2015年七年制肿瘤组织培养

第一节组织培养基本概念第二节组织培养细胞生物学第三节

体外培养细胞成功率的分析第四节

建立细胞系或细胞株第五节

组织培养的基本操作和培养技术第六节

肿瘤细胞的培养本课内容2第一节组织培养基本概念一、组织培养基本概念二、对组织培养的评价三、对组织培养工作者的要求和工作方法45一、组织培养基本概念组织培养（TissueCulture）：指的

是从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定培养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能

的方法。体外培养细胞种类（In

Vitro）细胞培养培养组织培养6Making

a

Primary

Culture7细胞培养（CellCulture）：用的是同样方法，培养物是单个细胞或细胞群。891011培养（

an

Culture）：培养物是的原基、

的一部分或整个

，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。an

culturecanbeused

tostudyearly

kidney

developmentinvitro(a).Branchingmorphogenesisandepithelialization

ofmesenchymalprecursor

cells

canbe

visualized

directly

(b)orvia

aHoxB7-EGFP

transgenethat

isexpressedspecifically

intheureteric（输尿管）

bud.enhanced

green

fluorescence

protein强化绿荧1光2

蛋白13组织培养与细胞培养的关系组织培养与细胞培养并无严格区别:组织培养可出现细胞单一化现象→变成单一类型细胞→细胞培养。细胞在培养中的生命活动是互相依

存的，呈现着一定的“组织”特性。1415体外培养细胞种类16二、对组织培养的评价优点：非常好的实验对象能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动；可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作。便于使用摄影、摄和闭路电视等方法进行记录，能直接观察活细胞变化。可供研究的细胞种类极其广泛，从生物到高等生物，以及人类；胚胎→成体；正常细胞→肿瘤细胞。17对组织培养的评价便于使用各种不同的技术方法，例如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、组织化学、同位素标记等方法观察和研究细胞。培养细胞带有与体内细胞同等的组（Genome），也是分子生物学和

工程的研究对象；细胞培养技术已是分子生物学和工程的重要组成部分。18对组织培养的评价易于施用物理、化学和生物因素等进行研究。可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，比较经济。已成为生物制品、单克隆抗体生产和 工程制品等的生产

。1920对组织培养的评价不足之处离体，独立生存在人工培养环境中，与体内环境相比，差异很大。在利用培养细胞做实验对象时，不应视为与体内细胞完全一样，把实验结果外推至体内，轻易作出与体内相同的结论。21三、对组织培养工作者的要求和工作方法除掌握操作技术之外，尚需明白各种操作的基本原理。要有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力。熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状和与此有关的基本理论知识。实验操作要求应将所有操作程序如洗刷、配液、 等，制定出

的规范和要求。各种用液均由专人负责配制，并按规程行事：浓度精确，灭菌可靠。所有 好的溶液和试剂瓶上都要有 ，注上名称、浓度、与否和

日期。一切培养用品都要有固定的存放地点，其中尤为重要的是：培养用品和非培养用品应严

格分开；已

与未

品应严格分开存放。2223第二节

组织培养细胞生物学24一、体内外细胞的差异与分化二、培养细胞形态分类三、培养细胞的大体形态四、组织培养细胞的生长和增殖过程五、培养细胞生存环境和条件25概念细胞生长：细胞体积增大；细胞增殖：细胞数量增多。一、体内外细胞的差异与分化它们的增殖方式是相同的，均赖于有丝

。体内、外细胞的差异关键在于细胞的分化，从而细胞分化是检测细胞差异的问题。26（一）体内、外细胞的差异培养细胞最多见的表现：失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、出现类似

“反祖”现象；细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。每个细胞的生命活动，均听命于外源信号（来自其它细胞），通过相关

的调控，使之发生增殖或分化的表达。当细胞被离体培养后，信号来源切断，特定

分化表达减弱或停止。而进化中保守的细胞增殖活动却可维持；遂使体内外细胞出现了差异。27（二）培养细胞的分化细胞分化的概念：是指同一来源的细胞通过

逐渐产生结构和功能上稳定性差异的过程。即一种类型的细胞在形态结构、生理功能和生物化学特性方面稳定地转变为另一类型细胞的过程。在

发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态结构和生理功能上发生稳定性的差异的过程称为细胞分化（cellular

differentiation）。2829细胞分化的特点主要可以概括成四点持久性：细胞分化贯穿于生物体整个生命进程中,在胚胎期达到最大程度稳定性和不可逆性：一般来说，分化了的细胞将一直保持分化后的状态，直到。普遍性：生物界普遍存在，是生物

