转基因动物(Transgenic-animals-)3PPT幻灯片

本次课所掌握内容基因病的分类基因在医学领域的用途反求生物学转基因动物及实施细则转基因动物的应用克隆动物的概念和技术过程评选为世界科技十大成果，中国科技十大成果。美、英、中、日科学家组成一个国际研究小组表示，完成对人体第22对染色体基因序列测定，破译出这对染色体的全部遗传密码—生老病死秘密将被揭开。人体共有23对染色体，2-2.5万个基因，31.647个亿碱基对。第22对染色体上约有6000多万个碱基对，23对染色体中最小的一对。染色体较短，基因种类丰富，最活跃致病染色体（基因密度在17、19、22号染色体上最高）。其基因变异与免疫反应、精神分裂、心脏病、弱智、白血病以及多种癌症相关。人体全部遗传密码图谱绘制完毕，大量关于人类生长、发育、衰老、遗传病变秘密随之揭开。今后100年—200年生命科学奠定基础。随着对人体致病基因展开全面搜索——了解各种基因功能及基因之间相互作用。人类疾病的基因型分类1、单基因病：占1/3，6000多种遗传病。2、多基因病：占2/3，心脑血管疾病、恶性肿瘤、糖尿病、超敏反应、风湿病、神经精神性疾病、吸烟嗜好（多巴胺受体基因DRD2含A1、A2、A3）。3、获得性疾病：病原微生物所致疾病（结核病、肝炎、Aids、性病、SARS等)。人体基因中目前发现800多个与疾病直接相关。

基因组研究：绘制第二代解剖图，基因组含全部遗传密码，此图在遗传信息这一层次描述人体生物学本质和特性。人与人之间在基因组上具有多态性（细微差异所致），导致人与人之间在生理特性上具有个体差异和种族差异。

基因疗法治心梗：台湾一研究所用一种抑制血管内皮增生基因，在猪身上成功防止了血管狭窄。

RAS—N17gene载到腺病毒上—腺病毒载体—心导管施行气球扩张术后—把腺病毒载体释放于血管中（使血管转染这个基因）—阻断血管壁细胞增生信息传递。高脂饲料喂猪—心梗模型—转染gene—观察两年—8头猪接受gene治疗后成功免于血管再度狭窄。对照组血管明显狭窄。

实验结束后，医院申请进行人体实验。探讨基因医疗用途改变现有医生看病模式：

巴德年：“未来医学应该是3P医学，即预见、预防、个人化”。患者拥有记载个人生理和病理奥秘基因组图，录制磁盘，看医生带上磁盘即可。医生根据磁盘上遗传信息，做出综合评估——将来信息化医疗将成为主流医学。诊断技术更新：目前临床是表型诊断，一旦确定，疾病已经发生。以后在基因水平上提供诊断依据，产生基因诊断也称DNA诊断技术。病因性基因异常，发病前即已存在，进行病前、产前、甚至早期胚胎诊断。疾病早防、早诊、早治均有重要价值。将来孩子出生后，拿到他基因组图，它能显露出孩子成年后能长多高？是否色盲？是否得糖尿病？

