实验动物胚胎工程技术市公开课一等奖省赛课获奖课件

1第十二章试验动物胚胎工程技术实验动物胚胎工程技术第1页2第一节概述工程:经过构想、设计，按照人们意愿制作、改造某一事物，以到达预想目标。

生物工程：

按照工程学原理，对生物体或生物大分子进行改造或利用，用于生产、研究、检定和创造新物种综合性科学技术。遗传（基因）工程蛋白质工程酶工程细胞工程微生物工程胚胎工程组织工程

分子水平细胞水平组织水平实验动物胚胎工程技术第2页3胚胎工程（Embryonicengineering）又称胚胎技术,是指用工程学原理对动物胚胎进行某种技术操作或改造，使之取得人们所需要动物一系列生物技术总称,包含以下四大技术体系：一、胚胎操作基本技术

1.超数排卵和卵母细胞、精子、受精卵采集

2.体外受精

3.胚胎性别控制

4.胚胎分割

5.胚胎培养

6.胚胎移植

7.胚胎冷冻保留二、体细胞克隆技术三、干细胞技术四、外源基因导入技术实验动物胚胎工程技术第3页41．在畜牧业方面：经过建立超数排卵、受精卵/卵母细胞采集、体外受精、胚胎切割、胚胎性别控制、体细胞克隆以及胚胎移植技术，加紧良种家畜繁殖和家畜品种改良。

胚胎工程应用实验动物胚胎工程技术第4页5已在乳腺表示生物活性蛋白并进入临床2期或3期试验：抗凝血酶一Ⅲ抗胰蛋白酶蛋白C乳铁蛋白乳糖酶2．在生物制药方面：经过转基因技术将含有药用价值生物活性蛋白基因整合到宿主染色体上，使其在乳汁、血液、尿液等体液中表示。经过搜集、纯化这些体液中生物活性蛋白，用于预防和治疗一些人类疾病。实验动物胚胎工程技术第5页63．在医学方面：经过建立卵母细胞采集、体外受精、显微受精以及胚胎移植技术，用于不孕症治疗；经过对胚胎培养和检测，剔除含有遗传性疾病胚胎，到达优生优育目标。

4．在生命科学研究方面：说明哺乳动物早期胚胎发生、发育机制等基础理论

5．在拯救濒危野生动物方面：经过野生动物生殖细胞和组织冷冻保留、体细胞克隆和胚胎移植技术，扩大野生动物种群。实验动物胚胎工程技术第6页7第二节胚胎操作基本技术实验动物胚胎工程技术第7页8胚胎操作整个过程局限在胚胎早期发育实验动物胚胎工程技术第8页9解剖取附睾尾部精子获取和培养1.精子采集

啮齿类小动物精子采集大都从体成熟雄性动物附睾获取。将动物处死后，分离附睾尾部，用眼科剪子在顶端剪一小口，用手指轻柔挤出浓稠液滴，置培养液中培养。大动物精液采集可采取假阴道或电刺激方法促进雄性射精，搜集精液。一、精子、卵母细胞、受精卵采集和超数排卵实验动物胚胎工程技术第9页102.卵母细胞和受精卵采集

在哺乳动物中取得卵母细胞路径有两条：从体内成熟并排到输卵管中去，需经过处死动物或外科手术获取；假如在交配后，则可获取受精卵或早期胚胎。取自屠宰淘汰或刚死亡雌性动物卵巢，从卵巢中分离卵母细胞经培养而得。小鼠解剖取输卵管从输卵管壶腹部取卵母细胞/受精卵方法实验动物胚胎工程技术第10页11

3.超数排卵（Superovolation）技术：经过注射激素刺激卵巢大量排卵。经超数排卵处理，动物卵巢大量卵泡同时成熟并排出，排卵数可增加几倍至十几倍，一次可取得大量卵细胞、受精卵或早期胚胎。所用激素有促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和孕马血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素（PG）等，以前三种惯用。实验动物胚胎工程技术第11页12检验阴栓：妊娠0.5天中午12时中午12时早晨8时二十四小时二十四小时20小时注射PMSG注射hCG小鼠超数排卵程序放到种公鼠笼内受精卵注射PMSG注射hCG晚上5-6时晚上5-6时二十四小时二十四小时卵母细胞采集15小时实验动物胚胎工程技术第12页13