发育的基础。正常情况下，细胞分化是稳定、不可逆的。一旦细胞受到某种刺激发生变化，开始向某一方向分化后，即使引起变化的刺激不再存在，分化仍能进行，并可通过细胞

不断继续下去。遗传物质不变性：细胞分化是伴随着细胞进行的，亲代与子代细胞的形态、结构或功能发生改变，但细胞内的遗传物质不变。30细胞分化的机制：极其复杂。是细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，有众多

参与、多阶段和多环节的动态演变过程。3132（三）培养细胞的分化不适应（Deadaptation）:细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显。因环境改变所致。脱分化或去分化（Dedifferentiation）：细胞失去发生分化的能力。很可能是基因变异所致。在于是否存在有诱导细胞发生分化的因子如在培养液中存在有相应的因子时，体外培养细胞同样能发生分化现象。如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定条件下可以血红蛋白，标志着肿瘤细胞向正常细胞状态转变。细胞恶变的本质是细胞增殖生长和分化调控的失控。诱导细胞发生分化是癌细胞逆转的表现。培养细胞是研究分化最理想的实验对象。细胞分化的关键33二、培养细胞形态分类培养细胞形态悬浮型多形型细胞上皮型细胞贴附型成纤维型细胞型细胞34贴附型细胞：在培养时能贴附在支持物表面生长。悬浮型细胞：不贴壁，悬浮生长，如某些癌细胞和白血病细胞。胞体圆形。优点：生存空间大，容许长时间生长，能产生多量细胞，便于做细胞代谢研究。35特点：细胞

呈梭形或不

规则三角形，有卵圆形核，胞质向外伸出2~3个突起。呈放射状、火焰状或漩涡状走行。中胚层间充质的组织。成纤维型细胞：细胞来中胚层间充质组织。除真正的成纤维型细胞，心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。36型细胞特点：细胞在支持物上散在生长，一般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的或变形运动，速度快而且规则。不很稳定，有时亦难和其它型细胞相区别。37特点：细胞扁

平不规则多角

型，核圆，细

胞紧密相连呈

单层膜。细胞

增殖数量多时，整块上皮膜随

之移动；处于

上皮膜边缘的

细胞多与膜相

连，很少脱离

细胞群单独活

动。上皮型细胞于内、外胚层细胞。组织:皮肤表皮及其衍生物、消化道分上皮、肝、胰、肺泡上皮。38上皮型细胞：人肝癌细胞细胞扁

平不规

则多角

型，核

圆，细

胞紧密

相连呈

单层膜。39多形型细胞特点：难以确定它

们规律的

细胞形态，如神经组

织的细胞

等。40412.

贴壁细胞：圆形

短时间内

扁平圆饼型（放射延展细胞）

极性细胞1.

悬浮细胞：圆形细胞与球体呈同心圆层（附于球体表面）0.5~2h三、培养细胞的大体形态悬浮状态的圆形细胞细胞贴壁延展过程极性细胞：常伸出伪足，使细胞发生定向运动。当细胞互相接壤成片后，极性常变得不明显。贴壁的放射延展细

胞：细

胞质可

区分为：内质：核周胞质稠密区，内含有较多细胞器。外质：物色透明包

绕内质，含微丝

和微管。42三、培养细胞的大体形态体外培养活细胞的形态光镜下，细胞均质而透明，结构极不明，只有用相差显微镜才能看清细胞的轮廓和结构。一般有12个核仁。用固定染色法和特殊技术可显示出细胞器等结构，但在活细胞中却不易观察到。细胞机能状态不良的形态细胞轮廓会增强，反差增大。在胞质中时而出现颗粒、脂滴和空泡等，是细胞代谢不良的表现：反差很大的暗红色小颗粒是变性的线粒体。43影响细胞形态的因素细胞在体外生存时间、细胞种类。初代培养的正常二倍体细胞：除大体形态外，在构造和生物学形状上与原体内细胞近似性大，细胞均质性和都很强。传代细胞：轮廓增强、核仁增多、有时出现双核或多核巨细胞等。转化细胞：形态变化更大4445四、组织培养细胞的生长和增殖过程1.

传代（Passage

or

Subculture)：当培养细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新培养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。组织培养细胞生命期（LifeSpan

of

Culture

Cells)是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。视细胞的种类、性状和原供体的

等情况。人胚二倍体成纤维细胞可传30~50代，相当于150~300个细胞周期，约一年左右。肝细胞或肾细胞：几代或十几代。46原代培养期传代期期3.