准确告诉孩子家长将来会得什么病？人类所有疾病与基因相关。防止肥胖，找到肥胖基因（靶基因），治疗对靶基因进行抑制或调控。治疗方法突破：发病率和死亡率高疾病目前尚无好治疗方法，国际上已有400多个基因治疗方案处于研究和临床试用阶段。流行病防治将有大改观：搞清病原微生物基因组序列（SARS）并针对其致病基因特点，针对病人设计药物和研制疫苗。基因保健品和化妆品得到广泛应用：基因工程对农作物进行改造，使出产的油、蛋白质和碳水化合物具有保健功能（防止动脉硬化，骨质疏松症）；病原体抗原基因转入粮食、蔬菜、水果中，食后即增加营养又相当于输入防病疫苗；根据细胞衰老基因原理，生产抗皮肤衰老基因化妆品。基因药物组学成为药物开发主战场：各种基因功能逐渐明了，针对性设计、筛选有效药物将成为药物开发的主流。美国一个肥胖基因转让费达2000万美圆，有潜在商用价值。一套基因组类似钓鱼池，谁钓的早，谁获利多。Pharmacogenomics(药物基因组学)：研究基因变异所致不同病人对药物不同反应，此基础上研制新药物或新用药方法----基因功能学与分子药理学结合。药物基因组学区别与一般意义上基因学，不是以发现人体基因为主要目的，而是相对简单用已知基因理论改善病人治疗。药物基因组学以药物效应及安全性为目标，研究各种基因突变与药效、安全性关系——研究基因序列变异及其对药物反应的科学，研制高效、特效药物重要途径。为患者或特定人群寻找合适药物，强调个体性，因人执宜。有重要理论意义及广阔应用前景。新药开发中应用：药物基因组学根据不同药物效应，对基因分类，加速基因发现。大制药公司和实验室看到潜在商机，纷纷投资。寻找遗传变异开发抗癌新药，新药只对肿瘤细胞起作用，对正常细胞无毒性。新药设计、发现及成功应用中，认识到基因变异对药物效应及生物效应影响非常重要。

临床前药理和临床实验中应用：临床前遗传变异影响newchemicalentities(新化学实体)作用，美国FDA规定，新化学实体临床前研究包括遗传效应对药物代谢影响。对药物有效或毒性变异预测实验用于新药临床实验中，筛选病人。药物效应基因突变筛选受试者，加强临床试验统计学意义（少量例数达到统计学的意义）。合理用药中应用：合理用药核心是个体化给药，目前主要测定药物体液浓度，药物动力学原理计算参数。对于血药浓度与药效相一致的药物可行，对血药浓度与药效不一致药物，不能达到合理个体化给药。两个病人诊断相同，同一药物治疗，血药浓度相同，疗效不同，传统药物动力学、药效学原理无法解释。要考虑到药物作用相关位点（受体）是否发生变异？药物作用位点变异可能发生在基因水平，也可能发生在翻译，转录水平，基因水平变异相对比较容易鉴定（研究表明，基因变异与药物效应差异更具相关性），药物基因组学在临床合理用药中应用前景广阔，以前无法解释的药效学现象找到了答案。解密青霉菌基因组：西班牙莱昂大学解密青霉菌完整基因组——有助于研制无抗药性新型抗生素。新基因组包括1.3万个基因，每个基因都有上千个特性，创造新作用；少投入获得更多药品；对青霉素分子进行调整，引入化学成分得到青霉素衍生物，研制出不被抗药性破坏、更为活跃的抗生素。利用药物基因组学原理为特定人群设计最有效药物，提高疗效，缩短病程。将来就医，去医院或在互联网上就诊，基因身份证插入电脑，同时输入疾病和检查相关信息，电脑就会提示选择什么药物，何种剂型？多大剂量？注意事项。药物基因组学对药物经济学意义：原发性高血压涉及相关基因达70个，不同基因导致药物疗效对高血压患者有很大差别。治疗高血压药物有六大类，相同药物在某些人身上容易降解失效，疗效差，副作用少；另一些人群中疗效较好，不良反应较多。对不同人群药物选择应根据基因差别来决定。药物基因组学产品提供竞争优点：增加首选处方有效性；减少病人就诊次数；减少无效处方可能性；避免毒副反应。1998年与2005年药物基因组学市场（百万美圆）适应症1998年2005年心血管病8.2139.1传染病7.3123.3中枢神经系统4.372.3癌症2.441.3其他24.8419.0反求遗传学随着基因工程学发展，产生了一个新概念和工作范围，reversegenetics（反求遗传学）。传统遗传学研究从表现型到基因型表现型====基因型

