剂类别中和剂的抑制对象重硫酸盐稀释液甘氨酸卵磷脂钙或镁离子吐温巯基乙酸硫代硫酸盐戊二醛、汞类酚类、酒精、醛类、山梨酸酯醛类化合物季铵盐类化合物、二重双胍类、对羟基苯甲酸酯类EDTA季铵盐类化合物、碘酒、对羟基苯甲酸酯类汞类、卤酸类、醛类非芽孢类细菌生长态细胞细菌葡萄球菌类及芽孢葡萄球菌类（三）薄膜过滤法在药品微生物学检验中，尤其是无菌检查，常用薄膜过滤法来消除药品的抑菌性。该法基本原理是当抑菌产品通过滤膜时，微生物被截留在滤膜上，具有抑菌作用的检品被过滤掉，过滤过程消除了检品的抑菌作用。经过滤后，将滤膜置于规定量（通常为lOOml）的特定培养基内，在适当的条件下培养，观察其是否有微生物生长。残留于滤膜上的抑菌剂仍有一定的抑菌作用，因此，应尽可能采用对检品具有低吸附性的滤膜（如聚偏四氟乙烯），以便减少抑菌作用；此外，可通过稀释防腐剂或淋洗滤膜的方式来进一步消除残留物的抑菌作用。所用的稀释液或淋洗液应比较温和，如0.1％的蛋白胨水溶液。当淋洗液中需添加化学中和剂时，要保证滤膜上的残留物对截留在滤膜上所有微生物的生长无不良影响。三、药品微生物检查方法的验证——生长比较法微生物检查法准确与否的核心是对抑菌性的有效消除。而对抑菌作用的有效153153153153消除须经验证。微生物检查法的验证通常采用生长对比法。以下对生长对比法作简要介绍。（一）方法验证概述1．试验方法试验需分3组进行。（1）检品组——接有试验菌株的中和检品组按照常规检品的微生物检验法进行，加入抑菌中和剂，最后接人已知量的菌株（少于100个菌），培养计数，看该试验条件下能否恢4复生长，它和化学保的回收率试验十分相似。（2）对照组――接有试验菌株的缓冲液试验组用蛋白胨代替检品，即以0.1%的蛋白胨溶液作为供试品，菌株接种操作同（1）。（3）菌种活性检查组――不含检品或中和剂的空白对照组不加抑菌中和剂，将试验菌株直接接种培养。2．合格标准在确定药品抑菌消除方法的验证合格标准时，需兼顾中和剂的效力和剂的毒性两个方面。验证试验的数据应能证明所采用的中和法能有效消除药品的抑菌力（中和剂的效力），与此同时，它对微生物的正常生长应无不良影响（剂的毒性）。达到了这两方面的要求，微生物检验方法即通过了验证。3．结果判断如果检品组与蛋白胨对照组的微生物计数相似，表明所用中和剂（中和剂的类别及用量）具有足够的中和效力；如果蛋白胨对照组与菌种活性检查组的生长数量相似，表明所用中和剂的毒性不影响微生物的生长。验证试验必须证明检品经适当的中和法处理后，不会抑制较少量（少于100个菌）的微生物生长即检品组、对照组、菌种活性检查组的微生物计数接近。在比较检品组与菌种活性检查组的微生物生长结果时，如果检品组的生长结果与菌种活性检查组——空白对照组的不同，则应考虑中和法中所设定试验条件不适宜微生物的生长，该微生物检查方法不能通过验证，须继续摸索条件，进一步进行验证试验。（二）不同检查法的操作和要点1．平皿菌落计数法美国药典在药品防腐剂的抑菌效力测定试验〈51〉和微生物限度试验〈61〉中，采用平皿菌落（琼脂培养基）计数法来检查存活的试验菌。选择适当的培养基对菌落计数至关重要。检品中微生物能否完全恢复生长，能否在适当的培养条件下（培养温度、湿度以及给氧条件等），于规定时间内易于观察和计数，这与培养基的选用、培养基的质量直接相关。因此，在用对比生长法进行验证时，应当综合考虑各种因素，设计好验证方案。（1）验证试验次数至少需重复进行3次。（2）合格标准检品组的平均菌检计数结果不得低于空白对照组的70％。每次试验均应达标。2．膜滤计数法由于样品可处理的量大、易消除检品的抑菌性以及操作简便等优点，薄膜过滤法被广泛应用于药品的无菌检查和微生物限度检查（无法过滤的样品除外）。过滤膜的材质、孔径以及其与检品的相容性是影响实验结果的关键因素。过滤膜的材质会影响检品的过滤速度以对检晶的吸附性。各国药典均规定，用于微生物检查的滤膜孔径不得大于045»m,并能有效截留微生物。欧洲药典在“无菌检查”一节中明确规定，应根据供试晶的性质选用不同材质的滤膜，如硝酸纤维素过滤膜适用于水溶性、油性和低酒精含量的溶液；醋酸纤维素过滤膜适用于高酒精度溶液。对于特殊检品（如抗菌素），则需用特定的滤膜。由此可见，过滤是检验方法验证中的关键要素。下面分别简要介绍无菌检查和微生物限度检查中薄膜过滤法的验证。按无菌检查的操作程序，在同一型号的每个过滤器或过滤筒内过滤规定量（指容器及每容器的过滤体积）的检品，必要时，可再淋洗滤膜3次，每次淋洗液用量为100ml，在最后一次淋洗液中接人验证用菌种，接种量小于100CFU；另取一过滤器或滤筒，不过滤检晶，重复以上淋洗操作，作为阳性对照。