青霉素的发酵工艺

青霉素的发酵工艺青霉素的发酵工艺青霉素的发酵工艺V:1.0精细整理，仅供参考青霉素的发酵工艺日期：20xx年X月青霉素的发酵工艺作者：佚名文章来源：本站原创点击数：392更新时间：2009-6-2212:36:27

青霉素生产工艺过程

一、青霉素的发酵工艺过程

1、工艺流程

（1）丝状菌三级发酵工艺流程

冷冻管（25°C，孢子培养，7天）——斜面母瓶（25°C，孢子培养，7天）——大米孢子（26°C，种子培养56h,1:）——一级种子培养液（27°C，种子培养，24h,1:）——二级种子培养液（27~26°C,发酵,7天,1:）——发酵液。

（2）球状菌二级发酵工艺流程

冷冻管（25°C，孢子培养，6~8天）——亲米（25°C，孢子培养，8~10天）——生产米（28°C，孢子培养，56~60h,1:）——种子培养液（26~25-24°C，发酵，7天，1：）——发酵液。

2、工艺控制

（1）影响发酵产率的因素

基质浓度

在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制,苯乙酸的生长抑制）,而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成,为了避免这一现象,在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法,即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加,因为即使是超出最适浓度范围较小的波动,都将引起严重的阻遏或限制,使生物合成速度减慢或停止。目前,糖浓度的检测尚难在线进行,故葡萄糖的流加不是依据糖浓度控制,而是间接根据pH值、溶氧或C02释放率予以调节。

（2）温度

青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别,但一般认为应在25°C左右。温度过高将明显降低发酵产率,同时增加葡萄糖的维持消耗,降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说,最适温度不是一样的,一般前者略高于后者,故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间,到达生产阶段后便适当降低温度,以利于青霉素的合成。

（3）pH值

青霉素发酵的最适pH值一般认为在6.5左右,有时也可以略高或略低一些,但应尽量避免pH值超过,因为青霉素在碱性条件下不稳定,容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中,pH值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使pH值降低；过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起pH值上升。

（4）溶氧

对于好氧的青霉素发酵来说,溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到30%饱和度以下时,青霉素产率急剧下降,低于10%饱和度时,则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高,说明菌丝生长不良或加糖率过低,造成呼吸强度下降,同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点,而氧消耗与碳能源消耗成正比,故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。

（5）菌丝浓度

发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度,从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度(取决于维持因数的大小,维持因数越大,呼吸强度越高)、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升,从而提高临界菌体浓度。

（6）菌丝生长速度

用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于时，比生产速率与比生长速率成正比,当比生长速率高于O.015h-1时,比生产速率与比生长速率无关D因此,要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率,必须使比生长速率不低。这一比生长速率称为临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说,维持斗的临界比生长速率意味着每46h就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍,这在实际工业生产中是很难实现的。事实上,青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多,却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶,抵消了一部分生长,故虽然表观比生长速率低,但真比生长速率却要高一些。

（7）菌丝形态

在长期的菌株改良中,青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触,故一般比生产速率较高；后者则由于发酵液黏度显著降低,使气-液两相间氧的传递速率大大提高,从而允许更多的菌丝生长(即临界菌体浓度较高),发酵罐体积产率甚至高于前者。

在丝状菌发酵中,控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度,并避免结球,是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中,使菌丝球保持适当大小和松紧,并尽量减少游离菌丝的含量,也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。

3、工艺控制要点

（1）种子质量的控制

丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25°C培养7天,真空干燥并以这种形式保存备用。生产时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内,26°C培养56h左右,菌丝浓度达6%-8%,菌丝形态正常,按10%-15%的接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内,27°C培养24h,菌丝体积10%-12%,形态正常,效价在700D/ml左右便可作为发酵种子。

球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有O.5%-1.0%玉米浆的三角瓶培养原始亲米孢子,然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子(又称生产米),亲米和生产米均为25°C静置培养,需经常观察生长发育情况在培养到3-4天,大米表面长出明显小集落时要振摇均匀,使菌丝在大米表面能均匀生长,待10天左右形成绿色孢子即可收获。亲米成熟接人生产米后也要经过激烈振荡才可放置恒温培养,生产米的孢子量要求每粒米300万只以上。亲米、生产米子孢子都需保存在5°C冰箱内。