自然界，偶发突变或诱发一些随机突变（白猴），表现型杂交分析，间接推测基因型；现通过外源性基因或经过改造内源性基因导入基因组，随之观察个体及后代表现型，研究某一基因增加或改变，对个体生长发育影响，从基因型到表现型。应用领域：生物高新技术，该技术所取得成果展示转基因动物技术在分子生物学、分子遗传学、分子免疫学、分子药理学、肿瘤工程学、医学及畜牧学等领域有无限广阔应用前景。实施细则：研究癌基因的作用及癌细胞发生、发展及抑制机理；免疫系统中细胞及因子相互作用；发育中基因表达、调控等提供了大量资料。集实验动物活体内整体水平、细胞水平和分子水平为一体，更能体现生命整体研究效果。基本概念及技术过程GENE（遗传因子、遗传单位）：控制生物性状、遗传物质结构和功能单位。细胞分裂时能自行复制、每一基因各位于特定染色体特定位置，由DNA合成。为目的基因提供背景动物称partnerstrain（配系），提供目的基因品系称donerstrain（供系）。配系最好是近交系，供系是带有目的基因任何一种基因类型动物。随目的基因一起导入到近交系中基因组中，随之带入基因:passengergene，实际工作中，随时可能存在乘客基因。

转基因动物：用物理、化学、生物手段将确定外源基因通过生殖细胞或早期胚胎导入动物染色体，其基因组内稳定整合导入外源基因，能遗传给后代的一类动物,使其获得人类需要新功能。利用genemanipulation（重组DNA技术）：体外对生物大分子DNA剪切、加工，把不同亲本DNA分子重新组合，并把它引入到染色体上，表达出具新遗传特性生物，打破生物种的界限。技术程序：（1）分离编码某一目的产物基因（HPLApoA）或分离对动物表型有作用某一基因（OB基因）。（2）制备DNA重组子（subset），使其能在选定组织中表达，从而饶过正常存在于动物机体代谢过程。（3）将DNA重组子在体外转移到一个刚刚受精单细胞卵中。（4）导入法：显微注射法；逆转录病毒感染法；精子载入法；胚胎干细胞介导法；电转移法。不同方法，使动物基因组中包括一个外源性DNA片段，此特征一般遗传方法不能达到。

Smartmicetosmarterhumans

Brainymice,pointingthewayforresearchthatcouldleadtohumanbabieswithhigherIQSaswellasdrugtotreadAlzheimersdiseaseandstroke.usingatinyglassneedle,thescientistsinjectedagenecarryingablueprintfortheproteininNR2Bintothenucleusofafertilizedmouseegg,thenimplantedtheresultingembryointotheuterusofamothermouse.ProductionofNR2Bproteinnormallydecreaseswithagenecorrelatingwiththelossofmemoryandlearningabilitycommonlyexperiencedbyoldpeople.制备转基因小鼠的技术程序

供体母鼠超数排卵合笼配种取受精卵基因注射受体母鼠假孕母鼠与结扎公鼠合笼分娩产崽采样、提取DNA转基因小鼠表达的转基因小鼠PMSGHCG见栓鼠脱颈处死消化SouthernPCRWesternELISA移入输卵管转基因动物出现死亡现象分析：显微注射本身对胚胎染色体损伤以及整个发育过程发生染色体伤害；外源基因插入引起致死性突变；某些情况下，胚胎发育期间转基因表达也可能是有害作用。基因整合存在三种形式；有效整合，无效整合，毒性整合。转基因在临床和基础学科方面的应用

器官移植中应用：1905年，法国princeteau进行世界上第一例临床异种移植手术，将兔肾植入肾衰儿童体内，16d死于肺感染。1954年，诺贝尔奖获得者廖里移植肾脏成功。1967年，南非伯纳德开心脏成功移植之先河。全世界至今接受心、肝、肾移植者不下30万例。在临床，同种异体器官移植中，随着外科手术成功，免疫抑制剂不断发展，移植成功率提高而出现供体短缺现象，异种移植将成为解决器官短缺一个途径。我国有2000万盲人渴望重见光明，每年只有400人有幸能做角膜移植，比例是5000:1。中国透析与移植研究会会长唐孝达教授透露，全国约有100万～150万人需要通过器官移植来根治疾病，每年仅能实施手术1.3万例，相当于大约100位患者中只有1位能得到及时救治。肾脏移植：1年我国肾脏移植5500多例，居亚洲之首，满足不了患者需求，每年新增尿毒症患者达12万人。得不到器官供体，绝大多数患者得不到救治，许多患者在痛苦无助等待中，走到了生命尽头。具统计，60余万人通过他人捐献的器官获得新生。美国每年大约有66000余人通过他人捐献的器官获得新生；新病人不断加入到等待器官行列中；1/2患者有机会接受移植，1/5患者在等待中死亡。