视具体方法，将整张滤膜或半张滤膜转移至100ml的指定培养基内，或将培养基加入到装有滤膜的滤筒内。对表3－4中所列菌种及相应的培养基逐一进行验证，并将容器置于适当的温度下培养，培养时间不超过7d。如果检品培养基容器内的培养结果显见微生物生长，且与阳性对照容器，内的结果相似，则验证通过。在日常无菌检查中所用检品的量、淋洗液量、淋洗次数、培养基种类及数量，均应与验证时用的一致；如果与阳性对照相比，检品容器内微生物生长现象不明显，则说明该检验量在此检验条件下有抑菌作用，需增加淋洗次数，或通过更换过滤膜、使用中和剂等方法，重复以上试验，直至符合要求为止。与微生物限度检查相同，供试品经过滤后，用稀释中和液淋洗滤膜两次，每次100ml。第二次淋洗后，在另100ml淋洗液中接人对照菌株(不超过100个菌)，对滤膜进行第三次淋洗。将滤膜转移至适当的琼脂培养基上培养，作为检品组；另一组以0.1％的蛋白胨溶液作为供试品液，重复上述操作，用作阳性对照组；再将与上述接种量相等的菌液直接接种于固体培养基上，作为菌种活性检查组。通过阳性对照组的微生物生长结果与菌种活性检查组结果比较，就能得出过滤法本身所导致的微生物减少程度；通过检品组与阳性对照组的结果比较，就会获得检品抑菌性的消除或中和效果资料。154验证试验次数至少需重复进行3次。合格标准检品组的微生物生长结果与阳性对照组的生长结果相似。3．液体培养基法如无菌检查中的“直接接种法”所用培养基能使所有的微生物生长，那么，它证明微生物检查用肉汤培养基能同时起到消除抑菌性和促菌生长的作用。在此条件下，可根据检品特性及培养基种类，确定合理的中和方法，用平皿菌落计数法(琼脂培养基)中所述各试验组完成方法验证。各试验组的培养基中，如果在7天内所有微生物生长情况均相同，则方法通过验证。四、更换培养基的验证在上述各验证试验中，所用挑战微生物均未与抑菌剂接触，没有受到伤害，但在防腐效力测定时或对抑菌性药品进行无菌检查时，微生物均与抑菌剂接触并受到伤害。由于在这两种情况下，微生物状态不同，因此，有时需要考虑更换培养基，以取得更能反映实际的菌检计数结果。为验证培养基的变更对受伤微生物恢复生长的影响，可先将微生物接种于产品内一段时间，并将其接种于欲代替的培养基上生长，再将未与产品接触过的微生物接种于原方法中规定的培养基上生长，比较两者的生长情况。在微生物死亡速率太快时，试验没有意义。如微生物与产品的接触后，只是受伤，在一定的培养条件下，仍能恢复生长，此时，可将浓度小于100CFU/ml的微生物与产品按两个不同的时间接触，分别培养，观察结果，以验证培养基变更的影响。(1)验证试验次数至少进行3次。(2)验证合格标准如果所选用的培养基上的微生物数量与原方法规定的培养基上生长数量之差每次平均小于0.5个对数单位，则所选用的培养基符合要求。美国药典24版和欧洲药典2000年增补版中有关药品微生物学检验用微生物名称及其代号见表3－4，表3－5。表3－4药品菌检计数用培养基的灵敏度检查试验及检验方法验证试验用微生物菌种①(USP24)培养菌种名称ATCC编号温度厂C条件大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC873932土2.5有氧金黄色匍萄球菌(SCdphylococcusaureus)©ATCC653832土2.5有氧铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa扁ATCC902732土2.5有氧生抱梭菌(ClostridiuJsporogenes)④ATCC1143732土2.5有氧枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)ATCC663322土2.5有氧白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC1023122土2.5有氧黑曲霉菌(Aspergillusniger)ATCC1640422土2.5有氧菌株来源：美国菌种保藏中心(AmericanTypeCultureC011ection，10801UniversitB1vd．，Manassas，VA20110—2209)。可用枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis，ATCC6633)代替金黄色匍萄球菌(SCdphylococcusaureus)。