工艺要求将新鲜的生产米(指收获后的孢瓶在10天以内使用)接人含有花生饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主的种子罐内,28°C培养50-60h当pH值由6.0-6.5下降至.0,菌丝呈菊花团状,平均直径在100-130μm,每毫升的球数为6万-8万只,沉降率在85%以上,即可根据发酵罐球数控制在8000-11000只/ml范围的要求,计算移种体积,然后接入发酵罐,多余的种子液弃去。球状菌以新鲜孢子为佳,其生产水平优于真空干燥的孢子，能使青霉素发酵单位的罐批差异减少。

（2）培养基成分的控制

a.碳源

产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生产上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液(DE值50%以上)进行流加。

b.氮源

氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。c.前体

生物合成含有苄基基团的青霉素G,需在发酵液中加人前体。前体可用苯乙酸、苯乙酰胺,一次加入量不大于%,并采用多次加入,以防止前体对青霉素的毒害。无机盐加人的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等,且用量要适度。另外,由于铁离子对青霉菌有毒害作用,必须严格控制铁离子的浓度,一般控制在30μg/ml。（3）发酵培养的控制a.加糖控制

加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的pH值确定,最好是根据排气中CO2量及O2量来控制,一般在残糖降至%左右,pH值上升时开始加糖。

b.补氮及加前体

补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素,使发酵液氨氮控制在O.01%%,补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为%%。c.pH值控制

对pH值的要求视不同菌种而异,一般为pH可以补加葡萄糖来控制。目前一般采用加酸或加碱控制pH值。

d.温度控制

前期25-26°C,后期23°C,以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。

e.溶解氧的控制

一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的30%。通风比一般为1:0.8L/(L•min),搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。f.泡沫的控制

在发酵过程中产生大量泡沫,可以用天然油脂,如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂"泡敌"来消泡,应当控制其用量并要少量多次加入,尤其在发酵前期不宜多用,否则会影响菌体的呼吸代谢。

g.发酵液质量控制

生产上按规定时间从发酵罐中取样,用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称"镜检",根据"镜检"中菌丝形变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度,通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间,以获得最多青霉素。当菌丝中空泡扩大、增多及延伸,并出现个别自溶细胞,这表示菌丝趋向衰老,青霉素分泌逐渐停止,菌丝形态上即将进入自溶期,在此时期由于茵丝自溶,游离氨释放,pH值上升,导致青霉素产量下降,使色素、溶解和胶状杂质增多,并使发酵液变蒙古稠,增加下一步提纯时过滤的困难。因此,生产上根据"镜检"判断,在自溶期即将来临之际,迅速停止发酵,立刻放罐,将发酵液迅速送往提炼工段。生产青霉素需经以下步骤:配料、发酵、过滤、提取、结晶、干燥、包装。青霉素Benzylpenicillin中文别名：青霉素G、青霉素G钾、苄青霉素、苄西林英文别名：BenzylpenicillinPotassium、BenzylpenicillinSod.、CrystallinePenicillinG、Penicillin、PenicillinGPotassium、PenicillinGSod.生产企业：药品类别：青霉素类抗生素药理药动药效学青霉素对多数革兰阳性菌、革兰阴性球菌、个别阴性杆菌(如嗜血杆菌属)、螺旋体和放线菌有抗菌活性，为杀菌剂。青霉索、其他青霉素类和头孢菌素类等β-内酰胺抗生素系通过干扰细菌细胞壁的合成而产生抗菌作用。过去认为青霉素等抗生素主要作用于细胞壁合成的最后阶段--粘肽交叉联合，是一个简单化的概念。根据近年来研究结果提示青霉素结合蛋白(Penicillinbindingproteins，PBPs)是青霉素等β-内酰胺抗生素的作用靶位；由于青霉素等和PBPs的紧密结合，使前者对细菌细胞壁合成的早期阶段也发生抑制作用。PBPs为存在于细菌胞浆膜上的蛋白，其数目、分子大小和青霉素等抗生素的结合量因细菌菌种不同而异。以大肠杆菌为例，PBPs共有7个。PBPs具有催化粘-肽代谢酶的功能，如肽酶反应；也有证据提示PBPs是参与细胞壁生物合成的、对青霉素敏感的酶,如转肽酶、羧肽酶、内肽酶等。PBP-lB和-1A为使细菌延长的最重要蛋白，经青霉素等抗生素作用后可使细菌迅速溶解。PBP-2与控制细菌形态有关，受青霉素作用后,细菌可形成渗透压稳定的球形体。PBP-3对细菌细胞中隔形成和细菌分裂有重要作用，对PBP-3有高度亲合力的青霉素可使细菌形成丝状体。药动学