移植动物器官特点：动物器官取之不尽；动物器官比人造器官更具自然和生物性；动物器官随要随取。人类器官在捐献者死亡（非脑死亡）可做移植的最长有效时间：心脏4小时，肝脏24小时，肾脏48小时，角膜几个星期。1992年，California一位学者将猴肝脏植入一名女孩，手术很成功，几周后因免疫排斥反应而死。猪是人类最适合异种器官供体？几千年来，与人朝夕相处食肉动物，被众多科学家称为最佳供体。其优点：器官大小与人相仿；易于繁殖，成熟周期短，一胎多崽；作为食肉动物，在伦理学方面更易被人接受。猪与人共同生活达数千年，很少源自猪疾病发生在人身上。猪和人的脏器重量比脾脏0.15：0.21胰脏0.12：0.10睾丸0.65：0.45眼0.27：0.43甲状腺0.618：0.029肾上腺0.006：0.29其他器官8.3：9.4

人与三月龄小猪皮肤结构厚度比较（mm）皮肤结构人小猪皮肤2.0（0.5-3.0）1.3-1.5表皮0.07-0.170.06-0.17真皮1.7-2.00.93-1.7表皮和真皮厚度比1：241：24异种移植因超急性排斥反应（HAR）而阻碍其发展——补体激活及天然抗体（NA）存在是引起HAR两大因素。目前技术，猪器官无法永久移植到人体内，代替人脏器工作一定小时，利用这段时间寻找脏器捐献者。1995年起，英国学者导入免疫抑制基因CD59（膜反应抑制物），DAF（衰变加速因子）等来抑制异种供体器官植入受体触发的一系列免疫应答及炎症反应（存活1小时心脏延长至40d）。补体激活由一系列补体激活调节物质（RCA）调控。若将猪内皮细胞表达人RCA，把激活T细胞关闭，保护其供体器官免于补体激活引起内皮细胞溶解、破坏，提高移植物存活率。

对供体器官进行基因修饰后导入受体补体抑制蛋白特异性基因插入供者内皮细胞----产生供受体“嵌合体”，对供体产生特异性免疫耐受。转基因之后，动物血管壁上附有一种蛋白质，可阻止人类补体造成伤害，能蒙骗人免疫器官不被识别和排斥----使器官移植不依赖于免疫抑制剂或骨髓移植，放射法诱导免疫耐受之苦。美国明尼苏达州克里斯托夫为首研究小组创下在狒狒体内移植猪心脏后100d狒狒仍存活记录＞为人类两年后移植猪心脏奠定基础。台湾大学医院朱树勋报告中说：“中国传统谚语—狼心狗肺很可能在21世纪因异种器官移植而成为事实”。未来80岁老人，他（她）的心脏可能是20岁，肝脏30岁，角膜40岁。未来年龄定义也会相当模糊。