培养细胞全生存过程三个阶段4748即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续约1~4周。特点：细胞群是异质的（Heterogenous），细胞相互依存性强。多呈二倍体核型，和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。（1）原代培养（Primary

Culture）期492.

传代期初代培养细胞一经传代便改称作细胞系（Cell Line）。特点：细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型，也叫二倍体细胞系(diploid

cell

line)。为了保存二倍体细胞性质，细胞应在初代或传代早期冻存为好。一般细胞在10代以内冻存。传代10~50左右，细胞增殖减慢。3.

期特点：仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后

凋亡。细胞可发生自发转化（SpontaneousTransformation）转化的标志之一是细胞可获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。永生性即细胞获持久性增殖能力（无限细胞系）。5051无污染环境温度气体环境和氢离子浓度体外培养细胞生存所需基本物质渗透压培养基附着物抑制细胞生长因素细胞代谢和调控五、培养细胞生存环境和条件52无污染环境代谢物要及时清除。温度36.5℃±0.5℃。培养细胞对低温的耐受力比对高温强。温度达43℃以上1小时，细胞都将被杀死。氧气参与三 。95%氧气，5%CO2。CO2能维持培养基的pH值（7.2~7.4），细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸性环境中更利于生长。细胞在生长过程中随着细胞数量的增多和代谢活动的增强，不断CO2，致培养基变酸。CO2+H2O←→H2CO3

←→

H+＋HCO3－CO2使pH值降低。3.

气体环境和氢离子浓度5354体外培养细胞生存所需基本物质①糖②氨基酸③促生长因子④元素、促细胞贴附物质渗透压人血浆渗透压为290Osm/kg大多数细胞为260~

320

Osm/kg6.

培养基①培养基（Synthetic

Medium）：是按人和动物体内细胞所需成分模拟的、配方恒定的一种较理想的培养基。对动物细胞来说只能维持细胞的生存，要想使细胞生长和增殖，还需补充部分天然培养基②天然培养基：主要来自动物体液或从组织中分离提取的成分，其营养性较高，但成分复杂，差异较大，在来源上有一定限制。55③

无

培养基应用：研究细胞生长因子、单克隆抗体的

以及细胞

产物的研究等56绝大多数培养细胞需附着在适宜的底物上才能生长。细胞贴附在底物上生长的性质称锚着依赖性。①玻璃②

塑料：聚苯乙烯；聚四氟乙烯：可制成薄膜，建成小块后能置入各种平皿中，适于细胞贴附生长，便于取出、染色和做电镜切片。③微载体：是由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球体，附着面大，利于大量繁殖细胞。④饲细胞（Feeder

Cell）：可用成纤维细胞或其它细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力但尚存活和有代谢活动。令其作为底物，将其它细胞接种于其上；伺细胞的代谢产物利于其它细胞生长。可用于培养特殊难培养细胞。7.

附着底物578.

抑制细胞生长因素物质或微生物能抑制细胞生存和生长灭活 ，消灭 物质9.

细胞代谢和调控：糖、蛋白质、脂类、核酸代谢（略）58第三节

体外培养细胞成功率的分析一、组织和细胞供体二、培养条件三、贴附底物四、培养方法59关键在于初代培养何谓培养成功？两步骤培养物必须能贴附在底物上，继而细胞才能发生运动、生长增殖、细胞数量增多，它标志着成功率达90%以上或者说已基本成功。扩大再培养，使细胞数量增多和继续生存。60如何使第一步获得成功？一、组织和细胞供体来自年幼

比年老者易于培养分化低的组织比分化高的易培养一个培养物中的细胞成分性状是不均一的，即异质性，表现在分化程度、生物性状、

增殖能力和对体外培养环境的适应能力不同。如皮肤培养时，成纤维细胞大多先生长，并能压过表皮细胞的生长；干细胞比非干细胞易生长繁殖。6162二、培养条件不同细胞对培养基需求不同，应选择相应的培养基。永生性细胞系和肿瘤细胞系等适应性强，可在各种培养基中生存。培养正常人上皮细胞尚需很多特殊生长因子，单细胞克隆需要用条件培养基和Ham

F12培养基。培养特定细胞时，应能了解到该细胞的生物学性状和特殊需求成分才易获成功。三、贴附底物不同细胞对附着底物要求不同，表皮细胞适应在胶原层生长。培养贴附型细胞时，第一步需要使细胞能够贴壁，贴附是细胞增殖生长的条件，细胞首先贴赋于底物上才能生长繁殖。63四、培养方法不同消化方法对贴壁和生长增殖有影响，胶原纤维多的组织适用胶原酶消化，上

皮细胞适用胰蛋白酶消化。64第四节

建立细胞系或细胞株一、体外培养细胞的种类和命名立细胞系或细胞株的要求三、已建立细胞系或细胞株的鉴定、管理和使用65一、体外培养细胞的种类和命名1.