青霉素钾盐或钠盐肌注后，小时达血药峰浓度，肌注100万单位(600mg)的峰浓度为20u／ml(12μg/ml)，对多数敏感菌的有效血药浓度可维持5小时。新生儿按体重肌注青霉素万单位/kg后，～l小时的平均血药峰浓度约为35u/ml(22μg/ml)，12小时后即降至～ml。每2小时静脉注射本品200万单位或每3小时注射300万单位，可获得约32u/ml的平均血药浓度。于5分钟内静脉注射3g(500万单位)青霉素钠，给药后5分钟和10分钟的平均血药浓度为400和273μg/ml，1小时即降至45μg／ml，4小时仅有μg/ml。同样剂量的青霉素钠于6小时内作静脉滴注时，则2小时后才获得12～20μg/ml的血药浓度。本品吸收后广泛分布于组织、体液中。胸腹腔和关节腔液中浓度约为血清浓度的50％。本品不易透入眼、骨组织、无血供区域和脓肿腔中，易透入至有炎症的组织。青霉素可通过胎盘，除在妊娠前3月羊水中青霉素浓度较低外，一般在胎儿和羊水中皆可获得有效治疗浓度。本品难以透过血脑屏障，在无炎症脑脊液中的浓度仅为血药浓度的l～3％。在有炎症的脑脊液中浓度可达血药浓度的5～30％。在脑膜无炎症时，静脉注射青霉素可在脑组织中获得抑制敏感革兰阳性球菌的浓度。乳汁中可含有青霉素，其浓度为血药浓度的5～20％。青霉素可进入红细胞。如以青霉素作静脉注射，继以恒速静脉滴注，2小时后红细胞中青霉素含量则与血清浓度相等或超过后者。停止给药后，红细胞中青霉素浓度于50～60分钟才减少一半。血浆蛋白结合率为45～65％。T1/2约为30分钟，肾功能减退者可延长至～10小时，老年和新生儿也较长。新生儿的T1/2与体重、日龄有关，体重低于2kg者，7日内和8～14日新生儿的T1/2分别为和小时；体重高于2kg者，7日内和8～14日的T1/2则分别为和小时。本品约19％在肝内代谢。在肾功能正常情况下，约70％的注射量于6小时内自肾脏排出。青霉素主要通过肾小管排泄，在健康成年人经肾小球排泄者仅占10％左右；但在新生儿，青霉素则主要经肾小球排泄。肌肉注射青霉素300mg(50万单位)后，平均19％的给药量自尿中以青霉噻唑酸排出。经胆汁排泄的青霉素量不多，但胆汁中浓度不低，肌注600mg青霉素后2～4小时胆汁中浓度达峰值，为10～20μg／ml。由于青霉素在下消化道中被产青霉素酶的肠道菌所破坏，因此粪便中不含或含很少量青霉素。青霉素可在血液中为血液透析所清除，使血清半衰期缩短，但腹膜透析无此效果。

适应症

青霉素适用A组溶血性链球菌、B组溶血性链球菌、肺炎球菌、对青霉素G敏感金葡菌等革兰阳性球菌所致的各种感染，如败血症、肺炎、脑膜炎、扁桃体炎、中耳炎、猩红热、丹毒、产褥热等。也用于治疗草绿色链球菌和肠球菌感染性心内膜炎；梭状芽胞杆菌所致的破伤风、气性坏疽、炭疽、白喉、流行性脑脊髓膜炎、李司忒菌病、鼠咬热、梅毒、淋病、雅司、回归热、钩端螺旋体病、奋森咽峡炎、放线菌病等。在风湿性心脏病或先天性心脏病病人进行口腔手术或牙科操作，胃肠道和生殖泌尿道手术或某些操作时，为了预防心内膜炎的发生，青霉素也作为首选药物。

