DB37-T 3479-2018苹果苗木传带病虫害检测与防控技术规范

ICS65.020B16

DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T3479—2018苹果苗木传带病虫害检测与防控技术规范Technicalspecificationfordetectionandcontrolofnurseryappletree-transmittedpests2018-12-29发布 2019-01-29实施山东省市场监督管理局 发布DB37/T3479DB37/T3479—2018II前  言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：青岛农业大学。本标准主要起草人：李保华、王彩霞、董向丽、张振芳、练森、原永兵、刘成连、周涛、曹洪建、任洪春。DB37/T3479DB37/T3479—2018PAGEPAGE7苹果苗木传带病虫害检测与防控技术规范范围准，及病毒检测、病虫害防控和苗传病虫害检测的技术。本标准适用于山东省苹果苗木繁育期间，随苗木传带病虫害的防控。规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T2281苹果病毒检测技术规范术语和定义规范性引用文件确立的以及下列术语和定义适用于本标准。3.1苗传病虫害(SeedlingTransmittedPests)轮纹病、苹果绵蚜、根癌病等。3.2病毒与类病毒（AppleVirusandViroid）造成树体生长发育不良和严重危害的病毒与类病毒，包括锈果类病毒(ASSVd)、坏死花叶病毒(ApNMV)、凹果类病毒(ADFVd)、褪绿叶斑病毒(ACLSV)、茎沟病毒(ASGV)和茎痘病毒(ASPV)六种。3.3非潜隐病毒（Non-LatentVirus）在常规栽培品种上，能造成明显症状和严重危害的病毒或类病毒，主要为锈果类病毒(ASSVd)、坏死花叶病毒(ApNMV)和凹果类病毒(ADFVd)三种。3.4潜隐病毒（LatentVirus）(ACLSV)、茎沟病毒(ASGV)和茎痘病毒(ASPV)三种。3.5无病毒材料（Virus-FreeMaterial）2年～3的繁殖材料或苗木。3.6非脱毒材料（NonVirus-FreeMaterial）指没有经过脱毒处理，不潜带有非潜隐病毒，但带有不超过一种潜隐病毒的繁殖材料或苗木。3.7外源病虫害（ExternalSourcePests）从育苗圃或采穗圃外随气流、雨水、昆虫传入，或主动迁入，并在苗木上侵染定殖的各种病虫害。3.8本源病虫害（LocalSourcePests）或采穗圃内定殖的病虫害。苗圃地选择选择没有交叉感染病虫害或病虫害交叉感染率低的环境，没有病菌或病菌少的地块培育苹果苗木，保持育苗圃清洁卫生。苗圃位置与地块以上，且近5年没有栽植林木及苗木。育苗圃宜选择开阔通风、灌溉与排水条件良好、土壤肥沃地块作育苗地。周围5km范围内不能有桧柏等刺柏科植物。及时销毁废弃的苗木、接穗、病虫栽体、病残体等，始终保持育苗圃清洁卫生。育苗材料扩繁之前检测或检查所有繁育材料，发现带有苗木传带病虫害的材料，及时清除。种子从健康、无毒的母本树上采集。采种前对采种母本树进行病毒检测，发现带毒母株及时清除。采穗圃原种和一级母本树应每年检测一次，非脱毒材料每2年～3年检测一次，及时清除不符合标准的材料。材料获取脱毒材料；或筛选含容易脱除病毒的植株，进行脱毒处理，获得无毒材料或非脱毒材料。病毒检测样品采样时期4月～5月份，苹果萌芽至新梢生长期是采集病毒检测样品的最佳时期。单株样品采集单株样品检测主要用于筛选无毒或非脱毒材料。生长期从旺盛生长的新梢顶端摘取2cm～3cm的嫩芽或嫩梢，每株3个～4个。休眠期剪取20cm～30cm长的枝条，每株1个～2个，或直接剥取0.5cm长的皮层5块～6混合样品采集1个2cm～3cm长的嫩芽，休眠季节每株剪取1个20cm～30cm以取样单元为单位密封于塑料袋中，标记取样单元、取样时间、地点、采集人等信息。保存与运输用0℃～4(280检测顺序再检测非潜隐病毒，逐步筛选出无毒材料。筛选非脱毒材料时，首先检测非潜隐病毒，淘汰带毒材料后，再检测非潜隐病毒。检测策略与方法检测单株样品时，可将多个样品混合检测，发现样品带毒时，再逐个检测，最终找出带病毒植株。检测混合样品时，可分成多个样品检测。RT-PCR检测技术按附录A的方法进行，免疫学检测和生物学检测按NY/T2281的规定进行。病虫害防控苹果苗木繁育期，重点防控腐烂病、轮纹病、苹果绵蚜和根部病害。剪口处理保的油漆作为基质，混入有效成份为0.3%～0.5嫁接后处理冬春季室内嫁接的苗木，嫁接后立即喷淋有效成份含量为0.03%～0.05%的吡唑醚菌酯或0.3%～0.5%甲基硫菌灵药液。根部处理苗木栽植前，用根部处理剂或1%的硫酸铜溶液等对细菌高效的杀菌剂浸泡根部5min～10min后，立即栽植。