体外受精（Invitrofertilization）是指成熟精子与卵母细胞在体外环境下完成受精过程。这一过程包含卵母细胞搜集或未成熟卵母细胞培养成熟、精子获取、获能处理、受精及受精后胚胎培养等。

体外受精联合胚胎移植技术（IVF）又称试管婴儿。

二、体外受精实验动物胚胎工程技术第13页14

性别控制研究，是畜牧业生物技术中一项主要高新技术。这项技术应用，能够使畜牧上大动物繁殖按照人们意愿只生产同一性别动物。

在医学上，性别控制研究也含有主动意义。有遗传性疾病属于性连锁遗传，比如进行性肌营养不良，为X连锁隐性遗传，男性发病，女性携带异常基因但不发病。携带此致病基因女性怀孕后如做胚胎性别判定，则可防止男性患儿出生。三、胚胎性别控制实验动物胚胎工程技术第14页15性别控制技术经过对X精子与Y精子分离以控制性别在胚胎移植前对胚胎性别进行判定以控制性别经过控制饲料特征、受精环境如改变精液或阴道PH值等来控制性别。实验动物胚胎工程技术第15页16（一）分离X精子与Y精子以控制性别分离X精子与Y精子依据：X、Y精子在体积、密度、电荷、运动性和DNA含量、表面抗原等方面存在差异。将X和Y精子分离再经过人工授精能够有效地到达性别控制目标。当前将X和Y精子分离方法有沉降法、电泳法、免疫法和流式细胞仪法等。流式细胞仪法是当前分离X、Y精子较准确方法，含有重复性、科学性和有效性特点。实验动物胚胎工程技术第16页17

应用流式细胞仪分离X和Y精子原理：X精子DNA含量比Y精子高。对于奶牛，X精子比Y精子DNA含量高3.8％，因为染料着色量与精子DNA含量成正比，所以X精子吸收染料多，发出荧光就比Y精子强。正常人染色体实验动物胚胎工程技术第17页18

详细做法是：先用DNA特异性染料对精子进行活体染色，然后精子连同少许稀释液逐一经过激光束。探测器依据精子发光强度把电信号传递给计算机，计算机指令液滴充电使发光强度高液滴带正电，弱带负电。即X精子带上正电荷，Y精子带上负电荷。当经过高压电场时会向不一样方向偏转，到达分离目标。实验动物胚胎工程技术第18页19（二）对胚胎进行判定以控制性别

在胚胎移植前对胚胎部分组织用染色体检验、间接免疫荧光法和PCR法进行性别判定。其中PCR法因有可靠操作程序，含有高效、快速特点，近年来得到快速发展。

Y染色体短臂上有决定雄性DNA片段-SRY基因(sex-determiningregionofY-chromosome,全称:Y染色体性别决定区)，为胚胎性别判定提供了可靠路径。实验动物胚胎工程技术第19页20实验动物胚胎工程技术第20页21受精卵2细胞胚4细胞胚8细胞胚桑椹胚囊胚

胚胎培养是指将取得早期胚胎在体外人工环境中进行培养，以观察其发育或人工干预某一发育过程可能性。四、胚胎培养实验动物胚胎工程技术第21页22胚胎培养普通应用于以下几个方面：

1．未成熟卵母细胞经过体外培养，成熟后进行体外受精。

2．受精卵经过体外培养发育成各阶段早期胚胎，用于胚胎移植或胚胎冷冻保留。

3．冷冻保留胚胎解冻后，经过体外培养，筛选成活胚胎用于胚胎移植。

4．经过研究胚胎发育环境和条件，不停完善胚胎培养条件，揭示胚胎细胞生长发育和分化奥秘。当前胚胎培养技术已经能够将未成熟卵在体外成熟，并经过体外受精发育成各阶段早期胚胎。即使如此，在体外胚胎培养也只能发育到囊胚期，需要在囊胚期前移植到动物子宫内。实验动物胚胎工程技术第22页23---胚胎工程最终一道工序

