高通量测序技术临床应用质量管理课件

高通量测序技术临床应用质量管理李金明国家卫生计生委临床检验中心高通量测序技术临床应用质量管理基因测序技术的发展1953年：DNA双股螺旋的发现（英国剑桥大学JamesWatson和FrancisCrick）1965年：酵母tRNA测序（美国Comell大学RoberHolley，小片段重叠法）1971年：λ噬菌体两个粘性末端的完整序列（吴瑞博士，华裔分子生物学专家，引物延伸测序）1975年：加减法DNA测序（英国剑桥大学Fred）1977年：Sanger测序（英国剑桥大学FredSanger）和Maxam-GillbertDNA化学降解法测序(美国哈佛AlanMaxam&WalterGilbert）1996年：焦磷酸测序（瑞典皇家技术研究所RonaghiM等）2005年:GenomeSequencer20新一代测序仪(大规模并行焦磷酸合成测序法，454lifeScience公司的创始人JonathanRothberg)2007年:454、Solexa公司和Agencourt（SoliD测序仪）公司分别被Roche、illumina和ABI公司收购。新一代测序技术（next-generationsequencing）2007年被NatureMethods评为生物领域影响力最大的技术基因测序技术的发展1953年：DNA双股螺旋的发现（英国剑桥精准医学不等于高通量测序高通量测序是精准医学的支点精准医学不等于高通量测序高通量测序是精准医学的支点高通量测序技术的临床应用染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT）胚胎植入前遗传学筛查（PreimplantationGeneticScreening，PGS）和胚胎植入前基因诊断（PreimplantationGeneticDignosis，PGD）肿瘤靶向治疗基因突变检测单基因遗传病检测病原微生物检测：如HPV基因分型、宏基因组（Metagenomics）测序┈┈高通量测序技术的临床应用染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT高通量测序技术临床应用的规范化和质量管理国家卫生计生委医政医管局高通量测序临床应用试点实验室：评审标准、评审、试点实验室基本要求、管理试点实验室2015年增加质评调查：全国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测

2016年新增质评计划：染色体非整倍体（21、13、18）无创产筛2016年即将增加质评调查：肿瘤游离DNA（ctDNA）检测高通量测序技术临床应用的规范化和质量管理国家卫生计生委医政医高通量测序技术临床应用质量管理课件批准的第一批四个专业的试点单位批准的第一批四个专业的试点单位高通量测序技术临床应用质量管理课件国家卫生计生委高通量测序试点实验室要求国家卫生计生委高通量测序试点实验室要求基本要求（1）1.试点实验室应在国家卫生计生委批准的试点专业范围内开展临床检测工作。2.试点实验室需采用高通量测序开展不少于一项的检测项目。3.为避免污染所致的假阳性结果，各试点实验室应根据所开展的检测项目进行分区，具体各专业实验室的分区要求由国家卫生计生委临床检验中心负责发布。基本要求（1）1.试点实验室应在国家卫生计生委批准的试点专产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区标本与文库制备区文库扩增与检测区测序区产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）缓冲间测序区空气植入前胚胎遗传学诊断(全基因组低拷贝测序)缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库检测区WGA制备区试剂准备区缓冲间缓冲间空气流向空气流向电泳区扩增一区植入前胚胎遗传学诊断(全基因组低拷贝测序)缓冲间测序区空气流遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗（杂交捕获测序技术+Sanger测序验证）DNA打断区缓冲间缓冲间杂交捕获区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库扩增区（扩增二区）标本与文库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间杂交捕获区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库扩增区（扩增二区）标本与文库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗（杂交捕获测序技术+Sanger测关于“分区”、缓冲间和生物安全柜“各区独立注意风向因地制宜方便工作”实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台和工作量来决定分区的多少及各区域的空间大小。至少具体需要多少个区，同样是“个体化”的，以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时“作为基本原则。缓冲间的功能是“控制空气的流向”。生物安全柜可考虑“A2”。缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区关于“分区”、缓冲间和生物安全柜“各区独立实验室应根据自己的高通量测序实验室设计需注意的几点电泳区：DNA提取、DNA片段化后大小鉴定等步骤需要用到电泳，单独成区，但不同的检测项目可以共用该区域。测序区：应为恒温恒湿实验室，2小时温度波动应小于2℃。分区设置可根据自动化仪器设备引入做适当流程、区间整合。无创产前筛查实验室，因血浆提取为胎儿微量DNA，为防止污染，不能与其他项目的标本制备区共用。其他：实验室通风换气（>10次/小时）、生物安全柜等要求普通基因扩增实验室。高通量测序实验室设计需注意的几点电泳区：DNA提取、DNA片基本要求（2）4.试点实验室如使用商品化试剂，则应当使用经过国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准的试剂，临床应用前应经过性能验证；如使用自配试剂（LDT），必须建立自配试剂的标准操作程序，并经过性能评价。以上均须保存相应的实验记录。5.试点实验室应对相应的检测仪器设备进行日常的维护和定期校准，并保存仪器维护校准记录。基本要求（2）4.试点实验室如使用商品化试剂，则应当使用经“性能验证”（“verification”）定义“verification”：broadlyas“confirmationthroughtheprovisionofobjectiveevidence,thatspecifiedrequirementshavebeenfulfilled”.（广义为通过提供客观证据证明特定的要求得到满足）CLIAusestheterm“verification”：specificallytorelatetoconfirmationthatthelaboratoryusingatestcanreplicatethemanufacturer’sperformanceclaimswhenthetestisusedaccordingtothepackageinsert.（CLIA性能验证术语特指使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能。）“性能验证”（“verification”）定义“verif“性能确认”（“validation”