可用藤黄微球菌(Micrococcusluteus，ATCC9341)代替铜绿假单胞菌。如需非芽抱菌株，可用普通类杆菌(Bacteroidesvulgatus，ATCC8482)代替生抱梭菌。注：从ATCC原始菌种取出后，菌种的传代次数不得超过5代。第五节确认及验证示例一、仪器确认示例本节共举了两个示例，说明分析仪器确认的内容。对于计量仪器，只需进行分析仪器155确认中的安装确认和校正，这里不再重复。表3—5培养基灵敏度检查及菌检计数法验证用微生物品种(Eu.Ph.2000增补)微生物培养条件菌种名称最佳菌株温度/C最长培养时间/d5555类型：需氧菌所有需氧菌金黄色葡萄球菌ATCC6538CIP4.83NCTC10788NCIMB9518枯草芽孢杆菌ATCC6633CIP52.62NCIMB8054铜绿假单胞菌ATCC9027NCIMB8626CIP82.11830—353类型：厌氧菌所有厌氧菌梭状芽孢杆菌ATCC19404CIP79.330〜353类型：真菌所有真菌白色念珠菌ATCC1023lCIP4872ATCC209lIP1180.79黑曲霉菌ATCC1640420〜25【示例1】熔点测定仪的确认(表3－6)表3－6熔点测定仪确认仪器名称：熔点测定仪代号：L21生产厂家及型号：BUCHI510N设备登记号：536764页次：起草/日期：曹XX批准/日期：程鬃仪器负责人：肖XX1．概述本仪器为BUCHl510N型熔点测定仪，专供测定样品的熔点之用。由加热器、搅拌器、传温液等部件组成，升温速度可选择不同档次控制。2，安装确认参加人员肖XX、王XX。检查清单(表3－7)维修服务服务单位名称：技术服务部地址：联系人：电话号码：传真号码：银行账号：156结论所有物品与检查清单相符。实验室水、电、气设计安装合理，实验室通风系统运行良好，符合仪器安装要求。签名/日期：肖XX表3－7检查清单名称编号数量存放处负责人签收采购定单操作手册维修手册设备卡使用手册备件清单熔点温度计测定熔点用毛细管照明小灯泡传温液硅油建厂时统一进口L2l—lL2l—2L2l—3L2l—4L2l—5l本l本l本共3支2管（进口）4只（进口）500ml（进口）进口设备科QC－208室QC－208室化学实验室QC－208室QC—208室QC备品备件库QC备品备件库QC备品备件库QC备品备件库李XX肖XX肖XX肖XX肖XX王XX王XX王XX王XX王XX3．运行确认（表3—8）目的为在不使用任何试样的前提下，确认该仪器达到设计要求表3—8运行确认检查内容检查项目认可质量标准检查结果熔点观察灯正常明亮符合要求升温速度控制实测值不得超过设定值的±20％符合要求设定升温速度/°C・min—10.20.51.02.03.0实测升温速度/C・min0.20.41.01.92.9偏差/％020％05％3.4％熔点温度计一般由指定机构定点生产、校正，故运行确认中不包括此项。4．性能确认目的使用供试品以确证仪器性能符合规定要求。确认步骤分别取甲硝唑和甲氰脒胍适量，按中国药典2000年版二部WC熔点测定法第一法进行测定，平行测定3次。合格标准3次结果偏差不得过±0.5°C。测定结果(表3－9)表3－9测定结果样品名称规定熔点/C实测熔点/C甲硝唑甲氰脒胍159〜163140〜145160.0〜162.3142.5〜144.6160.1〜162.6142.3〜144.5160.3〜162.6142.6〜144.6结果偏差均小于0.5°C，符合要求。5．防性维修每隔一段时间需对此熔点测定仪进行例行维修，以确保其符合要求。(1)内容(表3－10)(2)周期初定为每三个月一次。以后视实际使用情况进行修订。157【示例2】高效液相色谱仪的确认(表3－11)1．概述表3－10防性维修检查内容检查项目认可质量标准熔点观察灯正常明亮升温速度控制用一秒表检查升温速度，实测值不得超过设定值的土20％表3－11高效液相色谱仪确认仪器名称：高效液相色谱仪代号：L15生产厂家及型号：HPllOO设备登记号：501732页次：起草/日期：刘XX批准/日期：陈XX仪器负责人：刘XX本仪器为HP1100型高效液相色谱仪，配有四元梯度泵、自动进样器、柱温箱及紫外检测器。2．安装确认参加人员朱XX、刘XX。