肿瘤学研究中的应用美研究人员确认肿瘤生长和扩散所需两种基因（Id1、Id2）----存于负责为肿瘤输送营养的血管内。小鼠两种基因去除，置于三种不同肿瘤环境中----显现出阻止肿瘤生长抵抗力。根据试验结果研制出使2种基因失去活力药物。注：两种基因对胚胎发育很重要，对成人影响甚微。近10多年肿瘤学研究最大突破是发现了癌基因，迄今已发现100多个。研究证实，各种脊椎动物都带有癌基因，常情况下并不引起癌变，某些情况下，才能被激活致使癌基因发生扩增。癌基因（存于动物细胞内）----某些条件作用下----抑制基因减少、细胞周期调节基因表达紊乱、癌基因扩增、癌基因-CH3丢失----细胞癌变。建立携带有肿瘤基因的转基因动物是癌基因活性和肿瘤发生研究一种极为重要方法。乳腺癌转基因小鼠研究表明：（1）肿瘤生长与正常细胞同样受内源激素组织内多肽生长因子调控，异常增生是癌基因和肿瘤抑制基因遗传改变，导致更多恶性细胞克隆增长。（2）转基因动物研究支持了肿瘤发生至少需要两次转化肿瘤多步发生假说（转入癌基因在动物各个器官都能表达，仅有少数几个器官会发生癌变）。（3）利用转基因技术可制备某些高频率发生肿瘤转基因动物加深对肿瘤发生了解，分析某一组织前癌状态，分析研究肿瘤发生、发展过程。同济医大普查肝癌N-ras，C-myc癌基因异常早期表达---对肝癌形成起到启动作用。（4）利用处于前癌状态转基因动物，为肿瘤多步发生中“第二步打击因子”实验提供强有力手段。（5）将不同癌基因再导入前癌状态动物，证实它们对肿瘤发生、发展不同影响，为抗癌治疗建立更多可靠动物模型。探讨外来癌与动物原癌基因表达与癌转化及动物遗传背景与外界激活因素关系。转基因动物在肿瘤病因学、发病学和治疗学应用研究中具有十分重要意义。

免疫学研究中应用Brinster将一种功能性重排小鼠免疫球蛋白K基因注入小鼠受精卵，建立了转基因小鼠，研究结果显示：重排IgG基因包含了所有组织特异性表达所需信息，不管导入功能性重排IgG基因整合于小鼠染色体什么位点，连续传代中都能获得稳定和正常表达（结论：导入功能性K轻链基因控制内源性轻链基因重排能力与转基因高水平表达）；Babinet发现，转基因小鼠产生HBsAg，6个月内没有任何病理变化，表现为一种持续带毒状态。结果验证一种假设：乙肝病人肝细胞损伤不是由HBsAg表达直接引起，肝细胞膜上病毒抗原发生免疫反应所致；用转基因小鼠模型来研究免疫耐受与肝细胞损伤关系以探讨发病机理；转基因小鼠为研究第I和第II型MHC功能提供了新手段。MHC表达产物主要负责细胞间相互识别及抗原提呈，肿瘤免疫中，主要以I类分之为主,II类与自身免疫病高度相关。

遗传性疾病研究中应用数字表明，91%人最终死于与遗传因素有关疾病。基因治疗（分子外科）为治疗遗传性疾病开辟了有效途径。将正常外援基因导入生物体靶细胞内以弥补其缺失基因，关闭或降低异常表达基因，达到治疗遗传病目的。目的基因+反转录病毒（载体）----重组、包装----病毒颗粒（competence）----转染----受体细胞------genetransfer。MT-rGHDNA转移到一种“侏儒症”小鼠生殖系，构建融合基因，转基因个体比侏儒症小鼠长大了三倍。说明动物生殖缺陷可通过转基因加以矫正。重组反转录病毒将所携带功能目的基因整合到受体细胞的染色体上，目的基因表达产物将弥补原来缺失基因产物，达到治疗遗传病目的。Quaking（颤抖）型小鼠，一种髓性基质蛋白（MBP）基因隐性突变所致。正常小鼠的MBP基因导入Quaking小鼠受精卵，得到转基因颤抖小鼠不再颤抖。生殖系基因治疗研究对动物完全可行，对于人类基因治疗有重要借鉴意义。病毒性疾病研究中应用SARS研究；禽流感研究；AIDS；H1N1研究都以转基因动物为模型。（1）病毒有其固有宿主范围。把病毒DNA导入胚胎，整合表达，打破病毒固有宿主范围，产生与正常宿主同样病理变化，更大范围内建立病毒致病模型及对其进行更广泛深入研究。（2）将人脊髓灰质炎病毒感染宿主受体基因导入小鼠，获得对该病毒易感转基因小鼠，替代猴子检测口服疫苗能力。（3）乙肝病毒X基因（与肝癌相关），S基因，C基因（变异与病毒活动密切相关）等特定基因导入小鼠基因组，研究特定基因表达产物对乙肝致病机理。有人接种乙肝疫苗没产生抗体？HBV-S变异，使HBsAg阴性，已感染乙肝病毒。（4）将病毒全基因组DNA导入小鼠基因组，转基因小鼠不仅具有表达病毒蛋白能力，能进行病毒DNA复制。