初代培养（primary

culture）初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和

进行的第一次培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称细胞系。662.

细胞系初代培养物开始第一次传代后的细胞，即改称之为细胞系（Cell

Line）.如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite

Cell

Line）.已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（InfiniteCell

Line）.6768NIH

3T

3

\

Rat

1

\

10T1/

2恶性转化细胞系：永生性、异体致瘤性无限细胞系或转化细胞系：只具有永生性而无恶性的细胞系。亚系（Subline）：由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞的亚系。3.

克隆细胞株从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株（cell

strain）。再由原细胞株进一步分离培养出与原细胞株不同的细胞株，称该细胞株的亚株（Substrain）。694.

二倍体细胞细胞群数目具有与原供体二倍体细胞数目相同或基本相同（2n细胞占75%或80%以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。可供研究衰老之用。在初代或2~5代冻存作为原种。705.

遗传缺陷细胞从有

遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体716.

肿瘤细胞系或株具有不死性和异体接种致瘤性命名举例：Hela：为供体者的名字（来自宫颈癌）CHO：中国仓鼠 细胞（Chinese

HamsterOvary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3： 国立卫生

（NationalInstitute

of

Health）建立；每3天传代一次，每次接种3×105细胞/毫升。72立细胞系或细胞株的要求组织来源：应说明细胞供体所属物种，来自、动物或其它；供体的、、取材的或组织；如系肿瘤组织，应说明临床病理，组织来源，以及病例号等。细胞生物学检测：应了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞的一般形态、特异结构、细胞生长曲线和

指数、倍增时间、接种率；特异性，如为腺细胞有否特殊产物；如为肿瘤细胞，应力求证明细胞确系来源于原肿瘤组织而非其它，并仍保持恶性性，为此需做软琼脂培养、异体动物接种致瘤性和对正常组织浸润力等试验。培养条件和方法：指明适用的培养基、种类、用量以及细胞生存的适宜pH等。73三、已建立细胞系或细胞株鉴定、管理和使用ATCC（

标准细胞库或细胞银行）入库细胞要求检测项目如下培养简历：组织来源日期、物种、组织、性别、

、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等。冻存液：培养基和防冻液名称。细胞 ：融解前后细胞接种存活率和生长特性。培养液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、 来源和含量。细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等。核型：二倍体或多倍体，标记 的有无。无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和 等。物种检测：检测同工酶、主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染。免疫检测：一两种细胞建立者：建立者学检测。、检测者

。76第五节 组织培养的基本操作和培养技术一、培养室内的无菌操作二、基本操作和培养技术三、常规组织培养法7778一、培养室内的无菌操作培养用品布局缓冲液培养瓶架培养瓶吸管瓶帽灯废液缸培养液架吸管架后备品培养液79培养室内的无菌操作程序超净台无人时开紫外灯（30瓦）20~30min,勿置培养细胞和培养用液等物；培养室用紫外灯或2%碳酸溶液喷雾消毒。无菌服、帽子、

，每周高压一次

液（0.2

%新洁尔灭）

洗手及手腕，或用75%

擦洗80用

擦洗培养台面备齐培养液、玻

璃器皿、吸管等，培养液用37℃水浴，擦干。在开启培养瓶及液瓶时，需用酒精棉清洁瓶口附近，火焰灭菌。8182培养室内的无菌操作程序7.

瓶的开启应在火焰

附近几㎝以内的上

升气流中进行，使

瓶口保持在对着火

焰而略微倾斜的状

态。为了避免下落

的细菌污染，切忌

敞开瓶口垂直放置。胶塞用持吸管的右

手小指夹持之。吸管在灭菌后重新使用时，应用火焰将吸管外的棉花塞烧去。吸管在使用前火焰灭菌，不易过热。吸管只能使用一次。移

液管前端残留的少量液

体，可用火焰轻轻加温，使空气膨胀而将其压出。整理桌面，

擦拭。83二、基本培养操作技术取材组织分离细胞细胞冻存与复苏细胞运送841.取材取易培养的组织进行培养幼体组织或胚胎组织分化低的组织肿瘤组织2)