将受精卵或发育到一定时期早期胚胎,移植到受体动物生殖管道一定部位,能在子宫内着床、生长、发育、分娩、出生仔代动物技术称为胚胎移植。几乎全部胚胎工程技术在体外完成对胚胎操作后，都需经过胚胎移植这一步骤，得到我们所要动物。五、胚胎移植实验动物胚胎工程技术第23页24体外培养胚胎必须移植到同时发情雌性动物生殖管道内。处理同时发情方法有两种：1.利用自然同期发情母畜，此法在实践上较难办到；2.经过注射一些药品(如孕激素、雌激素等)诱发同期发情。

不一样发育阶段胚胎移植部位不一样。受精卵和2细胞胚胎应移植到输卵管内，而桑椹胚和囊胚期胚胎应移植到子宫内，以跟正常妊娠生殖生理改变同时。实验动物胚胎工程技术第24页25同一个属内不一样品种品系可相互进行胚胎移植。如近交系C57BL/6J小鼠胚胎可移植到雌性封闭群ICR生殖管道内；日本大耳白兔胚胎可移植到雌性新西兰兔生殖管道内。这一特点在畜牧业尤其有用，如为了加紧良种奶牛繁殖，可将良种奶牛胚胎移植到普通黄牛生殖管道内，借腹怀胎。实验动物胚胎工程技术第25页26

胚胎冷冻保留（embryocryopreservation）技术是指在低温（-196℃液氮内）条件下利用低温保护剂保留生殖细胞及胚胎一门技术。六、胚胎冷冻保留实验动物胚胎工程技术第26页27（一）胚胎冷冻保留机制

低温降低了胚胎内生化反应速度。而且温度越低，保留时间就越长。低温损伤：假如冷却速度过慢，胞外溶液中水分大量结冰，溶液浓度提升，胞内水分大量渗出，造成细胞强烈收缩和细胞处于高浓度溶液中时间过长，从而造成化学损伤；假如冷却速度过快，胞内水分来不及经过细胞膜向外渗出，胞内溶液过冷而结冰，从而造成物理损伤。

一样，在复温（解冻）过程中，假如复温速率不妥也可能引发细胞内结冰（重结冰）而损伤。实验动物胚胎工程技术第27页28

采取低温保护剂预防低温损伤：

二甲基亚砜（DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮(pvp)、甲醇、乙二醇、羟甲基淀粉（HES）等能够防止或降低结冰程度与速度，降低细胞周围未冻结溶液中电解质浓度，从而防止或降低胚胎冷冻过程中所发生物理和化学损伤。实验动物胚胎工程技术第28页29

（二）胚胎冷冻保留技术应用

1.应用于试验动物保种和珍稀或濒危动物种质保留。⒉应用于试验动物胚胎长途运输。⒊应用于试验动物生物净化。⒋应用于试验动物育种和野生动物试验动物化。实验动物胚胎工程技术第29页30第三节动物体细胞克隆技术实验动物胚胎工程技术第30页31

克隆（clone）概念克隆是指无性繁殖或拷贝。无性生殖在植物中很常见，在动物中过去认为是不可能。动物克隆是指生物体经过体细胞核移植生产出基因型几乎与供体完全相同后代。实验动物胚胎工程技术第31页32

核移植（Nucleartransfer）是指将动物细胞细胞核移植到另一个体去核卵母细胞胞质中，经过电激活，使供体核重编程序，形成重构卵发育成胚胎，最终经过胚胎移植，使之发育成个体。假如受体去核卵和供体移入核来自同种动物，则称种内核移植，来自不一样种则称为种间核移植。核移植因为没有经过精子和卵子受精过程，核移植动物全部遗传信息来自供体核细胞，等于是复制了提供细胞核动物，因而把它俗称为“克隆”。