）定义TheFDAandISObothdefinetheterm“validation”

as“confirmationbyexaminationandprovisionofobjectiveevidencethattheparticularrequirementsforaspecificintendedusecanbeconsistentlyfulfilled”.（通过检查和提供客观证据证明，对一特定预期应用的要求始终能得到满足）TheFDAandISOtermsforverificationandaresimilar,withthedistinctionhavingtodowithintendeduse.（性能验证和性能确认FDA和ISO术语相似，差异在后者的“预期用途”）“性能确认”（“validation”）定义TheFDA“intendeduse”预期用途

Theterm“intendeduse”inthesedocumentsisestablishedbythemanufacturerordevelopinglaboratoryatthetimeofassaydevelopmentandhastodowiththepurposeandpopulationforwhichthetestwasintended(e.g.,diagnosis,followingtreatment,etc.).Relevantperformancecharacteristicsarethendeterminedbasedontheintendeduseofthetest.Somepeopleinterpret“intendeduse”asreferringtotherelevantclinicallaboratoryinwhichthetestisperformed,ratherthanthemanufacturerordevelopinglaboratory,thuscausingconfusion.TheWorldHealthOrganization(WHO)definesvalidationas“theaction(orprocess)ofprovingthataprocedure,process,systemequipmentormethodusedworksasexpectedandachievestheintendedresult”.（WHO将validation定义为，证明所使用的一个程序、过程、系统设备或方法能按预期进行工作以及取得预期结果的活动（或过程））“intendeduse”预期用途Theterm“i“validation”

通俗一点的定义theterm“validation”willbeusedtorefertotheanalyticperformancecharacteristicsthatneedtobeinitiallyestablishedatthetimeofassaydevelopment.（指在测定方法研发时，最早建立的分析性能特征）“validation”通俗一点的定义theterm“NGS性能评价指标有哪些？精密度（precision）：重复性研究准确度（accuracy）：方法学比较研究分析灵敏度（analyticalsensitivity）：测定下限研究分析特异性（analyticalspecificity）：干扰物质研究可报告范围（reportablerange)：可测定的基因区域研究NGS性能评价指标有哪些？精密度（precision）：重复基本要求（3）6.试点实验室应对技术人员制定培训计划，进行相关的在岗持续培训，保存人员培训记录。7.试点实验室应建立日常检测的实验记录方式，并保存相应记录。8,试点实验室应建立规范的检测结果报告与解释模式。基本要求（3）6.试点实验室应对技术人员制定培训计划，进行高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件基本要求（4）9.试点实验室应建立室内质量控制程序，在日常检测中开展室内质量控制，保存室内质控及其失控及定期综合分析的记录，并有质量改进措施。10.试点实验室应参加由国家卫生计生委组织的相应项目的室间质量评价或进行有效的实验室室间比对，并保存室间质量评价或实验室室间比对记录，对不合格的结果应进行原因分析，并采取质量改进措施。基本要求（4）9.试点实验室应建立室内质量控制程序，在日室内质量控制（Internalqualitycontrol,IQC）采用已知阴性和弱阳性质控品进行室内质控是保证检测质量的关键环节，其监控的是实验室测定的最重要的性能指标即重复性，并决定了当批实验测定是否有效，报告能否发出，是对实验室测定的即时性评价。是质量改进的不可缺少的措施。阴性质控品：不是指突变阴性的样本，而是采用无模板对照（NoTemplateControl,NTC）作为阴性质控品，阴性质控品需包含在所有的扩增步骤中，以证实在样本和试剂中没有核酸的污染。阳性质控品：包括至少一个已知突变位点，最好变异百分比接近检测下限，以证实低百分比的突变可在每批次中检出。质控样本无需在每批检测中包括所有突变类型，只需加入一个已知突变位点的质控品。但是，实验室最好有多个突变的质控品，并在日常检测中轮流使用。质控样本可以采用人基因组DNA或其他合成的带有突变的基因组DNA（不建议采用质粒）。但是这种质控品不能监测提取过程。临床样本当然是最理想的质控品，但是样本来源有限，很难长期使用。室内质量控制（Internalqualitycontro室间质量评价（Externalqualityassessment,EQA）EQA或实验室间比对的目的：监测实验室测定准确性或结果可比性；是质量改进的不可缺少的措施。EQA样本：肿瘤靶向治疗涉及的基因位点较多，EQA往往难以覆盖所有的情况，而且为保证EQA样本的来源和重复性，EQA组织者可能采用细胞系或人基因组DNA作为评价样本临床实验室可通过临床样本的实验室间比对，来作为补充。室间质量评价（Externalqualityassess基本要求（5）11.试点实验室应制定包括以下内容的标准操作程序（SOP）及相关记录表格：