注意事项取材之后，最好立即培养。因故不能培养时，应把组织切成1㎜3左右的小块，置于培养液中，4

℃

；存放时间不易超过24h。应严格保持无菌，也要避免受到紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物如 、碘等。85取材为减少污染，对肿瘤组织或其他病理组织，可用500~1000单位/ml的青、链霉素BSS液，漂洗5~10分钟后再做培养处理。外科手术取材时，预先把好的平皿或小瓶送入手术室备用。手术时取一定量组织，置入皿中，立即送培养室进行培养。注意：要详细记录被取培养组织各种情况和组织种类等。86一般体积大于1㎜3的组织块置于培养瓶中后，处于周边的少量细胞即可能生存和生长繁殖，但大部分中心的细胞可因营养

有限而代谢不良，且受纤维成分而难以移出。为获得多量生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开，使细胞解离出来；能达到单细胞水平更好，同时并不使细胞受，细胞能很好生长。2.组织分离8788组织分离方法离心分离法机械分散法消化分散法培养物为血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液时低速500~1000转/min，5~10min分层液分离白细胞根据细胞

不同，使各类细胞相互分开。Rbc为1.092，淋巴细胞和大单核等白细胞为1.070；1)

离心分离法89902)

机械分散法

切割分离法剪切手术刀切割1㎜3把组织置于不锈钢纱网中用钝器压取法机械分散法把组织放入注射器针管中挤压需先剪成小块是在把组织剪成较小体积的基础上，应用生化和化学

进一步分散组织的方法。最后使被处理的组织分散成细胞团或单个细胞，然后加入培养液制成细胞悬液，接种入培养容器中后，细胞容易生长增殖。3)消化分散法911)

胰蛋白酶消化法0.25%、37℃适于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织，传代细胞。5㎜3胚胎类软组织小块20~30min2)

胶原酶消化法适于消化纤维性组织、上皮组织、癌组织最终浓度200U/ml或0.1~0.3mg/ml3)

EDTA消化法常用不含Ca2+、Mg2+的BSS配成0.02%的工作液EDTA0.02%：胰蛋白酶0.25%=1：192程序计数板：用75%

冲洗计数板后，用干净鹿皮擦净，另擦净盖片一张；把该片附在计数板上面，使之微微移向一侧，以便滴加细胞悬液；染色：无菌吸管一支，培养瓶中，轻轻反复吹细胞悬液使细胞重悬均匀后，立即吸细胞悬液少许，向另一离心管中滴入细胞悬液1滴，再滴入台盼蓝染液9滴，混匀，置2~3min;3.

细胞93③加悬液：把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴1~2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖片间空隙中；94954)镜检：镜下观察可见细胞分散各处，健康细胞胞体完整，透明不。计算四个较大方格内的细胞数；压中线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内，计算公式965)

接种培养：一般接种量在1~10×105细胞/ml范围病理教研室：细胞数/ml原悬液

4大格细胞总数10000

稀释倍数44.

细胞冻存①原理在不附加任何条件下冻存细胞时，细胞内外环境中的水会结成冰晶，能导致细胞。但如向细胞培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结之前透出细胞外。冻存在-135℃低温中，能减少冰晶的形成。融化细胞要快，使之迅速通过最易受损的-5~0℃以后，细胞

不受影响，仍能生长增殖。慢冻快融：标准的冷冻速度为-1℃~-12℃/min，当温度下降到-25℃时，下降速度可增至-5~-10℃/min；当-100℃时则可迅速冻入液氮中。9899②冻存程序细胞：选对数生长期细胞；收集细胞前24小时换液一次；计数：令细胞密度达5×106/ml，离心去上清，吸入离心管中；冻存液：先用小牛

9份＋DMSO1份（或甘油）配成10%的DMSO冻存液；一滴一滴地加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬；分装：每安瓿加1.5ml细胞悬液；

：拧紧瓶口；把安瓿缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生 伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存日期；冻存：从把冻存物悬在液氮罐口开始计算，按-1℃/min速度，在30~40min

内，下降到液氮面，再停30min后，直投入液氮中。10010102103复苏方法从液氮罐中取出安瓿；应戴防护眼睛和手套；迅速放入盛有37℃~42℃水的搪瓷罐中，不时摇动，尽快解冻；剪开纱布口袋，取出安瓿，用70%

擦拭后，净化台上打开盖；用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液（或Hanks液），吹打使成细胞悬浮；低速离心（500~1000转/min）5min，取上清后再重复用培养液（或Hanks液）漂洗、离心；加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。1045.