实验动物胚胎工程技术第32页33

依据供体核起源不一样，核移植包含以下几个：

胚胎细胞核移植：未着床囊胚（未分化）胚胎干细胞核移植（未分化）胎儿成纤维细胞：出生前胎儿（未分化或低分化）成年体细胞（已分化）实验动物胚胎工程技术第33页34动物克隆试验过程实验动物胚胎工程技术第34页35动物克隆技术意义与应用加紧良种家畜繁殖速度与体细胞转基因技术结合，能制备大家畜转基因动物拯救濒危野生动物治疗性克隆，用于再生医学实验动物胚胎工程技术第35页36再生医学技术路线介绍实验动物胚胎工程技术第36页37第四节干细胞技术实验动物胚胎工程技术第37页38一、概述干细胞是一类含有自我更新、高度增殖和多向分化潜能细胞。依据发育阶段，可将干细胞分为胚胎干细胞(embryonicstemcells，ES细胞)和成体干细胞(adultstemcells，AS细胞)。ES细胞存在于囊胚期胚胎内细胞团中，是全能性、无限增殖干细胞，在胚胎生长发育过程中含有分化形成胎儿全部类型细胞、组织和器官潜能。AS细胞是ES细胞定植于胎儿和成人各种组织和器官中“种子”，含有自我更新和分化为组织特异细胞能力，即分化为对应组织和器官中细胞“专能”细胞，包含神经干细胞、脂肪干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、精原干细胞、皮肤干细胞和肝脏干细胞等。实验动物胚胎工程技术第38页39实验动物胚胎工程技术第39页40诱导性多潜能干细胞”

(Inducedpluripotentstemcells,iPS细胞)年,Takahashi等首次发觉导入特定转录因子基因能够使已分化细胞重编程回归到胚胎细胞状态。他们经过慢病毒载体介导将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf44种转录因子基因导入小鼠皮肤成纤维细胞,取得了含有强大自我更新能力和分化潜能多能性干细胞,命名为“诱导性多潜能干细胞”

(Inducedpluripotentstemcells,iPS细胞)。这一研究克服了ES细胞和AS细胞应用存在很多问题，展现了辽阔应用前景，受到了整个生命科学领域广泛关注。当前研究中较为理想供体细胞主要有血细胞(如T细胞和B细胞等)、脂肪细胞和皮肤成纤维细胞。实验动物胚胎工程技术第40页41二、胚胎干细胞（ES细胞)起源：ES细胞是从胚胎发育早期囊胚（人胚胎受精后约5-7天，小鼠胚胎受精后3-4天）中内细胞群分离出来未分化细胞。内细胞群:含有未分化特征，可深入分裂,分化形成内、中、外三个胚层。外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等，中胚层将形成骨骼、血液和肌肉等组织，内胚层将分化为肝、肺和肠等。因为内细胞群能够发育成完整个体，因而这些细胞被认为含有全能性。当内细胞群分离出来后在培养皿中培养时，我们称之为ES细胞。实验动物胚胎工程技术第41页42

当前除了从小鼠、大鼠和人分离得到并建立ES细胞系外，还未从其它动物囊胚中分离到ES细胞系。实验动物胚胎工程技术第42页43

（二）ES细胞培养

ES细胞培养条件极其苛刻，对培养液、试剂、胎牛血清、水等均需采取胚胎级，对培养器皿等必须清洗洁净。一旦条件不适合，ES细胞轻易发生分化，从而失去ES细胞特征。

未分化ES细胞培养普通需要与用丝裂霉素处理过成纤维细胞喂养层（Feedercell）共培养，喂养层细胞为ES细胞提供细胞因子来维持其未分化状态。在培养液中加用白血病抑制因子（LeukemiaInhibitoryFactor，LIF）能更有效地维持未分化ES细胞。实验动物胚胎工程技术第43页44（三）ES细胞判定