用法用量

1．成人常用量肌内注射，每日80万～200万单位，分3—4次给药；静脉滴注，每日200万一1000万单位，分2—4次给药。

2．小儿常用量肌内注射，每日按体重万～5万单位/kg，分3—4次给药。静脉给药每日按体重5万一20万单位/kg，分2—4次。

3，新生儿(足月产)剂量每次按体重5万单位/kg，肌注或静脉给药，前2日每12小时一次，自第3天至12周每8小时一次，以后每6小时一次。

4．早产儿剂量第1周按体重3万单位/kg，每12小时一次，2—4周时每8小时一次，以后每6小时一次。

5，肾功能减退病人剂量肾小球滤过率(GFR)为10—15ml/min时，给药间歇自8小时延长至8—12小时或剂量减少25％。当GFR少于10ml／min时，给药间歇为12—18小时或剂量减至正常剂量的25—60％。一般说来病人肾功能损害属轻中度者，使用常规剂量，不予以减量即可，肾功能损害严重者再调整剂量或延长给药时间。

6．鞘内注射成人剂量每次不超过2万单位。小儿尽量避免使用，单独应用静脉给药即可；如应用时，其剂量为2000—3000单位。

7．肌内注射50万单位的青霉素钠或钾，加灭菌注射用水1ml使溶解；超过50万单位者则需加灭菌注射用水2ml，不应以氯化钠注射液作溶剂。静脉给药的速度不能超过每分钟50万单位，以免发生中枢神经系统反应。鞘内注射时，1万单位的青霉素溶于10ml氯化钠注射液或脑脊液，徐缓注入。

[制剂与规格]注射用青霉素钠(1)(20万单位)(2)(40万单位)(3)(80万单位)(4)(100万单位)

注射用青霉素钾(1)(20万单位)(2)(40万单位)(3)(80万单位)(4)(100万单位)注：每1mg的青霉素钠相当于1670个青霉素单位；每1mg的青霉素钾相当于1598个青霉素单位。

肌注,成人一日80-320万单位,儿童一日3-5万单位/kg,分2-4次给药;重症(如感染心内膜炎,化脓性脑膜炎)适于静滴,成人一日240-2000万单位,儿童一日20-40万单位/kg,分4-6次加至少量输液中作间歇快速滴注.钾盐须注意体内血钾浓度和输液的钾含量,且滴速不可太快.

不良反应

(1)过敏反应：青霉素毒性虽低，但过敏反应常见，在各种药物中居首位。严重的过敏反应—过敏性休克(I型变态反应)的发生率为～％，其病死率可达10％。因此，此反应一旦发生，必须就地抢救，立即给病人肌注％肾上腺素～1ml，必要时以5％葡萄糖注射液或氯化钠注射液稀释作静脉注射，临床表现无改善者，半小时后重复一次。心跳停止者，肾上腺素可作心内注射。同时静脉滴注大剂量肾上腺皮质激素，并补充血容量；血压持久不升者给以多巴胺等血管活性药。抗组织胺药可考虑采用，以减轻荨麻疹。有呼吸困难者予以氧气吸入或人工呼吸，喉头水肿明显者，应及时作气管切开。青霉素酶应用意义不大，因此酶虽可破坏青霉素，但对已形成的抗原-抗体复合物无作用，而且其本身也可产生过敏反应。

血清病型反应(Ⅲ型变态反应)亦非少见，发生率为1—7％。其他过敏反应尚有溶血性贫血(Ⅱ型变态反应)、药疹、接触性皮炎、间质性肾炎、哮喘发作等。为了防止严重过敏反应的发生，用青霉素类前必须详细询问过去病史，包括用药史、是否用过青霉素、有无易为病人忽略的反应症状，如胸闷、瘙痒、面部发麻、发热等，以及有无个人或家属有变态反应性疾病等。青霉素皮试对预测过敏性休克起着重要作用，但皮试阴性者不能排除出现反应的可能。皮试液采用青霉噻唑-多赖氨酸、青霉素和苄青霉素噻唑酸钠，可能检出过敏反应大小决定簇抗原的抗体，准确度高，也比较安全，国内尚无生产。有青霉素过敏史者一般不宜进行皮试，而改用其他药物。如无适当选用药物，必须应用青霉素类时，则须慎重为病人脱敏。

(2)毒性反应：青霉素肌注区可发生周围神经炎。鞘内注射超过2万单位或静脉滴注大剂量青霉素可引起肌肉阵挛、抽搐、昏迷等反应(青霉素脑病)。此反应多见于婴儿、老年人和肾功能减退病人。青霉素偶可引起致精神病发作，应用普鲁卡因青霉素后个别病人可出现焦虑、发热、呼吸急促、高血压、心率快、幻觉、抽搐、昏迷等。此反应发生机理不明。