检查清单(表3－12)维修服务服务单位名称：Agilent科技有限公司地址：联系人：电话号码：传真号码：银行账号：表3－12检查清单名称编号数量存放处负责人签收采购定单操作手册设备卡备件清单1100四元梯度系统自动进样器柱温箱紫外检测器HP计算机打印机进样针900卩l针密封圈氘灯手拧接头建厂时统一进口L15—1L15—3L15—510本11l11l21袋24进口设备科QC－208室化学实验室QC－208室QC－208室QC－208室QC－208室QC－208室QC－208室QC－208室QC－208室QC－208室QC－208室QC－208室李XX刘XX刘XX朱XX刘XX刘XX刘XX刘XX刘XX刘XX刘XX刘XX刘XX刘XX结论所有物品与检查清单相符。实验室水、电、气设计安装合理，实验室通风系统运行良好，符合仪器安装要求。签名/日期：刘XX3．运行确认目的为在不使用试样的条件下，确认该仪器达到设计要求。(1)试验项目及限度(表3－13)158(2)试验方法及结果流量控制阀方法。流量分别设定为0.5ml/min、l.Oml/min、1.5ml/min,用一lOml容量瓶接收流动相，同时计时，各重复3次。以流出lOml流动相所需时间计算流量。表3－13运行确认的试验项目及其限度各设备名称仪器中各组件试验项目限度流量控制阀流速准确度土5％泵流动相比例控制阀流动相混合比例的准确度±[F(1－F]1O％，F为所测流动相0.060.060.060.06组分所占的体积比自动进样器进样体积控制阀精密度RSD应W1.0%柱温箱温度控制器准确度精密度W±3.0°C，波动应在1.0°C内单色器准确度±3nmUV检测器光电管线性相关系数不得小于0.999结果（表3—14）表3－14流量控制阀检查结果流量/ml•min—1第1次时间/min第2次时间/min第3次时间/min平均流速/mlmin偏差/％0.51.01.519.9710.026.7020.0210.006.6820.0510.076.680.49970.99701.49550.336.036.236.036.236.036.236.036.2+l.0+l.00.3结论。偏差均小于5%,符合要求。流动相比例控制阀方法。因日常检验仅用二泵，另两泵用于清洗，因此仅检验二泵的流量比。将泵编号，分别为A、B、C、D，A、B泵用于实验，C、D泵用于清洗。现对A、B泵的流动相比例进行检测。设定流动相A和流动相B的比例为l：l,流速为l.Oml/min。取两个10ml量筒，分别装入流动相A和流动相B，开始运行同时计时。5min时记录消耗的流动相A和流动相B的体积。重复3次。b结果（表3—15）3－15流动相比例控制阀检查结果流动相第1次体积/ml第2次体积/ml第3次体积/ml平均体积/ml允许偏差/%实测偏差/%流动相A流动相B4.995.0l4.985.024.985.0l4.985.0l+2.5+2.5—2.0C.结论。偏差均小于允许值，符合要求。进样体积控制阀方法。制备一样品溶液（仪器公司推荐用咖啡因标准溶液，无条件者也可选用日常HPLC检验方法中所用的对照品溶液。若用咖啡因标准溶液，则选用仪器公司推荐的仪器条件；若选用本公司的对照品溶液，则按相应的方法条件进行试验），设定进样体积为10口1,连续进样6次，计算相对标准偏差（RSD）。结果（表3—16）表3－16进样体积控制阀检查结果123456RSD/％208624.14206992.56205321.83205943.20208296.79204267.930.83159结论。进样体积精密度小于1.0%，符合要求。柱温箱方法。温度设为36°C,将一经过校正的温度计放入柱温箱，每隔30min读取温度计显示温度及柱温箱显示温度一次。共读取5次。结果（表3—17）结论。与温度计读数偏差最大为0.C5，小于3.OC，准确度符合要求；柱温箱显示读数波动最大为一0.3C，小于1.OC，精密度符合要求。表3—17柱温箱检查结果项目30min60min90min120min150min180min温度计读数/C柱温箱显示读数/C36.5进样体积为进样体积为10口1。36.136.136.036.236.036.235.936.335.7紫外检测器a.单色器•方法。主要检测波长的准确度。通过测定一已知光谱特征的物质，来确定波长的准确度。方法有多种，可根据实际情况任选一种。•以仪器本身光源检查。如为氘灯，检查656.1nm；如为氢灯则检查379079nm、486.13nm和656.28nm。•用苯的乙醇溶液（160口g/ml）在233.9nm、238.9nm、243.3nm、248.5nm、254.5nm和260.6nm处检查。