ES细胞是一个正常胚胎性干细胞，含有正常染色体核型和体内外分化潜能。在建系之初需要对其核型、分化能力和细胞标志物进行判定

1．核型

2．体外分化试验将ES细胞在无喂养层、低胎牛血清培养液中悬浮培养，数天后形成胚样小体（embryoidbodies）内皮样大型细胞团；向成纤维细胞、心肌细胞以及造血细胞分化。

3．体内分化试验将ES细胞悬液注射到同性别小鼠腹股沟皮下，2周后注射部位出现肿块，病理检验为畸胎瘤。畸胎瘤内部有各种细胞生长，如上皮细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经细胞、成纤维细胞以及干细胞集落等，也可看到各胚层组织分化，如软骨、肌肉组织、上皮组织及腺体等。

4．ES细胞标志物

Oct-4:Oct-4（也叫Oct-3或Oct3/4）属POU转录因子一员，它在全能胚胎干细胞(ES)和生殖细胞表示。该表示对于维持干细胞自我更新和多能性是必要。ES分化造成Oct-4下调。

SSEAs:人ES细胞表示SSEA-3和SSEA-4，但不表示SSEA-1。小鼠ES细胞表示SSEA-1，但不表示SSEA-3或SSEA-4。

实验动物胚胎工程技术第44页45（四）胚胎干细胞应用1.用于研究哺乳动物个体发生发育规律

因为ES细胞可分化为胚胎内胚层、中胚层和外胚层中任何一个类型细胞，所以可用遗传标识ES细胞(如标识半乳糖苷酶基因)注入囊胚腔，经过组织化学染色追踪ES细胞分化特点，探索胚胎发育过程中细胞分化、组织和器官形成规律。小鼠ES细胞已成为研究哺乳动物早期发育规律主要工具之一。实验动物胚胎工程技术第45页46

2.在体外研究细胞分化规律

ES细胞仅在喂养层细胞上或在添加白血病抑制因子(LIF)或白细胞介素-6(IL-6)培养液中维持不分化状态。当培养液中添加分化诱导剂，如牛黄酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)、丁酰环腺苷酸和3-甲氧基苯甲酰胺等，可诱导ES细胞发生不一样类型分化，经过研究ES分化特点可揭示细胞分化和凋亡机理。实验动物胚胎工程技术第46页473.用于研究基因功效和制备基因敲除动物

因为用ES细胞可进行基因打靶，轻易取得基因敲除或定向插入外源基因ES细胞，所以是基因敲除和基因插入首选细胞。经过筛选取得阳性细胞，然后用嵌合体或细胞核移植技术取得转基因动物。用于研究未知基因生物学功效。实验动物胚胎工程技术第47页484.治疗人类一些难治性疾病

人类因为细胞坏死、退化或功效异常引发疾病，如帕金森综合症、少年糖尿病和老年痴呆症等，已成为医学上还未攻克顽症。利用ES细胞能够诱导分化形成新组织细胞特征，移植ES细胞可使坏死或退化部位得以修复并恢复正常功效。当前，在动物试验方面，用ES细胞诱导分化出一些组织细胞已成功地治愈糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑难病症。实验动物胚胎工程技术第48页495.培育出人造组织器官，用于器官移植

伴随组织工程技术发展，经过ES细胞体外诱导分化，还能够培育出人造组织器官，处理当前临床上存在供体器官不足和器官移植后免疫排斥问题。实验动物胚胎工程技术第49页50三、成体干细胞1.成体干细胞（AS细胞）起源AS细胞位于出生后体内分化成熟组织之中，含有自我更新和分化潜能，它在分裂时可产生两个子代细胞，一个与原来干细胞完全一致，另一个向前分化，形成对应组织多功效干细胞，经过分化增殖和更新衰老细胞来构筑对应器官，维持正常生理功效。现在可从骨髓和血液、胎盘、脐带、肌肉、大脑、皮肤、脂肪、滑膜等各种组织中获取各种多能干细胞。实验动物胚胎工程技术第50页512.AS细胞培养和诱导定向分化取所要分离AS细胞组织，用酶消化法分散细胞进行体外培养。再用各种技术从体外培养细胞中分离AS细胞，如用免疫磁珠分离系统分离乳腺AS细胞。同ES细胞一样，AS细胞诱导定向分化需要细胞因子、激素等刺激，如IL-l、IL-11、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等。通常情况下，供体干细胞在受体中分化为与其组织起源一致细胞。然而在一些情况下干细胞分化并不遵照这种规律，如神经外胚层起源NSC能分化为中胚层起源细胞如肌细胞，肌肉干细胞会分化为各种血细胞系等。全部干细胞中，起源于骨髓干细胞在多向性分化方面含有较大潜能，分为造血干细胞(HSC)和骨髓间质干细胞(MSC)。实验动物胚胎工程技术第51页523.AS细胞判定各种AS细胞都有自己标识物，可利用标识物进行判定。4.AS细胞应用疾病替换治疗和移植治疗