(3)青霉素钾100万单位含钾离子，如静脉给予大量青霉素钾时，则可发生高钾血症或钾中毒反应。青霉素钠100万单位含钠离予，大剂量给予后，尤其是在肾功能减退或心功能不全病人，可造成高钠血症。每日给予病人1亿单位青霉素钠后，少数病人出现低血钾症，代谢性碱中毒和高钠血症。(4)赫氏反应和治疗矛盾：用青霉素治疗梅毒或其他感染时可有症状加剧现象，称赫氏反应。治疗矛盾也见于梅毒病人，系由于治疗后梅毒病灶消炎过快，但组织修补过迟，或纤维组织收缩，妨碍器官功能所致。

(5)二重感染：青霉素治疗期间可出现耐青霉素金葡菌、革兰阴性杆菌或白念珠菌感染，念珠菌过度繁殖可使舌苔呈棕色甚至黑色。

可能引起过敏反应:皮疹,药热,面部潮红或苍白,气喘,心悸,胸闷,腹痛,过敏性休克.大剂量可出现神经精神症状,如幻觉,抽搐,昏睡,知觉障碍等.极大剂量可致惊厥,电解质紊乱,溶血性贫血,脉管炎.也可引起急性肾衰.老年患者可有中枢神经中毒反应.

禁忌症

(1)交叉过敏反应：病人对一种青霉素过敏者可能对其他青霉素过敏，也可能对青霉胺或头孢菌素过敏。

(2)青霉素类可经乳汁排出，乳母应用青霉素虽尚无发生严重问题的报告，但乳母应用仍须权衡利弊，因为乳母采用青霉素后可使婴儿致敏。

(3)下列情况应慎用；①病人有哮喘、湿疹、枯草热、荨麻疹等过敏性疾病史者；②肾功能严重损害时。老年患者可有中枢神经中毒反应.药物相互作用(1)氯霉素、红霉素、四环素类、磺胺药等抑菌剂可干扰青霉素的杀菌活性，不宜与青霉素类合用，尤其是在治疗脑膜炎或急需杀菌作用的严重感染时。(2)丙磺舒、阿司匹林、吲哚美辛、保泰松、磺胺药可减少青霉素类在肾小管的排泄，因而使青霉素类的血药浓度增高，而且维持较久，血清半衰期延长，毒性也可能增加。(3)青霉素钾或钠与重金属，特别是铜、锌和汞呈配伍禁忌，因后者可破坏青霉素的氧化噻唑环。由锌化合物制造的橡皮管或瓶塞也可影响青霉素活力。呈酸性的葡萄糖注射液或四环素注射液皆可破坏青霉素的活性。青霉素也可为氧化剂或还原剂或羟基化合物灭活。(4)青霉素静脉输液加入头孢噻吩、林可霉素、四环素、万古霉素、琥乙红霉素、两性霉素B、去甲肾上腺素、间羟胺、苯妥英钠、盐酸羟嗪、丙氯拉嗪(prochlorporazine)、异丙嗪、维生素B族、维生索C等后将出现混浊。(5)青霉素可加强华法林的作用。发酵工程-５

下游加工过程(2008-07-1510:28:23)转载标签：教育分类：生物从发酵液中分离、精制有关产品的过程称为发酵生产的下游加工过程。发酵液是含有细胞、代谢产物和剩余培养基等多组份的多相系统，粘度常很大，从中分离固体物质很困难；发酵产品在发酵液中浓度很低，且常常与代谢产物。营养物质等大量杂质共存于细胞内或细胞外，形成复杂的混合物；欲提取的产品通常很不稳定，遇热、极端ＰＨ。有机溶剂会分解或失活；另外，由于发酵是分批操作，生物变异性大，各批发酵液不尽相同，这就要求下游加工有一定弹性，特别是对染菌的批号也要能处理。发酵的最后产品纯度要求较高，上述种种原因使下游加工过程成为许多发酵生产中最重要。成本费用最高的环节，如抗生素、乙醇、柠檬酸等的分离和精制占整个工厂投资的６０％左右，而且还有继续增加的趋势。发酵生产中因缺乏合适的、经济的下游处理方法而不能投入生产的例子是很多的。因此下游加工技术愈来愈引起人们的重视。