（1）样本的采集、运送、保存、接收、登记和处理；

（2）知情同意告知；

（3）检测方法和步骤；

（4）试剂和耗材的选择和保存（如为自配试剂，需详细写明试剂的制备过程以及各原料的来源）；

（5）试剂性能验证或自配试剂的性能评价和方法确认；

（6）仪器的使用、维护和校准；

（7）人员培训；

（8）结果报告与解释；

（9）实验室数据、相关文件记录与保存；

（10）室内质量控制；

（11）室间质量评价或实验室间比对；

（12）知情同意和保密程序。12.其他未尽的事项要求，试点实验室均应参照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》。基本要求（5）11.试点实验室应制定包括以下内容的标准操作实验室质量管理的“灵魂”源于一些标准文件（如仪器试剂说明书、国际国内标准文件）和实验室实际工作经验积累。因此高于相关标准文件！！！SOP等于试剂盒说明书吗？标准操作程序（SOP）是实验室的“最高标准”！有可操作性的SOP是质量管理的“灵魂”！实验室质量管理的“灵魂”源于一些标准文件（如仪器试剂说明书、试点实验室可参考的一些指南性文件试点实验室可参考的一些指南性文件个体化医学检测管理办法及相关指南和导则的制订分工指南名称负责人药物代谢与效应基因多态性检测相关技术指南周宏灏院士肿瘤相关的个体化医学检测技术指南詹启敏院士曾益新院士遗传病相关个体化医学检测技术指南曾溢滔院士病原微生物相关的个体化医学检测技术指南尚红教授芯片技术的个体化医学检测应用技术指南程京院士测序技术的个体化医学检测应用技术指南于军教授原位杂交技术的个体化医学检测应用技术指南陈杰教授个体化医学检测LDT的相关技术指南程京院士个体化医学检测实验室管理办法尚红教授李金明教授

个体化医学检测管理办法及相关指南和导则的制订分工指南名称负责美国CLSI制订的一些与分子检测有关的导则或指南项目名

称内

容1CLSI/NCCLSMM1A基因疾病的分子诊断方法2CLSI/NCCLSMM2-A2免疫球蛋白和T细胞基因重排检测3CLSI/NCCLSMM3-P2传染性疾病的分子诊断方法4CLSI/NCCLSMM5-A分子血液病理学的核酸扩增检测5CLSI/NCCLSMM6传染性疾病定量的分子检测方法6CLSI/NCCLSMM7-A医学遗传检测中荧光原位杂交方法7CLSI/NCCLSMM9-A实验室诊断医学中的核酸测序方法8CLSI/NCCLSMM10-P传染性疾病的基因分型9CLSI/NCCLSMM12-P诊断用核酸芯片10CLSI/NCCLSMM13-A分子诊断方法中标本收集、运输、处理和储存11CLSI/NCCLSMM14-A分子诊断方法中的能力验证12CLSI/NCCLSMM14-A2分子检测能力验/室间质量评价设计13CLSI/NCCLSMM16-P外源RNA对照用于基因表达检测14CLSI/NCCLSMM20-A分子遗传检测的质量管理

美国CLSI制订的一些与分子检测有关的导则或指南项目名高通量测序室间质量评价染色体非整倍体（T21、T18和T13）无创产前筛查肿瘤基因突变高通量测序检测高通量测序室间质量评价2014年全国外周血胎儿染色体非整倍体（T21、T18和T13）高通量测序检测室间质量评价调查活动样本信息样本编号预期结果样本性质胎儿游离DNA浓度是否计分21号染色体非整倍体18号染色体非整倍体13号染色体非整倍体1401阴性阴性阴性染色体正常阴性样本