•利用汞灯的较强谱线237.83nm、253.65nm、275.28nm、296.73nm、313.16nm、334.15nm、365.02nm、404.66nm、435.83nm、546.07nm、576.96nm进行检查。•利用钦玻璃在279.4nm、287.5nm、333.7nm、360.9nm、418.5nm、460.0nm、484.5nm、536.0nm、637.5nm的谱线进行检查。因钦玻璃来源不同会有微小差别，使用时应注意。•采用仪器公司推荐的0.125mg/ml咖啡因溶液进行波长校正。咖啡因在272nm处应有最大吸收，在244nm处应有最小吸收。本文采用苯的乙醇溶液进行检查。•结果（表3－18）表3－18单色器检查结果规定波长/nm实测波长/nm误差/nm规定波长/nm实测波长/nm误差/nm233.9238.9243.3233.6238.5243.3－0.3－0.40248.5254.5260.6248.9254.7260.8+0.4+0.2+0.2•结论。波长误差均小于3nm,符合要求。b光电管•方法。取咖啡因对照品（仪器公司推荐用对照品）,配制成浓度分别为0.50□g/ml、0.75口g/ml、1.00口g/ml、1.25口g/ml、1.50□g/ml的一系列标准溶液，进样,按浓度和峰面积计算相关系数。•结果(表3—19)表3－19光电管检查结果浓度/ug・ml—0.500.751.001.251.50面积31691.469539.4101927.6136177.8170429.2相关系数0.99974•结论。相关系数大于0.999，符合要求。1604．系统适用性试验在实验进行前，均需进行系统适用性试验，应符合中国药典的要求。详细内容从略。5，预防性维修每隔一段时间需对此HPLC仪进行例行检修，以确保其符合要求。内容(表3—20)周期初定为每三个月一次。以后视实际使用情况进行修订。表3—20预防性维修的检查内容检查项目认可质量标准流动相流速流动相比例进样器精密度柱温箱温度UV检测器波长UV检测器吸收度偏差不超过±5％应符合运行确认项下要求相对标准偏差不得超过1.0％与设定温度偏差不得超过±3.0°C,—天内温度波动不得超过1.0°C波长偏差不得超过3nm线性相关系数不得小于0.999二、检验方法验证示例【示例1】10％脂肪乳注射液中甘油含量测定方法验证1．概述脂肪乳中甘油含量的测定，已由部颁标准二部第六册收录。本节所讨论的方法验证是此方法在升为部颁标准前，为企业标准时厂方所进行的验证。2．原理样品中加入足量的高碘酸钠，使甘油氧化为甲酸和甲醛。过量的高碘酸盐通过加入l，2－丙二醇消除。生成的甲酸用氢氧化钠中和，通过消耗的氢氧化钠量即可计算出样品中甘油的含量。3．试剂及设备13mg/L高碘酸钠溶液；1,2—丙二醇，分析纯；O.lmol/L氢氧化钠滴定液;0.05mol/L硫酸；甘油；XX制药有限公司产10%脂肪乳注射液，批号为L3842804．验证项目及限度精密度不得过0.2%。准确度回收率应为98.0%〜102.0%。线性相关系数不得小于0.999005．验证内容及结果(1)精密度a.方法。按部颁标准规定方法检查甘油含量。平行制备6份样品，记录结果并计算相对标准偏差。b结果(表3—21)表3—21精密度验证结果样品序号l23456含量/mg・m1—122.5022.4922.4922.4822.452252平均值/mg•ml—122.4926．5526．5526．5526．554.041616.16634.041616.1663相对标准偏差/％0.10(2)线性、准确度和范围方法。配制一系列浓度的甘油溶液(不少于5个)，按方法进行测定。由甘油浓度和消耗的0.lmol/L氢氧化钠滴定液得回归方程，计算相关系数。另采用标准加入法，将配制的甘油溶液加入10％脂肪乳中，按方法进行测定，计算回收率。回收率发生明显偏差时，说明161已不在范围内，从而确定方法范围。结果(表3—22)结论。方法适用范围为0〜46mg/ml；在此范围内，以甘油浓度和消耗的氢氧化钠体积计算回归方程，相关系数为1.000；平均回收率为99.7％。均符合验证要求。粗放性主要考察反应时间对结果的影响。①本方法中共涉及两步反应，一是高碘酸钠和甘油的反应，所耗时间为t],另一是1,2—丙二醇和过量的高碘酸钠的反应，所耗时间为t2。试验分3步进行。同时改变t]和t2，记录试验结果，见表(3—23).从结果可知，当t]/t2均大于45s时，结果恒定。