细胞运送①选生长状态良好的细胞，待达到80%或90%汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部（过满易污染），保留少许空间，塞紧瓶塞；空气过多中气泡运动易使细胞脱落；②妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞无严重影响；③到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置37℃培养，次日传代。105三、常规培养法人工

培养基培养法㈠初代培养法优点：具有二倍体遗传性状，在一定程度上能反映体内状态。初代培养细胞是研究

表达的理想系统药物测试等效果也很好两种组织块培养法消化培养法106107处理组织：取自人或动物的新鲜组织1~5㎝3，把组织块置入烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于

含有青霉素的混合液中30~60min；剪切：用眼科剪（或手术刀）把组织块切成2~3㎜大小的块，以便于消化；加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；消化：永恒温水浴，或置入37℃温箱中消化，消化中每隔20min应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好1.

消化培养法4)

分离：见消化液发混浊时，可用吸管吸出

少许消化液在镜下观察，如组织已分散成

细胞团或单个细胞，立即终止消化→通过

适宜不锈钢筛滤过→低速离心消化液5min，的培养液；吸出上清，加入适量含有计数培养1081092.组织块培养法剪切：把组织小块1㎝3，置入烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污→吸净Hanks液→剪成

1㎜3块；摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置入培养瓶中；把组织小块摆布在培养瓶底上，小块相互距离以0.5㎝为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块；轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上；注意翻瓶时勿令组织小块流动，2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸；4)培养：从温箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶（瓶底仍向上），向瓶底角部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块；置温箱中 培养。待细胞从组织块游出数量增多后，再补加培养液。评价：翻转培养瓶的目的是为使组织快微干涸，以利贴附和免从瓶壁流失。组织小块贴壁培养

24小时后，细胞即可从小块边缘向四周游出。110当初代培养成功，细胞增殖成单层后，进而扩展汇合，占满一切空间，此时需要进行分离培养。这一操作称传代或再培养。如拖延传代，细胞会因增殖过度，培养枯竭和代谢产物积累而发生。80%汇合或刚汇合细胞是理想传代阶段。㈡传代培养法111消化法传代步骤：吸出培养液→加消化液2~5min→吸出消化液→加培养液终止消化→吹打制成细胞悬液→计数→分装12病理教研室：113第三节特殊培养法单细胞分离（克隆）培养单细胞分离培养又称细胞克隆（Cell

cloning）,即把单个细胞从群体内分离出来单独培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。初代培养细胞或其它 细胞克隆化的细胞系都具有异质性，细胞经过克隆以后，后裔细胞

群来源于一个共同的祖细胞，即形成所谓纯系，称细胞株（Cell

Line）.细胞株的细胞遗传性状差异减少，生物性质均一，利于实验研究。114115单细胞克隆程序消化→低密度细胞悬液：1~2细胞/ml培养液→接种：向塑料培养板每孔内加0.5ml→标记：培养6~12h后，待细胞下沉贴附于培养板孔底后，观察和标记下含单个细胞的孔。3~4w.待孔内细胞增至500~600个时，可进行分离培养；→分离扩大培养：培养86~96小时观察。挑选生长良好的单克隆细胞孔，先吸出旧培养液，用Kanks液洗1~2次，继加胰蛋白酶少许，待发现细胞变圆时，加入0.1ml含10% 的克隆培养剂，用吸管轻轻吹打，当细胞离开悬浮物后，一并吸入管内，移入另瓶或皿中，再补加一定量克隆培养液→常规培养116117第七节肿瘤细胞培养一、组织培养肿瘤细胞生物学特性二、培养方法118形态和性状生长增殖永生性浸润性异质性细胞遗传其它一、组织培养肿瘤细胞生物学特性119培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态LM：比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。EM：癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则1.

形态和性状不受控增殖有自泌或内泌性产生增殖因子能力能在低接触抑制培养液中生长→形成堆积物2.

生长增殖120永生性在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡浸润性在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有

人工隔膜生长的能力121异质性所有肿瘤都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤细胞内的

有差别的瘤组织。细胞遗传：失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体。其它122肿瘤细胞不易在体外生长的原因123依赖性肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存肿瘤细胞对基质成纤维细胞的依赖肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释→降低生殖力只有干细胞才有强的增殖生长能力可能需求与体内相似的特殊生存条件124二、培养方法（一）要点（二）成纤维细胞的排除法（三）提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施（四）体外培养肿瘤细胞生物学检测肿瘤细胞培养成功的关键在于取材成纤维细胞的排除选用适宜的培养液培养底物125取材要挑选好的部位于4℃＜24h癌性转移淋

或胸腹水取材后尽快培养；可2.