是1402阳性阴性阴性T216~10%是1403阴性阳性阴性T18<4%否1404阴性阴性阴性性染色体异常XXX

是1405阴性阴性阳性T136~10%是1406阴性阳性阴性T1810%,

70%嵌合是1407阴性阴性阴性染色体正常阴性样本

是1408阴性阳性阴性T186~10%是1409阴性阴性阴性染色体正常阴性样本

是1410阳性阴性阴性T2110%,

30%嵌合否1411阴性阳性阴性T1810%,

30%嵌合否1412阴性阴性阴性染色体正常阴性样本

是1413阴性阴性阳性T134~6%是1414阳性阴性阴性T214~6%是1415阳性阴性阴性T2110%,

70%嵌合是1416阴性阴性阴性染色体正常阴性样本

是1417阴性阴性阳性T13<4%否1418阴性阳性阴性T184~6%是1419阳性阴性阴性T21<4%否1420阴性阴性阴性性染色体异常XO

是2014年全国外周血胎儿染色体非整倍体（T21、T18和T1

参加实验室分布情况省（自治区、直辖市）参加实验室数省（自治区、直辖市）参加实验室数山东14内蒙2广东8广西2北京6河南2浙江5江西2江苏5山西2上海4安徽2湖南4辽宁1河北4吉林1天津3贵州1黑龙江2四川1陕西2云南1福建2湖北2重庆2新疆1共计有81家实验室回报质评结果，4家实验室报告了两个平台的检测结果，共计收到结果85份，其中有效结果84份（即回报结果完整、在截止日期内回报的结果）。医院临床实验室共计回报73份结果，独立实验室回报12份结果。参加实验室分布情况省（自治区、直辖市）评价原则任何一例阳性样本结果报告错误（即报告阴性），本次实验室成绩即为0分；阴性样本结果报告错误（阳性或“临界/灰区”），为不可接受结果。（某项目测定结果可接受样本数/某项目样本总数）×100＝本次某项目测定得分，如果该项目得分大于等于80分则为合格。未按时回报结果者判为不合格，该次得分为0分。评价原则任何一例阳性样本结果报告错误（即报告阴性），本次实验各检测平台使用的实验室数及相关参数试剂厂家检测平台CFDA批准/实验室自用方法（LDT）使用实验室数文库DNA浓度要求测序原始数据量要求唯一比对reads数要求结果判断阳性灰区阴性BGIBGISEQ-100(OEM*,IonProton)CFDA批准21≥0.15ng/µL>5M>3.2M>41.96~4<1.96BGIBGISEQ-1000(OEM,CG)CFDA批准3≥3ng/µL>6M>2M>41.96~4<1.96DaanDA8600(OEM,IonProton)CFDA批准3>0.200ng/µlNA≥3.0M>3.112.39~3.11<2.39BerryGenomicsNextSeqCN500(OEM,NextSeq500)尚未获得CFDA批准39≥10pM>3.5M>1.8M≥3NA<3CapitalBioBioelectronSeq4000(OEM,Proton)尚未获得CFDA批准10≥1nmol/LNA≥3.0M>32~3<2illuminaNextSeq500LDT1≥2ng/µl≥10M≥4M>3.52.5~3.5<2.5LDT1>3pM>5M≥3M>31.96~3<1.96LDT1>2ng/µl≥10M≥4M>3.52.8~3.5<2.8ABIIonProtonLDT1>1nmol/LNA＞3M>32~3<2LDT1>0.20ng/μlNA≥3M>32~3<2LDT1≥0.2ng/ulNA≥2M>3NA<3illuminaHiseq2000LDT1≥20nmol/L≥6M≥4M>42~4<2illuminaHiseq2500LDT1>5ng/ul≥6M>5M>3.52.5-3.5<2.5各检测平台使用的实验室数及相关参数试剂厂家检测平台CFDA