表3—22线性、准确度和范围的验证结果甘油溶液浓度消耗滴定液体积/ml样品加甘油/mg・m1—1回收率/%/mg•m]—1第一份第二份第一份第二份第一份第二份00.40421.616624．249440．415646．01780．0550．2200．8803．5025．2419．9550．0560．2220．8763．5085．2459．95722．49①22．8924．1026．5338．5346．7550．4②22．8924．1lttl／3t2／sttl／3t2／s38．6146．6150．4②99．099．6100．099．2100．069．399．0100．2100．499．799．569．3r=l.000平均值：99．7；RSD：0.5％①此值为精密度试验中所得样品结果的平均值。②此浓度时回收率低是因为加入的试剂已不能将样品中大量甘油反应完全，计算平均回收率时不包括此项结果。表3－23改变t1、t2考察反应时间对结果的影响t1／st2／s测得样品浓度/mg•ml」#染率下计算的通过无菌检查的概率如表3－57。表3－57取样数、污染率及通过无菌检查概率关系通过无菌检查的概率／％编号取样数污染率／％l2410152050l234551015203095908580709081726449816641246035201134621940．53612410．180.50．030.0012X10%按表中的数据可以作无菌检查抽检特性曲线。见图3—15、图3—16。199对表中的数据及抽检特性曲线进行分析，可以得出3个结论。无菌检查存在明显的局限性，在取样数小时，这种局限性尤其突出。从表中可以看出，一批中染菌为10％，取样数为4，通过无菌检查的概率为66％，即使把取样数增加到20，则通过无菌检查的概率也只有降低到12％，即几乎每作10批无菌检查，仍有l批可误判为合格。现再以实例从另一个角度来看无菌检查的局限性，设取样数为2，当无菌检查可信度的期望值为95%，求批染菌率q是多少？把n=2和95%代入式：95%=l—(l—q)2l—q=0.2236所以q=77.64%,即每批抽2个样品进行无菌检查时，只有批污染的比例超过77.64%时，污染批的无菌检查才能获得阳性的结果(检出的概率也只有95%)。可见，仅以无菌检查的结果作为判别批无菌合格与否的依据，将具有很大的风险。批产品的染菌率越低，根据无菌检查的结果来判定批的无菌，其风险就越大。一个批中有30%的染菌率而取样数为2时，通过无菌检查的概率尚只有49%。当染菌率下降到5%时，若取样数仍为2，则误判合格的概率上升到90.25%，即5%产品染菌的批，每作10批无菌检查，竟有9批可误判为无菌检查合格。同一个污染水平条件下，增加无菌检查的取样数，在一定程度上可以提高无菌检查的可信度。WHOGMPl992在其无菌产品附则第17.40条中规定，在95%的置信度下，无菌灌装产品允许的染菌水平不得大于0.1%，用以验证无菌灌装工艺条件可靠性的培养基灌装法，也可按同一公式来计算，当灌装量为1000瓶时，可算出此条件下通过无菌检查的概率为(1—0.001)1000=36.7%检出染菌的概率仅为63.3%，当取样数增加3000时，培养基灌装法即获得了可接受的可信度。这时，检出批染菌的概率则达到1—(0.999)3000=95.03%。众所周知，培养基灌装是一种特殊形式的无菌检查，灌装数可看作取样数。从以上的计算可以看出，在对产品污染控制比较高(产品实际污染比较低)的情况下，取样数的增大，对检出污染品的概率改观不大。如再考虑药典规定一般无菌检查法的实际情况，增加取样数时，无菌操作污染的风险也会增加，因此，过多地增加取样数并不是保证产品无菌的适当途径。无菌检查这种令人担忧的局限性促使人们努力探索确保注射剂无菌可靠性的途径。无菌灌装工艺的培养基灌装检查法以及灭菌产品无菌保证概念引入则是人们长期以来努力探索所获得的两大硕果，后者将在以下的章节详细讨论。二、灭菌和无菌保证1．灭菌达标的涵义什么是最终灭菌产品无菌的标准?就湿热灭菌而言，有人认为F0不低于8是灭菌完全与否的标准，这种理解是不全面的。1980年以后，在英、美国药典的规定中长期以来有过标准及手段共存的历史，即在阐述标准时，同时提到对水针剂而言，一个经生物指示剂验证湿热灭菌程序，赋予灭菌柜每一瓶产品总的标准灭菌时间几不低于8min,通常即认为符合要求。这种阐述方式可能会使人产生误解，以致将F0大于8当成了灭菌达标的标准。然而，自1995年起，在USP23〈1211〉药品的灭菌及无菌保证中，不再有F0大于8的提法。现行的欧洲药典及BP均删除了％不低于8即认为符合要求，从而结束了标准与手段同时阐述的历史。