改良和培育动物新品种方面应用物种选择方法培育动植物新品种，经典育种方法在两个方面受到限制。遗传信息只能在同种或亲缘关系很近种间才可能变换重组；其次选择先决条件是变异或突变，天然突变频率极低。重组DNA技术使亲缘关系十分遥远种间遗传信息进行交换和重组（Transposons），在很短时间内产生服从于人意志的突变。（1）体外重组代表优良性状基因导入动物受精卵，培育优良性状动物新品种。改良目的：增加动物新遗传品质（高生长率、瘦肉率、食物利用率、抗病率，增加皮、毛和乳品的产量及质量），培育出很多动物新品种。英国罗斯林研究所培育转基因鸡蛋具抗癌和治疗其他疾病作用。预防动物免遭传染病危害，传统办法免疫接种，效果不很理想。（2）胞内免疫法培育抗病转基因动物：宿主体内表达某种病毒突变型基因有效干扰野生株病毒复制。培育出抗鸡白血病组织增生病毒转基因鸡新品种。（3）转基因动物体内表达受干扰素诱导细胞M×1蛋白（来自粘病毒抗性基因），培育出一种对流感病毒有高度抗体转基因小鼠。AUSTRALIA将羊毛成分蛋白质a-白蛋白主要成分半胱氨酸基因导入山羊，繁育出转基因山羊，使羊毛增长5%，全国羊毛收入增加3亿美圆。（4）烟草商参加了最先进医学研究烟草地里种经转基因技术处理的烟草。收获不是烟草原料，是有效的抗生素及抗疟疾疫苗蛋白，无病原体传染危险，植物病毒不易传染给人。

生物活性物质研究中的应用生物医学重要价值生物活性蛋白质基因导入家畜或家禽受精卵，发育成动物体液、血液、乳汁、腹水和尿液中收获基因产物——Animalbioreactors。活发酵罐，除温度、PH和氧气通过生物基本单位——细胞来表达外源基因产物，发展为新型制药工业基地（MolecularfarmingorGenefarming）。每年可以从哺乳动物中获取10余种药物。日本将菠菜FAD12基因植入猪受精卵，转基因猪不饱和脂肪酸含量高出普通猪20%。

转基因动物应用将理想的遗传物质导入动物染色体，扩大种间遗传变异，回避有性繁殖所固有局限性，使基因能在种间关系遥远机体间流动。

有效回避不利基因，有效性状转移到高产性能种系中。转基因，设计并生产出特定实验动物模型，研究外源基因在整体动物中表达调控规律，对人类疾病病因、发病机理和治疗学起到极大促进作用。转基因鼠恼切片证实：脑皮质海马部位形成大量老年斑样结构，形态与老年痴呆症结构相似。2000年，转基因动物市场已超过12亿美圆。

科学家改写生命之书全球著名人类基因定序及解码基因研究机构剑桥维康基金会及加拿大多伦多病童医院在《nature》报告:以前认为人类基因组99.9%相同;研究发现:人类基因只有99.5%相同,每个人基因差异比先前估计的大10倍。解释：为什麽一些人比其他人更易患上某种严重疾病？新图谱将有助于科学家分辨基因变化，从新角度研究基因与其他疾病关联性，对医疗诊断、新药开发以及对人类进化认识有深远影响。目前对老年痴呆症、肾病和艾滋病研究极有帮助。