各样本总体的符合率情况样本号T21T18T13阳性灰区阴性阳性灰区阴性阳性灰区阴性140100100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)1402100%(84/84)0000100%(84/84)00100%(84/84)140400100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)140500100%(84/84)00100%(84/84)98.8%(83/84)1.2%(1/84)0140600100%(84/84)100%(84/84)0000100%(84/84)140700100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)140800100%(84/84)100%(84/84)0000100%(84/84)140900100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)141200100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)141300100%(84/84)00100%(84/84)98.8%(83/84)1.2%(1/84)01414100%(84/84)0000100%(84/84)00100%(84/84)1415100%(84/84)0000100%(84/84)00100%(84/84)141600100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)141800100%(84/84)100%(84/84)0000100%(84/84)142000100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)各样本总体的符合率情况样本号各检测平台不同样本的符合率情况一家使用Hiseq2500的实验室报告了1405和1413号样本（预期结果为T13阳性）“临界/灰区”的结果。其他所有实验室检测结果均与预期结果相符，无假阴性和假阳性结果。各检测平台不同样本的符合率情况一家使用Hiseq2500的2015年NIPT室间质量评价样本2015年NIPT室间质量评价样本参加实验室情况全国共188家实验室报名参加，第一次169家回报结果，第二次159家回报结果参加实验室情况质评结果第一次质评有1个实验室对所有两份阳性样本全部漏检，且出现1个假阳性（1515号样本）第二次质评所有实验室结果全部正确质评结果第一次质评有1个实验室对所有两份阳性样本全部漏检，且样本号基因名称NGS结果外显子突变频率1501ALKEML4{ENST00000318522}:r.1_929+220_ALK{ENST00000389048}:r.4080_6220E6:E20>10%EGFRNM_005228.3(EGFR):c.493C>T(p.Arg165Trp)4>50%FGFR3NM_000142.4(FGFR3):c.1948A>C(p.Lys650Gln)14>50%IDH1NM_005896.2(IDH1):c.395G>A(p.Arg132His)4>50%RETKIF5B{ENST00000302418}:r.1_2183_RET{NM_020975}:r.2327_5629E15:E12>20%1502FGFR2NM_000141.4(FGFR2):c.1124A>G(p.Tyr375Cys)9>50%PTPN11NM_002834.3(PTPN11):c.182A>G(p.Asp61Gly)3>20%ROS1SDC4{ENST00000372733}:r.1_239_ROS1{NM_002944}:r.5448_7368E2:E32>10%TP53NM_000546.5(TP53):c.448_459del12(p.Thr150_Pro153del)5>50%1503BRAFNM_004333.4(BRAF):c.1799T>A(p.Val600Glu)15>20%EGFRNM_005228.3(EGFR):c.2573T>G(p.Leu858Arg)21>50%FLT3NM_004119.2(FLT3):c.2520_2521insGGATCC(p.Ser840_Asn841insGlySer)20>50%KRASNM_033360.3(KRAS):c.34G>C(p.Gly12Arg)2>10%1504ALKEML4{ENST00000318522}:r.1_1751_ALK{ENST00000389048}:r.4080_6220E13:E20>20%EGFRNM_005228.3(EGFR):c.2237_2254del18(p.Glu746_Ser752delinsAla)19>50%ERBB2NM_004448.2(ERBB2):c.2263_2264TT>CC(p.Leu755Pro)19>50%NOTCH1NM_017617.3(NOTCH1):c.5965G>A(p.Asp1989Asn)32>50%NRASNM_002524.4(NRAS):c.35G>A(p.Gly12Asp)2>20%PDGFRANM_006206.4(PDGFRA):c.1664A>G(p.Tyr555Cys)12>50%1505AKT1NM_001014432.1(AKT1):c.49G>A(p.Glu17Lys)2>50%PDGFRANM_006206.4(PDGFRA):c.1681_1682insAGAGGG(p.Arg560_Val561insGluArg)12>20%KRASNM_004985.3(KRAS):c.34G>T(p.Gly12Cys)2>1%1506EGFRNM_005228.3(EGFR):c.2156G>C(p.Gly719Ala)18>50%JAK2NM_004972.3(JAK2):c.1821G>C(p.lys607Asn)14>50%NRASNM_002524.4(NRAS):c.38G>A(p.Gly13Asp)2>50%GNASNM_000516.4(GNAS):c.601C>A(p.Arg201Ser)8>20%1507HRASNM_005343.2(HRAS):c.181C>A(p.Gln61Lys)3>50%JAK2NM_004972.3(JAK2):c.1821G>C(p.Lys607Asn)14>50%KITNM_000222.2(KIT):c.1675_1680delGTTGTT(p.Val559_Val560del)11>20%PIK3CANM_006218.2(PIK3CA):c.1624G>A(p.Glu542Lys)10>10%1508ALKKIF5B{ENST00000302418}:r.1_3219_ALK{NM_004304}:r.4080_6222E24:E20>20%BRAFNM_004333.4(BRAF):c.1405_1407del3(p.Gly469del)11>20%IDH2NM_002168.2(IDH2):c.419G>A(p.Arg140Gln)4>1%JAK2NM_004972.3(JAK2):c.1849G>T(p.Val617Phe)14>50%肿瘤基因突变NGS质评所有样本均为人基因组DNA（从细胞中提取），样本量30µl，浓度30~50ng/µl。其中，1501-1508号样本检测体细胞突变，提供正常基因组DNA一份（样本编号为15NC），15NC代表临床上来自患者外周血或者正常组织样本中提取的基因组DNA。样本号基因名称NGS结果外显子突变频率1501ALKEML4不同panel的实验室数（按基因数分类）PT成绩（分）评价结果总计10080~100（含80）60~80（含60）0~60（不含0）0合格不合格≥4032410378141820~40(含20)113310465不同panel的实验室数（按基因数分类）PT成绩（分）评价结果总计10090~100（含90）60~90（含60）0~60（不含0）0合格不合格10~20(含10)1523622510<101437202104表2-1.实验室质评成绩情况表2-2.实验室质评成绩情况100%正确的实验室只占用6.7%（12/72）；合格51.2%（37/72）；22.2%（16/72）为0分不同panel的PT成绩（分）评价结果总计10080~100高通量测序实验室质量管理“难”的原因涉及的实验室多人员质量意识不够任重道远！没有精准的检测何来精准医学！高通量测序实验室质量管理“难”的原因任重道远！没有精准的检测THANKSTHANKS高通量测序技术临床应用质量管理李金明国家卫生计生委临床检验中心高通量测序技术临床应用质量管理基因测序技术的发展1953年：DNA双股螺旋的发现（英国剑桥大学JamesWatson和FrancisCrick）1965年：酵母tRNA测序（美国Comell大学RoberHolley，小片段重叠法）1971年：λ噬菌体两个粘性末端的完整序列（吴瑞博士，华裔分子生物学专家，引物延伸测序）1975年：加减法DNA测序（英国剑桥大学Fred）1977年：Sanger测序（英国剑桥大学FredSanger）和Maxam-GillbertDNA化学降解法测序(美国哈佛AlanMaxam&WalterGilbert）1996年：焦磷酸测序（瑞典皇家技术研究所RonaghiM等）2005年:GenomeSequencer20新一代测序仪(大规模并行焦磷酸合成测序法，454lifeScience公司的创始人JonathanRothberg)2007年:454、Solexa公司和Agencourt（SoliD测序仪）公司分别被Roche、illumina和ABI公司收购。新一代测序技术（next-generationsequencing）2007年被NatureMethods评为生物领域影响力最大的技术基因测序技术的发展1953年：DNA双股螺旋的发现（英国剑桥精准医学不等于高通量测序高通量测序是精准医学的支点精准医学不等于高通量测序高通量测序是精准医学的支点高通量测序技术的临床应用染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT）胚胎植入前遗传学筛查（PreimplantationGeneticScreening，PGS）和胚胎植入前基因诊断（PreimplantationGeneticDignosis，PGD）肿瘤靶向治疗基因突变检测单基因遗传病检测病原微生物检测：如HPV基因分型、宏基因组（Metagenomics）测序┈┈高通量测序技术的临床应用染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT高通量测序技术临床应用的规范化和质量管理国家卫生计生委医政医管局高通量测序临床应用试点实验室：评审标准、评审、试点实验室基本要求、管理试点实验室2015年增加质评调查：全国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测