在制药工业实践中，耐热性差的产品，在几低于8时，只要强化工艺控制手段，仍能达到无菌的标准；相反，当工艺失控时，F。大于8时，也不一定能达到无菌的要求。从以下国外药典的摘录，可以清楚地看出，污染概率低于百万分之一是国际公认的标准，它意指灭菌后产品达到的无菌状态。欧洲药典1997年版无菌保证水平(SAL)系指一项灭菌工艺赋予产品无菌保证的程度。一项灭菌工艺的无菌保证水平用该灭菌批中非无菌品的概率来表示，如SAL为10－6，系指在一百万瓶最终灭菌产品中活菌的数量不超过一个。欧洲药典1997年版第5.1.1节无菌产品制备法中有这样的论述：对最终灭菌产品(蒸汽灭200菌法)来说，水针剂的标准灭菌条件是121°C15分钟。也可采用其他温度及时间参数，只要能有效地证明该工艺在日常运行过程中始终赋予被灭菌品的灭菌效果在规定的限度内，即所采用的工艺和监控措施应能确保无菌保证水平小于10－6。USP24版<1211>药品的灭菌及无菌保证提到当用灭菌柜对无菌产品或关键性设备进行最终灭菌时，通常要求灭菌工艺赋予产品的无菌保证值达到10－6，即在一百万个已灭菌品中活菌的数量不得超过一个。BP1998Annex2：当灭菌程序按照几的概念来选定时，应当采取特别措施来确保始终获得足够的无菌保证。除对灭菌程序进行验证外，还必须在生产过程中连续地、严格地对微生物进行监控，证明污染菌指标低于设定的限度，以使污染品在最终产品中所占概率低于百万分之一。（4）2000年版中国药典附录XW灭菌法已与国际接轨，但在文字阐述中仍有标准灭菌时间F0不低于8，即可认为符合要求的提法，在这里，应当注意正确理解几（标准灭菌时间）与灭菌应达到无菌状态（标准）之间的关系。有人曾提出这样的问题，说既然最终灭菌产品的无菌达到百万分之一的污染概率即予认可，那么，当生产超过一百万瓶时或超出一百万批时，就允许有污染的产品了，这与无菌的定义是否矛盾?这一问题其实是对百万分之一概率的不理解。对此的回答，需要从对数规则的假设条件谈起，微生物的灭活是一个极为复杂的过程，对数规则的数学模式只是对这一过程近似的、简化了的描述。从灭菌的角度上看，当最终灭菌使污染达到低于百万分之一概率时，产品已具备了足够的安全性，产品是事实上的无菌（参见生物指示剂验证）。要理解我国药典附录灭菌法规定的无菌合格标准，还需要弄清一个问题，即作为最终灭菌产品无菌的标准——低于百万分之一污染概率到底是个什么概念?它与产品中污染菌存活概率间是什么关系?这个问题说到底，是用对数规则对某一瓶产品污染菌存活概率计算的结论能否适用于整个的批?通过以下实例来讨论无菌的概念，即微生物存活的概率，可能比较容易

理解。①例子A。某瓶产品121°C下污染菌的D值为lmin,初始污染菌的量N0为10000个，121C下灭菌时，存活数如表3—58。表3－58例子A的存活数灭菌时间/min每瓶存活数指数表示式灭菌时间/min每瓶存活数指数表示式012310000100010010104103102101456710.10.010.00110010—1010—10—31010灭菌4min时，此时瓶内有1个菌，所有产品均为污染品。经7min灭菌后,每瓶产品中污染菌存活的概率达到10－3，即千分之一。②例子B。某批产品为1000瓶，121°C下污染菌的D值为lmin,初始污染菌的量N0也为10000个/瓶，将这批产品中总的污染菌数看成一个整体，在121C下灭菌时，这批产品中存活的微生物数如表3－59。表3－59例子B的存活数灭菌时间/min批存活菌数指数表示式灭菌时间/min批存活菌数指数表示式012310000000100000010000010000107106lO510445671000100103102101100经7min灭菌后，此批产品中只有一个活的菌，即污染品的概率为千分之一。A和B等201价。如果初始污染程度相同，在相同的灭菌条件下，用对数规则计算得到的某一瓶产品中污染菌灭菌后存活的概率等于该批存在污染品的概率。所以，在某灭菌批中，如某瓶微生物存活的概率低于百万分之一时，该批产品即达到了无菌(灭菌完全)的要求。应当说明，灭菌后，每瓶已灭菌品中哪怕只有一个污染菌时，污染概率均为100％，在污染菌N下降至100后继续灭菌时才有污染产品在批中占的概率二污染品数/批次量(3—20)某批产品中污染品数二某瓶产品中污染菌存活的概率X批次量(3—21)如将式(3—21)代人式(3—20)的右边，得污染品在批中占的概率=某瓶产品中污染菌存活的概率2.