本源病虫害3%～2%多量式波尔多液或95%机油乳剂80倍～100倍药液等。生长季节，外源病虫害周边5km类、褐斑病、白粉病、锈病、炭疽叶枯病等。苹果绵蚜于5月、6月份和9月、10月份绵蚜迁飞期，用诱虫板监测迁飞成虫，发现有绵蚜迁入时，及时喷撒杀虫剂。若绵蚜已在苗圃内定殖，用药剂灌根或树上喷药彻底铲除。轮纹病和腐烂病雨水少的季节或年份，结合其他病害防治喷施杀菌剂；遇雨量大于10mm，持续时间长于24h雨，雨后及时喷施内吸性杀菌剂。多雨季节或连续阴雨期，每7d～10d剂和保护性杀菌剂交替使用。出圃苗木检测与处理苗木分检与处理起苗后剔除染有病虫和生长不良的苗木，用苗木处理剂处理苗木，或用有效成份为0.03%～0.05吡唑醚菌酯或0.3～0.50.05%～0.10.3～0.5h～48h。苗木质量检测随机选取20株～50株苗木，每3株～5株一组栽植于直径40cm～50cm、深度40cm～50cm的花盆中，浇足水后，移入温度为20℃～30附 录 A（资料性附录）反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测原理RT-PCR是将RNA和cDNAcDNA30～40的凝胶上观察到特异性条带。试剂Trizol试剂：由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，苯酚饱和液（38%）--380ml/L，硫氰酸胍盐（0.8M）--118.16g/L，硫氰酸铵（0.4M）--76.12g/L，醋酸钠（0.1M，pH5）--33.4ml/L，甘油50ml，加水补充至1L。无RNA180℃烘烤60.01体积/体积加入，处理过夜后高压灭菌而得到。75RNA酶灭菌水和无水乙醇配置。氯仿，异戊醇，异丙醇、无水乙醇，反转录酶，DNA聚合酶，DNA分子量标准，琼脂糖。仪器设备2.5µl～1000µlRNA酶0.2ml～1.5ml离心管和10µl～1000µl枪头，PCR扩增仪，紫外分光光度计，凝胶成像体系，电泳槽和电泳仪。操作步骤总RNA的提取按照Trizol法提取总RNA提取试剂盒提取总50mg～100mg苹果组织置于1.5ml离心管中，用液氮研磨成粉末，加入1mlTrizol试剂，注意样品总体积不能超过所用Trizol10研磨液室温放置5min，然后每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15s，4℃下，12000r/min离心10min；取上层水相于一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置10min，12000r/min离心10min；弃去上清液，加入1ml的707500r/min5min；5min～10RNA的溶解度。将RNA溶于DEPC55℃～6010RNARNA可进行mRNA分离，或贮存于7070核酸检测利用紫外分光光度计检测提取的总RNAO26/28>1.8D26≈40μg/mlRA，RNA（μgm）=测得OD值×40。cDNA合成以5μg总RNA为模板，以六碱基随机引物为引物，参照M-MLV反转录酶产品说明书反转录成cDNA一般为20μl的反转录体系：10μmol/l随机引物1.0μl，10mmol/l的dNTPs1.0μl，RNA酶抑制剂0.5U/μlM-MLV酶0.5处理无菌水补足至20μl4213min，-20℃保存备用。PCR扩增检测所用引物见表A.1，PCR反应体系为25μl：反转录产物cDNA1.0μl，10×Buffer2.5μl，10mmol/ldNTPs0.5μmol/l正向引物和20μmol/l反向引物各0.5U/μl的TaqDNA聚合酶0.25μl，加灭菌双蒸水至25μl。PCR反应条件为：953min；9530s，对应引物退火温度（表A.1）复性30s，7230s，35个循环；最后725min。表A.1用于苹果病毒或类病毒RT-PCR病毒名称序列（5′～3′）目标片段/bp退火温度/℃苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)F:GAGARTTTCAGTTTGCTMGAR:AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT79453苹果茎沟病毒(ASGV)F:GGAATTTCACACGACTCCTAACCCTCCR:CCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC50059苹果茎痘病毒(ASPV)F:TGCCTCAAAGTACACCCCTCAGTR:CGCCAAGAAATGCACAGC31658苹果坏死花叶病毒(ApNMV)F:ATGGTGTGCAATCGCTGTCAR:CATCGACCATAAGGATATCA64050苹果锈果类病毒(ASSVd)F:CCGGTG