糖尿病全基因组关联分析和药物基因组学研究

研究目标中国汉族人群2型糖尿病的全基因组关联分析，寻找各种与2型糖尿病患病风险以及相关性状所关联的遗传因子，阐明中国汉族人群的2型糖尿病遗传基础；对中国人群2型糖尿病药物基因组相关多态性基因与药物有效性和安全性之间的关系进行研究，为我国2型糖尿病的合理用药提供科学依据。主要研究内容建立5000份以上中国汉族人群糖尿病患者以及2500-5000份专属正常对照的血液、DNA样本库；对2000-3000个2型糖尿病病例进行全基因组关联分析，找出致病位点；对2000-3000例服用降糖药物的病人进行药物治疗有效、无效和发生药物毒副反应人群分类；利用本项目已建立的药物基因组学研究平台技术，对其中1500-2000例2型糖尿病样本进行药物基因组相关基因多态性检测，研究中国汉族人群2型糖尿病患者中药物基因组相关基因多态性与药物的安全性和有效性之间的关系，绘制中国汉族人群糖尿病药物基因组HapMap图谱；结合基因检测结果，对其中200-500例病人进行糖尿病药物代谢研究，确定基因型-糖尿病药物疗效/毒性-药物代谢间的关联性；建立我国汉族人群糖尿病全基因组关联分析和药物基因组学数据库。

克隆动物

CLONE：同一个祖先细胞分裂繁殖而形成纯细胞系，细胞系中每个细胞基因彼此相通，又称无性繁殖细胞系。（无性繁殖现象在低等植物中存在，以一分为二的方式繁殖，高等生物的繁衍后代需两性生殖细胞完成）。利用动物体细胞、而非生殖细胞（精子和卵子）培育出另一个成体繁殖方法也是克隆。DOLLY的主要贡献学者其成功66%的成绩归功于坎贝尔博士：冷冻细胞用于克隆的构想由其提出。最终导致克隆羊诞生的实验由比尔.里奇进行。印裔分子生物学家普里姆.辛格提出“克隆”设想。维尔莫特是课题监督人。克隆迄今为止经历三个阶段：

第一阶段是微生物克隆——由一个细菌复制出成千上万个和它一样的细菌；第二阶段是生物技术克隆，DNA克隆，由一个DNA变出无数个DNA群体。DNA很小，单一研究很困难，把DNA注入细菌中去，随着细菌克隆而生产出成千上万个DNA；第三个阶段是动物克隆，由一个细胞变成一个单个个体，在科学上属于重大飞跃的成果。如果体细胞来自雄性动物，后代也是雄性。

1996年7月英国爱丁堡罗斯林研究所WILMUT研究小组宣布：成功克隆出“DOLLY”。步骤如下：1、用药物促使母羊排卵，然后将未受精卵取出放置一个离心管底部，用特殊微注射管将羊卵膜刺破，吸出卵中所有染色体，得到了具活性但无遗传物质卵空壳；2、从一只6岁母羊乳腺中取出一个普通细胞，使乳腺细胞与卵空壳融合，电流刺激使两者融合成一个含有新遗传物质卵细胞。卵细胞在试管中开始分裂，形成胚胎。当胚胎长到一定程度时；3、将其植入另一只母羊子宫中，使母羊人工怀孕产下小羊。Wilmut非常喜欢英国的一个著名乡村歌手，歌手名为Dolly（多莉），小羊取名Dolly。Dolly有三个母亲：为它提供乳腺细胞；提供卵空壳；为它怀胎。从遗传角度来看，提供乳腺细胞的母羊才有亲缘关系。