如用造血干细胞治疗白血病，造血干细胞在体外诱导分化成心肌细胞来修复受损伤心肌，治疗心力衰竭。骨髓起源干细胞及其它起源干细胞都能够分化得到成骨细胞，经过将细胞与支架材料结合后移植于骨骼受损部位，用于修复骨骼缺损。实验动物胚胎工程技术第52页53四、诱导性多潜能干细胞1.iPS细胞起源iPS细胞建立过程主要包含:①分离和培养宿主细胞；②经过病毒介导或基因转染方式将若干个多能性相关基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）导入宿主细胞；③将病毒感染后细胞种植于喂养层细胞上,用ES细胞专用培养体系中培养,同时在培养液中依据需要加入对应小分子化合物，以促进重编程。2.iPS细胞培养和诱导定向分化其培养条件和诱导定向分化条件基本与ES细胞相同。3.iPS细胞判定iPS细胞判定与ES细胞相同。实验动物胚胎工程技术第53页54怎样取得人ES细胞传统技术1.用病人皮肤细胞核移植到人去核卵母细胞人卵母细胞起源问题2.用病人皮肤细胞核移植到动物去核卵母细胞伦理问题新技术1.用ES细胞特异转录基因导入人皮肤细胞，直接转化成诱导多能干细胞（iPS）(）安全问题2.miRNAs直接将皮肤细胞转化为iPS(年）以病毒为载体，向老鼠成纤维细胞中注入4个基因，将其改造为ｉＰＳ细胞，然后在此基础上培育出一个老鼠胚胎，再把它植入代孕试验鼠体内。20天后，一只黑色小老鼠出生。实验动物胚胎工程技术第54页554.iPS细胞应用iPS细胞与ES细胞相比,含有很多优势。iPS细胞起源更方便、更丰富，能够经过有限几个转录因子基因转染直接诱导各种不一样动物体细胞来获取多能性干细胞，而不需要经过ES细胞路径，克服了许多动物至今未分离出ES细胞问题。iPS细胞产生不需要早期胚胎或者其它配子参加，克服了使用人胚胎进行试验伦理问题，可见iPS细胞必定成为未来相当长一段时间内研究热点。当前,科学家们已经成功地从小鼠、大鼠、猕猴、猪和人体细胞中诱导并取得iPS细胞。实验动物胚胎工程技术第55页56第五节外源基因导入胚胎技术

实验动物胚胎工程技术第56页57

将外源基因导入到胚胎内主要有以下几个方法：一、直接导入受精卵或早期胚胎内①显微注射法：在显微镜下利用玻璃显微注射针将外源DNA直接注入到受体受精卵雄性原核内。②逆转录病毒载体法：将外源基因克隆到逆转录病毒载体，感染受体细胞时，外源基因可整合到宿主细胞染色体内。用于转基因和基因治疗。

③精子载体法：将外源DNA与动物精子一起孵育，在体外受精过程中由精子将外源DNA带入卵内。

实验动物胚胎工程技术第57页58二、将外源基因转染胚胎干细胞或体细胞，再将转染细胞作为供体核移植到去核卵母细胞，发育成胚胎。

1.将外源基因转染胚胎干细胞或体细胞：

①电穿孔法：细胞暴露于高电压时，细胞膜为高电压瞬时击穿，从而使外源DNA被摄入细胞中。②脂质体法：脂质体是一个人造膜，将外源DNA装入脂质体，与培养细胞一起温育，即可将外源DNA导入受体细胞。③基因枪法：