生物指示剂(Bls)对数规则研究和适用的对象是有一定耐热性的孢子，虽然将热电偶置于被灭菌品内，可获得灭菌程序中监控所必须的温度—时间数据，并根据热穿透数据来估算灭菌程序对微生物的杀灭效果，但生物指示剂的完全或部分杀灭，则是评价一个灭菌程序有效性更好的方法市售的生物指示剂有多种形式。活的细菌孢子既可以滤纸、玻璃纤维或不锈钢等为载体，也可直接接种到产品中去。当孢子接种到液体产品时，孢子的耐热性有时会出现增强或减弱现象；有时所用耐热孢子甚至与产品完全不相容。在后一情况下，可用生理盐水或其他溶液来代替产品进行试验，但所用的替代晶与产品必须具有相似的物理和化学性质（如黏度和pH）,此外，耐热抱子在替代品中的D值不得低于其在产品中的D值。USP24在＜1035＞中收载了常用生物指示剂的使用要求、适用范围及有关注意事项。对过度杀灭的灭菌程序来说，每一抱子的载体（如菌膜、菌片、安瓿等）一般含有5X105〜5X106个抱子，D121°C。在1.5〜3.0min之间，过度杀灭程序要求抱子数与其D值的组合保证F0在12以上。当产品热稳定性较差，在灭菌过程中容易出现降解时，必须对灭菌前生物负荷进行详细的调查，以确定适当的灭菌程序，然后进行验证。在此情况下，必须十分注意选用适当耐热性的生物指示剂，以致它确能起到生物指示剂的作用。要是生物指示剂的耐热性比生物负荷监控中污染菌的耐热性低，或生物指示剂的量和日常生产生物负荷处在同一水平，即使在形式上勉强通过了灭菌程序的验证，在日常生产中，无菌评价将成为一大难题。USP24＜1035＞中还提到：在实际使用时，可能需要采用生物指示剂抱子量特别大、耐热性特别低的组合方式，如在手术室急救用外科器具灭菌时，每一抱子载体（如菌膜、菌片、安甑等）的抱子量可高达109,但其D121C,在却只有0.1〜0.2min。因为这种组合方式在手术室更切合验证及监控的需要。当然，绝不能将这种方式简单地套用到无菌产品上，因为耐热的产品在F0较高条件下，其安全性毕竟更好。生物指示剂的特性包括每一载体中耐热孢子的数量以及在实际使用条件下的D值和Z值。一些常用于湿热和干热灭菌工艺验证的生物指示剂列于表3－60。表3－60热力灭菌工艺常用的生物指示剂灭菌方式微生物(抱子)D值范围/min湿热121°C嗜热脂肪芽抱杆菌Bacillusstearothermophilus1.5〜3.0121°C枯草芽抱杆菌Bacillussubtilis凝结芽抱杆菌Bacilluscoagulans梭状芽抱杆菌Clostridiumsporogenes0.3—0.70.4—0.80.4〜0.8干热150°C枯草芽抱杆菌黑色变种Bacillussubtilisvar.nzger>1.03．无菌标准的数学模式前文的讨论中提到，在T(C)灭菌时，药典规定无菌标准的数学模式可用下式表示：FT=DTXlgN0+6XDt或6XDt=Ft—DtXIgN0如果所选用的灭菌温度为121.1C,那么，上式中和T(C)灭菌时间变为F0,微生物耐热202参数应使用d121c，于是可得到以下表示式：6XDi2iC+Di2iCXlgNo=Fo由于药典规定污染菌存活概率不低于10—6，因此，药典对无菌保证的要求最终用下式表示：(F0—D121cXlgN0)/D121C±6T（°C）灭菌及121°C灭菌率之间的换算可以利用以下公式:灭菌率L=1O（t_i2i）/z=Fo/Ft=Di2ic/Dt这给灭菌程序的设计、验证带了诸多方便条件。以下将以示例说明公式的实际应用。4．F0在灭菌程序设计及验证中的应用（1）灭菌程序％的计算在理想状态下，即假设灭菌过程中药液的升温和降温能在瞬间完成，灭菌温度恒定不变，此时利用式FT=DTXAlgN即足以满足灭菌程序设计和无菌保证等有关参数计算的需要。如果药液中灭菌前总带菌量为Q。灭菌后被杀灭至100，则AlgN=lgQ,Ft=DtXlgQ标准状态下，F0=Di2iXlgQ然而，一个产品的灭菌周期实际上总有3个阶段:升温，保温和冷却。也就是说灭菌过程不可能始终在恒定温度下完成。根据L=10（t_12i）/z或查附录，可以获得不同温度T下的灭菌率L,并把图3—17的温度时间曲线转换成灭菌率一灭菌时间曲线。灭菌程序赋予产品的标准灭菌值F。即L—t曲线所围的面积。F0=At》10（T_121/1O上式及图3—17中:At为测定的间隔时间，通常二次测定的间隔时间取lmin；t］为药液升温过程中达到100C时的时间；t2为药液冷却过程中下降到100°C的时间。在100C以下，L值可以忽略，因此F0只累计t1至t2过程中的灭菌值。例：蒸