关于克隆人：在伦理方面是不人道。克隆人可能出现畸形、早衰、基因突变等最担心问题。重要问题是细胞程序重编。一个精子和一个卵子在形成过程中需花很多时间编程序，而克隆技术重编程序仅需几分钟。克隆人46条染色体都来自一个亲体，自然生殖婴儿染色体来自父母两个亲体。试管婴儿（辅助生殖技术）需要一定生殖、生理条件。一对夫妇不能正常产生精子或卵子，将无法用这些技术，克隆技术将成为新选择。50岁以上体细胞克隆人，一诞生细胞就已老化，成为穿着婴儿服老人。首位试管婴儿在英国出世，掀起轩然大波，全世界已有30万试管婴儿。杭州国际克隆人会议提出；：技术不成熟不能成为反对克隆人的理由。谁也拒绝不了治疗性克隆诱惑：干细胞在生命生长发育过程中是起骨干作用的原始细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能。尤其人类胚胎干细胞，可分化成200多种细胞类型，构建人心脏、肝脏等组织器官，最后发育成完整个体。全能干细胞有可能对人类病变、衰老组织进行修补或替代。人类胚胎干细胞来源也牵涉到伦理问题：人工流产极早胚胎或试管婴儿术后剩余胚胎，是不是生命？应不应该受到尊重？有学者称，一个14天胚胎谈不上让我们尊重。解除千万个癌症、帕金森氏症和需要器官患者病痛，才是对生命尊重。专家认为，人体胚胎克隆研究需非常慎重，英国允许生殖性克隆，将人和动物细胞结合起来进行克隆实验。关于克隆濒危动物：大熊猫是我国特有珍贵动物，被誉为国宝。其数量目前已减少到不足1000只，是国际组织列为20种濒危物种其一。异种克隆----取出大熊猫体细胞放在实验室内培养，作为供体细胞；从家兔体内取出未受精卵细胞，取掉细胞核，剩下细胞质；大熊猫供体细胞移植进家兔去核卵细胞----电刺激，使两者融合成新细胞----培育成幼胚-----植入经过选择大熊猫子宫中着床。遗传物质主要是细胞核中DNA决定，出世必将是标准大熊猫。

上海第二医科大学和上海市转基因研究中心共同主持“治疗性克隆”研究项目，把病人体细胞移到去核卵母细胞并经一系列处理发育至囊胚取得成功。课题列为国家级重点基础研究项目。其整体目标，用病人体细胞移植到去核卵母细胞内，经过一定处理使其发育到囊胚，再利用囊胚建立胚胎干细胞，在体外进行诱导分化成特定组织或器官，如皮肤、软骨、心脏、肝脏、肾脏、膀胱等，再将这些组织或器官移植到病人身上。利用这种方法，将从根本上解决同种异体器官移植过程中最难免疫排斥反应，解决组织和器官良好、充分的来源。最终目标是克隆出人体全身所有200多种组织和器官，饶过了精卵结合生命初始阶段。黄禹锡与《SCIENCE》：他们从女性体内取卵细胞，将细胞核去除，将本人卵丘细胞（围绕卵细胞周围的颗粒细胞）核注入去核卵内，让它们在体外发育成100个细胞胚泡期。从这些胚泡中取得细胞（内细胞团细胞），建立胚胎干细胞系。这种细胞系经特殊处理后，可演变为各类细胞，从而治疗疾病。

设想有两个创新点：

一、从个体本人体细胞（除生殖细胞之外细胞）——取得核——注入其本人去核卵内。与“多莉”不同，后者是从一只羊身上取得体细胞，将其核注入另一只羊去核卵细胞内。

二、像黄禹锡所说：注入体细胞核后去核卵细胞继续在试管内发育——直至胚泡期，增殖细胞近100个，是创新点。通常体外培养的卵细胞在生长至7-8个细胞时就会死亡，无法再继续生长。大多数只停留在动物实验阶段。黄禹锡根本不可能进行体细胞核移植。只在卵细胞和精子结合而成受精卵增殖至胚泡期时，将胚泡囊胚内细胞团去取出，建立干细胞系。阿富汗猎犬“Snuppy”确为第一只克隆狗。定制人造染色体，可望治疗血友病

在细胞里添加一整条定制人造染色体，可望成为用基因技术治疗遗传疾病一种新做法。基因是染色体上片段，遗传疾病由基因缺陷引起，完好无损基因取代有缺陷基因，治疗疾病。以前基因疗法的普遍做法以无害病毒为载体，将所需基因运送到患者细胞染色体需要修补地方。病毒“载重”太小，只能运送一两个小基因，而许多疾病需要修补多个基因才能治好。要让病毒在准确地点“卸货”也不容易，有时病毒携带基因会落到染色体错误地方，导致癌症。《newscientists》报道，加拿大科学家以正常小鼠染色体关键基因为基础，制造出人造染色体。它能像正常染色体那样分裂和遗传，所携带特定基因能发挥作用。向一部分细胞人造染色体里添加一个基因，该基因可产生