下游加工过程由许多化工单元操作组成，一般可分为发酵液预处理和固液分离、提取、精制以及成品加工四个阶段。其一般流程如图所示。

４．５．１发酵液预处理和固液分离

发酵液的预处理和固液分离是下游加工的第一步操作。预处理的目的是改善发酵液性质，以利于固液分离，常用酸化、加热、加絮凝剂等方法。固液分离则常用到过滤、离心等方法。如果欲提取的产物存在于细胞内，还需先对细胞进行破碎。细胞破碎方法有机械、生物和化学法，大规模生产中常用高压匀浆器和球磨机。细胞碎片的分离通常用离心、两水相革取等方法。

（单、多袋过滤器）

（高速固液分离机）

４．５．２提取

经上述步骤处理后，活性物质存在于滤液中，滤液体积很大，浓度很低。接下来要进行提取，提取的目的主要是浓缩，也有一些纯化作用。常用的方法有：①吸附法：对于抗生素等小分子物质可用吸附法，现在常用的吸附剂为大网格聚合物，另外还可用活性炭、白土、氧化铝、树脂等。②离子交换法：极性化合物则可用离子交换法提取，该法亦可用于精制。③沉淀法：沉淀法广泛用于蛋白质提取中，主要起浓缩作用，常用盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀和非离子型聚合物沉淀等方法。沉淀法也用于一些小分子物质的提取。④革取法：革取法是提取过程中的一种重要方法，包括溶剂革取、两水相革取、超临界流体革取、逆胶束革取等方法，其中溶剂革取法仅用于抗生素等小分子生物物质而不能用于蛋白质的提取，而两水相革取法则仅适用于蛋白质的提取，小分子物质不适用。⑤超滤法：超滤法是利用一定截断分了量的超滤膜进行溶质的分离或浓缩，可用于小分子提取中去除大分子杂质和大分子提取中的脱盐浓缩等。４．５．３精制

经提取过程初步纯化后，滤液体积大大缩小，但纯度提高不多，需要进一步精制。初步纯化中的某些操作，如沉淀、超滤等也可应用于精制中。大分子（蛋白质）精制依赖于层析分离，层析分离是利用物质在固定相和移动相间分配情况不同，进而在层析柱中的运动速度不同，而达到分离的目的。根据分配机理的不同，分为凝胶层析、离子交换层析。聚焦层析。疏水层析、亲和层析等几种类型。色层分离中的主要困难之一是层析介质的机械强度差，研究生产优质层析介质是下游加工的重要任务之一。小分子物质的精制常利用结晶操作。４．５．４成品加工

经提取和精制后，一般根据产品应用要求，最后还需要浓缩、无菌过滤和去热原、干燥、加稳定剂等加工步骤。随着膜质量的改进和膜装置性能的改善，下游加工过程各个阶段，将会越来越多地使用膜技术。浓缩可采用升膜或降膜式的薄膜蒸发，对热敏性物质，可用离心薄膜蒸发，对大分子溶液的浓缩可用超滤膜，小分子溶液的浓缩可用反渗透膜。用截断分子量为１００００的超滤膜可除去分子量在１０００以内的产品中的热原，同时也达到了过滤除菌的目的。如果最后要求的是结晶性产品，则上述浓缩。无菌过滤等步骤应放于结晶之前，而于燥则通常是固体产品加工的最后一道工序。干燥方法根据物料性质、物料状况及当地具体条件而定，可选用真空干燥、红外线干燥、沸腾干燥、气流干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等方法。４．６固体发酵

某些微生物生长需水很少，可利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产，称为固体发酵。我国传统的酿酒、制酱及天培（大豆发酵食品）的生产等均为固体发酵。另外，固体发酵还用于磨菇的生产、奶酪、泡菜的制作以及动植物废料的堆肥等（表４－３）。

固体发酵所用原料一般为经济易得、富含营养物质的工农业中的副、废产品，如鼓皮、薯粉、大豆饼粉、高梁、玉米粉等。根据需要有的还对原料进行粉碎、蒸煮等预加工以促进营养物吸收，改善发酵生产条件，有的需加人尿素、硫酸铁及一些无机酸、碱等辅料。