2016年新增质评计划：染色体非整倍体（21、13、18）无创产筛2016年即将增加质评调查：肿瘤游离DNA（ctDNA）检测高通量测序技术临床应用的规范化和质量管理国家卫生计生委医政医高通量测序技术临床应用质量管理课件批准的第一批四个专业的试点单位批准的第一批四个专业的试点单位高通量测序技术临床应用质量管理课件国家卫生计生委高通量测序试点实验室要求国家卫生计生委高通量测序试点实验室要求基本要求（1）1.试点实验室应在国家卫生计生委批准的试点专业范围内开展临床检测工作。2.试点实验室需采用高通量测序开展不少于一项的检测项目。3.为避免污染所致的假阳性结果，各试点实验室应根据所开展的检测项目进行分区，具体各专业实验室的分区要求由国家卫生计生委临床检验中心负责发布。基本要求（1）1.试点实验室应在国家卫生计生委批准的试点专产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区标本与文库制备区文库扩增与检测区测序区产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）缓冲间测序区空气植入前胚胎遗传学诊断(全基因组低拷贝测序)缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库检测区WGA制备区试剂准备区缓冲间缓冲间空气流向空气流向电泳区扩增一区植入前胚胎遗传学诊断(全基因组低拷贝测序)缓冲间测序区空气流遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗（杂交捕获测序技术+Sanger测序验证）DNA打断区缓冲间缓冲间杂交捕获区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库扩增区（扩增二区）标本与文库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间杂交捕获区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库扩增区（扩增二区）标本与文库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗（杂交捕获测序技术+Sanger测关于“分区”、缓冲间和生物安全柜“各区独立注意风向因地制宜方便工作”实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台和工作量来决定分区的多少及各区域的空间大小。至少具体需要多少个区，同样是“个体化”的，以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时“作为基本原则。缓冲间的功能是“控制空气的流向”。生物安全柜可考虑“A2”。缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区关于“分区”、缓冲间和生物安全柜“各区独立实验室应根据自己的高通量测序实验室设计需注意的几点电泳区：DNA提取、DNA片段化后大小鉴定等步骤需要用到电泳，单独成区，但不同的检测项目可以共用该区域。测序区：应为恒温恒湿实验室，2小时温度波动应小于2℃。分区设置可根据自动化仪器设备引入做适当流程、区间整合。无创产前筛查实验室，因血浆提取为胎儿微量DNA，为防止污染，不能与其他项目的标本制备区共用。其他：实验室通风换气（>10次/小时）、生物安全柜等要求普通基因扩增实验室。高通量测序实验室设计需注意的几点电泳区：DNA提取、DNA片基本要求（2）4.试点实验室如使用商品化试剂，则应当使用经过国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准的试剂，临床应用前应经过性能验证；如使用自配试剂（LDT），必须建立自配试剂的标准操作程序，并经过性能评价。以上均须保存相应的实验记录。5.试点实验室应对相应的检测仪器设备进行日常的维护和定期校准，并保存仪器维护校准记录。基本要求（2）4.试点实验室如使用商品化试剂，则应当使用经“性能验证”（“verification”）定义“verification”：broadlyas“confirmationthroughtheprovisionofobjectiveevidence,thatspecifiedrequirementshavebeenfulfilled”.（广义为通过提供客观证据证明特定的要求得到满足）CLIAusestheterm“verification”：specificallytorelatetoconfirmationthatthelaboratoryusingatestcanreplicatethemanufacturer’sperformanceclaimswhenthetestisusedaccordingtothepackageinsert.（CLIA性能验证术语特指使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能。）“性能验证”（“verification”）定义“verif“性能确认”（“validation”

）定义TheFDAandISObothdefinetheterm“validation”

as“confirmationbyexaminationandprovisionofobjectiveevidencethattheparticularrequirementsforaspecificintendedusecanbeconsistentlyfulfilled”.（通过检查和提供客观证据证明，对一特定预期应用的要求始终能得到满足）TheFDAandISOtermsforverificationandaresimilar,withthedistinctionhavingtodowithintendeduse.（性能验证和性能确认FDA和ISO术语相似，差异在后者的“预期用途”）“性能确认”（“validation”）定义TheFDA“intendeduse”预期用途

Theterm“intendeduse”inthesedocumentsisestablishedbythemanufacturerordevelopinglaboratoryatthetimeofassaydevelopmentandhastodowiththepurposeandpopulationforwhichthetestwasintended(e.g.,diagnosis,followingtreatment,etc.).Relevantperformancecharacteristicsarethendeterminedbasedontheintendeduseofthetest.Somepeopleinterpret“intendeduse”asreferringtotherelevantclinicallaboratoryinwhichthetestisperformed,ratherthanthemanufacturerordevelopinglaboratory,thuscausingconfusion.TheWorldHealthOrganization(WHO)definesvalidationas“theaction(orprocess)ofprovingthataprocedure,process,systemequipmentormethodusedworksasexpectedandachievestheintendedresult”.（WHO将validation定义为，证明所使用的一个程序、过程、系统设备或方法能按预期进行工作以及取得预期结果的活动（或过程））“intendeduse”预期用途Theterm“i“validation”