④DEAE-葡聚糖介导法：⑤磷酸钙介导法：

实验动物胚胎工程技术第58页592.带有外源基因ES细胞经过崁合体技术进入囊胚胚胎嵌合是指将遗传上不一样两类胚胎或胚细胞组合起来，由此而发育形成动物称为嵌合体动物。因为嵌合体动物是两类遗传背景不一样胚胎发育形成，不一样细胞群体相互嵌合组成了器官和组织，但嵌合体动物携带两种遗传特征不能同时遗传给下一代同一个体。终究哪一个亲本遗传特征能遗传取决于该亲本细胞是否在嵌合体动物体内分化成生殖细胞（精子或卵子）。分化成生殖细胞亲本遗传特征能传给后代。实验动物胚胎工程技术第59页60嵌合体动物制备：1.聚合法用聚正当制作嵌合体动物，是将遗传上不一样（比如毛色不一样）两个8～16细胞胚胎用物理方法聚合起来。2.注射法

注射法是将胚胎干细胞或其它胚细胞注入桑椹胚或囊胚腔中来制作嵌合体动物。实验动物胚胎工程技术第60页613.带有外源基因体细胞经过克隆技术进入胚胎将带有外源基因体细胞作为供体，经过核移植技术克隆到去核卵母细胞，在体外发育成囊胚，再移植到假孕动物子宫中。出生后动物基因型与供体基因型完全一致。实验动物胚胎工程技术第61页62

外源基因进入细胞后命运

外源DNA进入细胞后有三种命运：

1．被胞内酶降解。

2．以游离状态存在。游离未整合外源DNA只要有真核细胞能识别开启子、编码基因以及poly(A)信号等，普通都能得到表示，但伴随细胞衰老，表示力下降。这种表示不能传代，称为暂时表示。

3．整合到受体细胞染色体（只有少数）。整合到受体细胞基因组外源基因，能随细胞分裂遗传到子细胞，称为稳定表示。实验动物胚胎工程技术第62页63DNA构件导入细胞方法显微注射法逆转录病毒感染精子介导转基因电穿孔电穿孔脂质体转染磷酸钙转染生殖细胞或早期胚胎ES细胞体细胞随机整合定点整合或随机整合定点整合或随机整合实验动物胚胎工程技术第63页64

外源基因整合到受体细胞染色体可分为以下两种情况：①随机插入（Randominsertion）：外源基因进入细胞后，随机插入到任意染色体内。假如插入到一个基因内，可能造成该基因失活。另外，插入外源基因受邻近调控序列影响，其表示可能高，也可能低。②定点整合（Targetedintegration）：实现定点整合前提是外源基因一端或两端带有定点整合部位同源DNA序列，即所谓同源臂（Homologousarm）。当外源基因载体进入细胞后，同源臂序列与宿主染色体上相同序列相互靠近，经过同源重组，将外源基因载体置换到染色体对应位置上，实现了定点整合。我们把这种技术形象地称之为“基因打靶”。实验动物胚胎工程技术第64页65随机整合（Randominsertion）

外源基因随机插入到染色体任意部位。插入到致死基因序列内：胚胎死亡插入到功效基因序列内：基因失活插入到调控区下游：外源基因表示增强/减弱实验动物胚胎工程技术第65页66

定点整合（targetedintegration）

同义词：基因打靶（Genetargeting）

是指将基因组某一基因序列克隆出来并加以改造，再导入同种细胞内。该基因序列能够与细胞基因组内同源序列（靶基因）发生重组，从而将改造后基因置换到基因组内，实现靶基因敲除、替换或改造。实验动物胚胎工程技术第66页67

同源重组（Homologousrecombination）

是指发生在DNA同源序列之间重组，其条件是两条DNA分子有相同序列部分，而且相互靠近。1neotk3