固体发酵一般都是开放式，因而不是纯培养，无菌要求不高，它的一般过程为：将原料预加工后再经蒸煮灭菌，然后制成六一定水分的固体物料，接入预先培养好的菌种，进行发酵。发酵成熟后要适时出料，并进行适当处理，或进行产物的提取。根据培养基的厚薄可分为薄层和厚层发酵，用到的设备有帘于、曲盘和曲箱等。薄层固体发酵是利用木盘或苇帘，在卜面铺ｌ～２ｃｍ厚的物料，接种后在曲室内进行发酵；厚层固体发酵是利用深槽（或池），在其上部架设竹帘，帘上铺一尺多厚的物料，接种后在深槽下部给以通气进行发酵。

固体发酵所需设备简单，操作容易，并可因陋就简、因地制宜地利用一些来源丰富的工农业副产品，因此至今仍在某些产品的生产上不同程度地沿用着。但是这种方法又有许多缺点，如劳动强度大、不便于机械化操作、微生物品种少、生长慢、产品有限等。因此目前主要的发酵生产多为液体发酵。４．７１抗生素发酵生产

抗生素是生物体在生命活动中产生的一种次级代谢产物。这类有机物质能在低浓度下抑制或杀灭活细胞，这种作用又有很强的选择性，例如医用的抗生素仅对造成人类疾病的细菌或肿瘤细胞有很强的抑制或杀灭作用，而对人体正常细胞损害很小，这是抗生素为什么能用于医药的道理。目前人们在生物体内发现的６０００多种抗生素中，约６０％来自放线菌。抗生素主要用微生物发酵法生产，少数抗生素也可用化学方法合成，人们还对天然得到的抗生素进行生化或化学改造，使其具有更优越的性能，这样得到的抗生素叫半合成抗生素，其数目已达到两万多种。抗生素不仅广泛用于临床医疗，而且已经用于农业、畜牧及环保等领域中。

青霉素是最早发现并用于临床的一种抗生素。１９２８年为英国人发现，４０年代投人工业生产。在二战期间立刻大显身手，它能有效控制伤口的细菌感染，挽救了数百万战争中受伤者的性命。我们就以青霉素为例简单介绍抗生素的发酵牛产过程。４．７．１．１青霉素发酵生产菌株

最初由弗莱明分离的点青霉，只能产生２U/ml的青霉素。目前全世界用于生产青霉素的高产菌株，大都由菌株ＷisＱ176（一种产黄青霉）经不同改良途径得到；７０年代前育种采用诱变和随机筛选方法，后来由于原生质体融合技术、基因克隆技术等现代育种技术的应用，青霉素工业发酵生产水平已达85000U/ml以上。青霉素生产菌株一般在真空冷冻干燥状态下保存其分生抱子，也可以用甘油或乳糖溶剂作悬浮剂，在一７０℃冰箱或液氮中保存抱子悬浮液和营养菌丝体。４．７．１．２青霉素发酵生产培养基（1）碳源目前普遍采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液进行流加。（2）氮源可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或新质粉，并补加无机氮源。（3）前体苯乙酸或苯乙酷胺，由于它们对青霉菌有一定毒性，故一次加人量不能大于０．１％，并采用多次加人方式。（4）无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类，铁离子对青霉菌有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在３０Ｍ／ｎｄ以下。