通俗一点的定义theterm“validation”willbeusedtorefertotheanalyticperformancecharacteristicsthatneedtobeinitiallyestablishedatthetimeofassaydevelopment.（指在测定方法研发时，最早建立的分析性能特征）“validation”通俗一点的定义theterm“NGS性能评价指标有哪些？精密度（precision）：重复性研究准确度（accuracy）：方法学比较研究分析灵敏度（analyticalsensitivity）：测定下限研究分析特异性（analyticalspecificity）：干扰物质研究可报告范围（reportablerange)：可测定的基因区域研究NGS性能评价指标有哪些？精密度（precision）：重复基本要求（3）6.试点实验室应对技术人员制定培训计划，进行相关的在岗持续培训，保存人员培训记录。7.试点实验室应建立日常检测的实验记录方式，并保存相应记录。8,试点实验室应建立规范的检测结果报告与解释模式。基本要求（3）6.试点实验室应对技术人员制定培训计划，进行高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件高通量测序技术临床应用质量管理课件基本要求（4）9.试点实验室应建立室内质量控制程序，在日常检测中开展室内质量控制，保存室内质控及其失控及定期综合分析的记录，并有质量改进措施。10.试点实验室应参加由国家卫生计生委组织的相应项目的室间质量评价或进行有效的实验室室间比对，并保存室间质量评价或实验室室间比对记录，对不合格的结果应进行原因分析，并采取质量改进措施。基本要求（4）9.试点实验室应建立室内质量控制程序，在日室内质量控制（Internalqualitycontrol,IQC）采用已知阴性和弱阳性质控品进行室内质控是保证检测质量的关键环节，其监控的是实验室测定的最重要的性能指标即重复性，并决定了当批实验测定是否有效，报告能否发出，是对实验室测定的即时性评价。是质量改进的不可缺少的措施。阴性质控品：不是指突变阴性的样本，而是采用无模板对照（NoTemplateControl,NTC）作为阴性质控品，阴性质控品需包含在所有的扩增步骤中，以证实在样本和试剂中没有核酸的污染。阳性质控品：包括至少一个已知突变位点，最好变异百分比接近检测下限，以证实低百分比的突变可在每批次中检出。质控样本无需在每批检测中包括所有突变类型，只需加入一个已知突变位点的质控品。但是，实验室最好有多个突变的质控品，并在日常检测中轮流使用。质控样本可以采用人基因组DNA或其他合成的带有突变的基因组DNA（不建议采用质粒）。但是这种质控品不能监测提取过程。临床样本当然是最理想的质控品，但是样本来源有限，很难长期使用。室内质量控制（Internalqualitycontro室间质量评价（Externalqualityassessment,EQA）EQA或实验室间比对的目的：监测实验室测定准确性或结果可比性；是质量改进的不可缺少的措施。EQA样本：肿瘤靶向治疗涉及的基因位点较多，EQA往往难以覆盖所有的情况，而且为保证EQA样本的来源和重复性，EQA组织者可能采用细胞系或人基因组DNA作为评价样本临床实验室可通过临床样本的实验室间比对，来作为补充。室间质量评价（Externalqualityassess基本要求（5）11.试点实验室应制定包括以下内容的标准操作程序（SOP）及相关记录表格：

（1）样本的采集、运送、保存、接收、登记和处理；

（2）知情同意告知；

（3）检测方法和步骤；

（4）试剂和耗材的选择和保存（如为自配试剂，需详细写明试剂的制备过程以及各原料的来源）；

（5）试剂性能验证或自配试剂的性能评价和方法确认；

（6）仪器的使用、维护和校准；

（7）人员培训；

（8）结果报告与解释；

（9）实验室数据、相关文件记录与保存；

（10）室内质量控制；

（11）室间质量评价或实验室间比对；

（12）知情同意和保密程序。12.其他未尽的事项要求，试点实验室均应参照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》。基本要求（5）11.试点实验室应制定包括以下内容的标准操作实验室质量管理的“灵魂”源于一些标准文件（如仪器试剂说明书、国际国内标准文件）和实验室实际工作经验积累。因此高于相关标准文件！！！SOP等于试剂盒说明书吗？标准操作程序（SOP）是实验室的“最高标准”！有可操作性的SOP是质量管理的“灵魂”！实验室质量管理的“灵魂”源于一些标准文件（如仪器试剂说明书、试点实验室可参考的一些指南性文件试点实验室可参考的一些指南性文件个体化医学检测管理办法及相关指南和导则的制订分工指南名称负责人药物代谢与效应基因多态性检测相关技术指南周宏灏院士肿瘤相关的个体化医学检测技术指南詹启敏院士曾益新院士遗传病相关个体化医学检测技术指南曾溢滔院士病原微生物相关的个体化医学检测技术指南尚红教授芯片技术的个体化医学检测应用技术指南程京院士测序技术的个体化医学检测应用技术指南于军教授原位杂交技术的个体化医学检测应用技术指南陈杰教授个体化医学检测LDT的相关技术指南程京院士个体化医学检测实验室管理办法尚红教授李金明教授

个体化医学检测管理办法及相关指南和导则的制订分工指南名称负责美国CLSI制订的一些与分子检测有关的导则或指南项目名

称内

容1CLSI/NCCLSMM1A基因疾病的分子诊断方法2CLSI/NCCLSMM2-A2免疫球蛋白和T细胞基因重排检测3CLSI/NCCLSMM3-P2传染性疾病的分子诊断方法4CLSI/NCCLSMM5-A分子血液病理学的核酸扩增检测5CLSI/NCCLSMM6传染性疾病定量的分子检测方法6CLSI/NCCLSMM7-A医学遗传检测中荧光原位杂交方法7CLSI/NCCLSMM9-A实验室诊断医学中的核酸测序方法8CLSI/NCCLSMM10-P传染性疾病的基因分型9CLSI/NCCLSMM12-P诊断用核酸芯片10CLSI/NCCLSMM13-A分子诊断方法中标本收集、运输、处理和储存11CLSI/NCCLSMM14-A分子诊断方法中的能力验证12CLSI/NCCLSMM14-A2分子检测能力验/室间质量评价设计13CLSI/NCCLSMM16-P外源RNA对照用于基因表达检测14CLSI/NCCLSMM20-A分子遗传检测的质量管理

美国CLSI制订的一些与分子检测有关的导则或指南项目名高通量测序室间质量评价染色体非整倍体（T21、T18和T13）无创产前筛查肿瘤基因突变高通量测序检测高通量测序室间质量评价2014年全国外周血胎儿染色体非整倍体（T21、T18和T13）高通量测序检测室间质量评价调查活动样本信息样本编号预期结果样本性质胎儿游离DNA浓度是否计分21号染色体非整倍体18号染色体非整倍体13号染色体非整倍体1401阴性阴性阴性染色体正常阴性样本