培养基常用RPMI1640、DMEM、Mc-Coy5A按不同细胞需要不同的生长因子3.

成纤维细胞的排除㈠要点126（二）成纤维细胞的排除法机械刮除法反复贴壁法根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁慢的特点，并结合使用不加的营养液，把含两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞互相分离。消化排除法：成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。胶原酶消化法：是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点其他方法127（三）提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施当肿瘤组织或细胞初代接种培养后，常出现的情况完全无细胞游出或移动有细胞游出或移动，但不增殖有细胞增殖，传若干代后停止生长或

死亡传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤

传代细胞系。128129提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施适宜底物生长因子动物体媒介培养（四）体外培养肿瘤细胞生物学检测目的1.

所培养的细胞系的确来源于原体内具有细胞或其他细胞恶性的细胞，而具有肿瘤特异性阐明一般生物学形状130131体外培养肿瘤细胞生物学检测项目形态观察细胞生长增殖：检测细胞生长曲线和分裂指数、倍增时间、细胞周期时间细胞核型分析凝集试验软琼脂培养：检测集落形成能力异体动物接种：致瘤性其它：接种率、特异性，如为腺细胞有

否特殊产物；对正常组织浸润力等试验。第二节无菌操作设施和工作间操作间三、无菌操作箱：简易操作二、无菌操作室缓冲间一、净化工作台：最普遍更衣间大型多人操作四、 和准备区：培养器皿的洗刷、浸酸、、蒸馏水的

等五、温育和

区：放置温箱、冰箱、干热箱、液氮容器等。六、观察和研究区132净化工作台净化工作台：内设鼓风

机，驱动空

气通过高效

率器净化后，让净化后空

气徐徐通过

台面空间，

使工作场地

构成无菌环

境。133第三节

设备最常用的大型必备装置和仪器有一、电热恒温箱二、电热干燥箱三、冰箱四、显微镜五、水纯化装置六、洗刷装置七、抽滤装置八、细胞冷冻

器九、离心机十、天平十一、加样器1341.

电热恒温箱（

CO2温箱）电热恒温箱：CO2温箱，5%CO2可使培养液维持稳定的pH值。培养容器需通气，箱内空气应干净，消毒（紫外线和擦拭）。箱内置水槽以维持箱内温度、湿度和避免培养液蒸发，用无菌水加防腐剂以防生霉。135⒉电热干燥箱电热干热箱：用于烘干和干热

玻璃器皿。160℃，大型的带有鼓风机→温度均匀，

100℃时刻停止鼓风，鼓风与升温同时开始。降到100℃后开箱。1363.

冰箱：4℃、-20℃，清洁4.

显微镜：倒置光显微镜倒置光

显微镜：带有常

焦距相

差装置

和摄影

装置137水纯化装置：三蒸水→去掉有机物洗刷装置：人工、超声波、虹吸系底器（洗涤吸管）138；Zeiss滤器：7.

抽滤装置：培养液抽滤除菌用微孔滤膜8.

细胞冷冻 器：液氮 器，-196℃，每两周需充液氮一次1399.

离心机：1000转左右140后用品贮藏柜141第四节器械用于解剖动物、取材和原代培养切割组织等解剖刀、白内障刀、解剖剪、虹膜剪、镊子、持针器、止血钳等。：煮沸、70%

浸泡、高压142第五节培养器皿一、玻璃瓶皿二、塑料平皿玻璃系统应备用三套培养器皿一套使用中一套在进行刷洗处理一套

后

备用143一、玻璃器皿应选用好、无毒的中性硬质玻璃制成等：500ml、250ml、100ml玻璃瓶培养液、培养瓶优质材料：200ml、100ml、30ml、25ml、15ml瓶口≥1cm3.

培养皿培养和分离组织以及软琼脂培养等直径60mm、120mm1444.

吸管直头：吸加少量培养液、吸细胞悬液、加抗菌素等刻度吸管：移送培养液20ml~1ml短尖头吸管弯头：移液、吸取组织块、摆布组织块管的根端用少许脱脂棉堵塞→防异物5.