４．７．１．３青霉素发酵工艺

发酵工艺流程：

（1）种子制备种子制备阶段以生产丰富的抱子（斜面和大米泡子培养）或大鳗健壮的南的体（种子罐）为目的。为达到这一目的，在培养基中加人比较丰富的容易代谢的碳源（如葡萄糖或蔗糖）、氮源（如玉米浆）、缓冲ＰＨ的碳酸钙以及生长所必需的无机盐，并保持最适生长温度（２５～２６℃）和充分通气、搅拌。在最适生长条件下，到达对数生长期时菌体量的倍增时间约为６～７小时。在工业生产中，种子制备的培养条件及原材料质量均应严格控制以保持种子质量的稳定性。（2）发酵培养影响青霉素发酵产率的因素有环境因素，如ＰＨ值、温度、溶氧饱合度、碳氮组份含量等；有生理变量因素，包括菌丝浓度。菌丝生长速度、菌丝形态等，对它们都要进行严格控制。发酵中ＰＨ值一般控制在６.４～６.６，发酵温度前期２５～２６℃，后期２３℃，以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。此外，还要求发酵液中溶氧量不低于饱和溶解氧的３０%，通气比一般为1:（单位培养液体积在单位时间内通人的空气量）。（3）以发酵后处理①过滤：采用鼓式真空过滤器，过滤前加去乳化剂并降温。②提炼：用溶媒革取法。将发酵滤液酸化至ＰＨ２，加ｌ／３体积的醋酸丁酯（简称BA），混合后以碟片式离心机分离，得一次BA提取液。然后以１.３%～１.９%的ＮａＨＣＯ在ＰＨ６.８～７.ｌ条件下将青霉素从BA中提取到缓冲液中。再调ＰＨ至２.０，将青霉素从缓冲液再次转人到ＢＡ中，方法同上，得二次ＢＡ提取液。③脱色：在二次ＢＡ提取液中加活性炭１５０～３００ｇ/10亿单位，脱色、过滤。④结晶：用丁醇共沸结晶法。将二次ＢＡ革取液以０.５ｍｏｌ／Ｉ。ＮａＯＨ液萃取，调ｐＨ至６.４～６.８，得青霉素钠盐水浓缩液。加３～４倍体积的丁醇，在１６～２６℃，５～１０mm汞柱下真空蒸馏，将水与丁醇共沸物蒸出，并随时补加了醇。当浓缩到原来水浓缩液体积，蒸出馏分中含水达２%～４%时，即停止蒸馏。青霉素钠盐结晶析出，过滤，将晶体洗涤后进行干燥得成品。可在６０℃，２０mm汞柱真空中烘１６ｈ，然后磨粉、装桶。

４．７．２氨基酸发酵生产

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是人体及动物的重要营养物质，氨基酸产品广泛应用于食品、饲料。医药、化学、农业等领域。以前氨基酸主要是用酸水解蛋白质来制得，现在氨基酸生产方法有发酵法、提取法、合成法、酶法等，其中最主要的是发酵法生产，用发酵法生产的氨基酸已有２０多种。

谷氨酸是一种重要的氨基酸。我们吃的味精是以谷氨酸为原料生成的谷氨酸单钠的俗称，谷氨酸还可以制成对皮肤无刺激性的洗涤剂--十二烷酚基谷氨酸钠肥皂、能保持皮肤湿润的润肤剂--焦谷氨酸钠、质量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革，以及人造纤维和涂料等。谷氨酸是目前氨基酸生产中产量最大的一种，同时，谷氨酸发酵生产工艺也是氨基酸发酵生产中最典型。最成熟的。我们就以谷氨酸的发酵生产为例简单介绍一下氨基酸的发酵生产。４．７．２．ｌ谷氨酸发酵生产的菌种

谷氨酸发酵生产菌种主要有棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属的细菌。除节杆菌外，其他三属中有许多菌种适用于糖质原料的谷氨酸发酵。这些细菌都是需氧微生物，都需要以生物素为生长因于。我国谷氨酸发酵生产所用菌种有北京棒状杆菌ＡＳ１２９９、钝齿棒状杆菌ＡＳ１５４２、ＨＵ７２５１及７３３８、Ｂ9等。这些菌株的斜面培养一般采用由蛋白陈、牛肉膏、氯化钠等组成，ｐＨ为７.０～７.２的琼脂培养基，３２℃培养２４ｈ，冰箱保存备用。４．７．２．２谷氨酸发酵生产的原料制备

谷氨酸发酵生产以淀粉水解糖为原料。淀粉水解糖的制备一般有酸水解法和酶水解法两种。国内常用的是淀粉酸水解工艺：干淀粉用水调成10°～11°波美的淀粉乳，用盐酸调至ＰＨ左右；然后直接用蒸汽加热，水解压力30×104Ｐａ，时间２５ｍｉｎ左右；冷却糖化液至８０℃，用NaOH调节ｐＨ至４.０～５.０使糖化液中的蛋白质和其他胶体物质沉淀析出；然后用粉末状活性炭脱色，活性炭用量约为淀粉量的０.６%一０.８%，７０℃、酸性环境下搅拌；最后在４５～６０℃下过滤得到淀粉水解液。４．７．２．３菌种扩大培养（ｌ）一级种子培养采用液体培养基，由葡萄糖。玉米浆。尿素、磷酸氢Ｍ钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰等组成，ｐＨ为～；三角瓶内３２℃振荡培养１２ｈ，贮于４℃冰箱备用。（２）Ｍ级种子培养培养基除用水解糖代替葡萄糖外，其他与一级种于培养基相仿。种于罐内３２℃通气