是1402阳性阴性阴性T216~10%是1403阴性阳性阴性T18<4%否1404阴性阴性阴性性染色体异常XXX

是1405阴性阴性阳性T136~10%是1406阴性阳性阴性T1810%,

70%嵌合是1407阴性阴性阴性染色体正常阴性样本

是1408阴性阳性阴性T186~10%是1409阴性阴性阴性染色体正常阴性样本

是1410阳性阴性阴性T2110%,

30%嵌合否1411阴性阳性阴性T1810%,

30%嵌合否1412阴性阴性阴性染色体正常阴性样本

是1413阴性阴性阳性T134~6%是1414阳性阴性阴性T214~6%是1415阳性阴性阴性T2110%,

70%嵌合是1416阴性阴性阴性染色体正常阴性样本

是1417阴性阴性阳性T13<4%否1418阴性阳性阴性T184~6%是1419阳性阴性阴性T21<4%否1420阴性阴性阴性性染色体异常XO

是2014年全国外周血胎儿染色体非整倍体（T21、T18和T1

参加实验室分布情况省（自治区、直辖市）参加实验室数省（自治区、直辖市）参加实验室数山东14内蒙2广东8广西2北京6河南2浙江5江西2江苏5山西2上海4安徽2湖南4辽宁1河北4吉林1天津3贵州1黑龙江2四川1陕西2云南1福建2湖北2重庆2新疆1共计有81家实验室回报质评结果，4家实验室报告了两个平台的检测结果，共计收到结果85份，其中有效结果84份（即回报结果完整、在截止日期内回报的结果）。医院临床实验室共计回报73份结果，独立实验室回报12份结果。参加实验室分布情况省（自治区、直辖市）评价原则任何一例阳性样本结果报告错误（即报告阴性），本次实验室成绩即为0分；阴性样本结果报告错误（阳性或“临界/灰区”），为不可接受结果。（某项目测定结果可接受样本数/某项目样本总数）×100＝本次某项目测定得分，如果该项目得分大于等于80分则为合格。未按时回报结果者判为不合格，该次得分为0分。评价原则任何一例阳性样本结果报告错误（即报告阴性），本次实验各检测平台使用的实验室数及相关参数试剂厂家检测平台CFDA批准/实验室自用方法（LDT）使用实验室数文库DNA浓度要求测序原始数据量要求唯一比对reads数要求结果判断阳性灰区阴性BGIBGISEQ-100(OEM*,IonProton)CFDA批准21≥0.15ng/µL>5M>3.2M>41.96~4<1.96BGIBGISEQ-1000(OEM,CG)CFDA批准3≥3ng/µL>6M>2M>41.96~4<1.96DaanDA8600(OEM,IonProton)CFDA批准3>0.200ng/µlNA≥3.0M>3.112.39~3.11<2.39BerryGenomicsNextSeqCN500(OEM,NextSeq500)尚未获得CFDA批准39≥10pM>3.5M>1.8M≥3NA<3CapitalBioBioelectronSeq4000(OEM,Proton)尚未获得CFDA批准10≥1nmol/LNA≥3.0M>32~3<2illuminaNextSeq500LDT1≥2ng/µl≥10M≥4M>3.52.5~3.5<2.5LDT1>3pM>5M≥3M>31.96~3<1.96LDT1>2ng/µl≥10M≥4M>3.52.8~3.5<2.8ABIIonProtonLDT1>1nmol/LNA＞3M>32~3<2LDT1>0.20ng/μlNA≥3M>32~3<2LDT1≥0.2ng/ulNA≥2M>3NA<3illuminaHiseq2000LDT1≥20nmol/L≥6M≥4M>42~4<2illuminaHiseq2500LDT1>5ng/ul≥6M>5M>3.52.5-3.5<2.5各检测平台使用的实验室数及相关参数试剂厂家检测平台CFDA

各样本总体的符合率情况样本号T21T18T13阳性灰区阴性阳性灰区阴性阳性灰区阴性140100100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)1402100%(84/84)0000100%(84/84)00100%(84/84)140400100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)140500100%(84/84)00100%(84/84)98.8%(83/84)1.2%(1/84)0140600100%(84/84)100%(84/84)0000100%(84/84)140700100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)140800100%(84/84)100%(84/84)0000100%(84/84)140900100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)141200100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)141300100%(84/84)00100%(84/84)98.8%(83/84)1.2%(1/84)01414100%(84/84)0000100%(84/84)00100%(84/84)1415100%(84/84)0000100%(84/84)00100%(84/84)141600100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)141800100%(84/84)100%(84/84)0000100%(84/84)142000100%(84/84)00100%(84/84)00100%(84/84)各样本总体的符合率情况样本号各检测平台不同样本的符合率情况一家使用Hiseq2500的实验室报告了1405和1413号样本（预期结果为T13阳性）“临界/灰区”的结果。其他所有实验室检测结果均与预期结果相符，无假阴性和假阳性结果。各检测平台不同样本的符合率情况一家使用Hiseq2500的2015年NIPT室间质量评价样本2015年NIPT室间质量评价样本参加实验室情况全国共188家实验室报名参加，第一次169家回报结果，第二次159家回报结果参加实验室情况质评结果第一次质评有1个实验室对所有两份阳性样本全