离心管离心、漂洗、分离细胞:50ml、15ml、10ml等其它：三较烧瓶、烧杯、量桶、漏斗、试管、注射器、安瓿145二、塑料瓶皿透明平坦、无毒性、利于细胞生长•多孔培养板单细胞克隆、生长曲线测定、药物测试和单克隆抗体等研究用。4孔、6孔、12孔、24孔、96孔等培养皿：30mm、60mm、100mm培养瓶：分25cm（底面积）、75cm146第三节培养用液第一节水和平衡盐溶液第二节天然培养基第三节 培养基第四节

培养基的选择第五节

其它常用液147培养液是维持细胞生存和生长所需的基本溶液培养用液主要分为三类平衡盐溶液（Balanced

Salt

Solution;BSS）天然培养基（Nature

Medium）3.培养基（Synthetic

Medium）BSS：又称生理盐水或盐溶液。具有维持渗透压，调控酸、碱平衡的作用，同时能供给细胞生存所需的能量和无机离子成分；用作洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液。148天然培养基：主要来自动物体液或从组织的成分，其营养性较高，差异较大，在来源上有中分离提取但成分复杂，一定限制。培养基（Synthetic

Medium）：是按人和动物体内细胞所需成分模拟

的、配方恒定的一种较理想的培养基。对动物细胞来说只能维持细胞的生存，要想使细胞生长和增殖，还需补充部分天然培养基。149第一节水和平衡盐溶液一、水组织培养用玻璃三蒸水器皿用二蒸水二、平衡盐溶液（BSS）BSS是从Ringer生理盐水发展起来的，主要由葡萄糖和无机盐组成。BSS中的无机离子不仅是细胞生命所需成分，而且对维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度方面，起着重要作用150BSS内含少量的酚红，作为溶液酸碱度变化的指示剂溶液变酸时呈黄色变碱时呈紫红色中性时呈桃红色•常用的BSS液：Ringer、PBS、Tyrode、Earle、Hanks、Dulbecco、D-Hanks、EagleHanks和Earle是配制各种培养液最常用的基础溶液。：8磅10min高压灭菌，4℃冰箱内保存151第二节天然培养基、组织提取液，如鸡血浆、鸡胚汁等

:含有许多种不可缺少的能维持细胞生长增殖的成分牛胎牛

：从母牛

出的胎牛中分离出

—

—贵小牛

：从刚出生，但尚未哺乳的小牛分离出的中成分：蛋白质、多肽、激素、氨基酸、葡萄糖、酮酸等152第三节

培养基是根据研究和了解细胞所需成分基础上配制的创制出与体内相似的生存环境有固定的组织成分，利于控制实验条件标准化只能维持细胞不死，不能促细胞增殖生长需添加天然培养基一、 培养基的种类二、 培养基的成分三、 培养液的配制四、无 培养基153一、

培养基的种类九种基本培养基：Eagle（MEM）、Dulbecco改良（DMEM）、HamF12、CMRL1066、RPMI1640、199、L15、

、MB752/1MEM（Minimum

Essential

Medium）是常用的培养基之一RPMI1640应用广泛（最初为培养淋巴细胞而设计）Mc-Coy5A：为肉瘤细胞而设计。适用于原代细胞培养、组织活检的细胞、淋巴细胞、特别较难培养的细胞。HamF12：常用单细胞克隆化培养154二、

培养基的成分氨基酸碳水化合物维生素无机离子其它成分155三、

培养液的配制1.培养液的

（干粉）出玻璃三蒸水将水加温至15~30℃把干粉加入水中，搅拌令之溶解加NaHCO3加水至最终量6.

用≤0.22

孔滤膜滤过微m156培养液的种类生长培养液维持细胞增殖，含抗生素（青霉素100单位/ml和链霉素100g

ml

)/维持液为维持细胞缓慢生长或不死的培养液，含量甚少；

2%~5%。如培养正常细胞完全不加

，可维持细胞不死，但时间过长细胞难免

。157四、无

培养基应用：研究细胞生长因子、单克隆抗体的 以及细胞 产物的研究等成分1.

基础培养液HamF12：DMEM培养液=1：1相混合补加15mM的HEPES1.2g/升NaHCO3作为基础溶液。然后根据不同细胞的要求，再补加其它附加成分。用三蒸水以上的蒸馏水，而最后一次蒸镏应在配制前 后立即使用。(key)1582.

附加成分1)

促贴壁附着成分胶原层粘连蛋白纤维粘连蛋白2)

促生长增殖成分胰岛素硒酸钠转铁蛋白3)

蛋白酶抑制物：大豆胰蛋白酶抑制剂→对抗起消化作用的胰蛋白酶的残留无

培养基159160第四节培养基的选择一、经验法二、实验法可用多孔培养板（96孔）做一组克隆形成率和细胞生长曲线看看细胞生长增殖与否。第五节其它常用液一、消化液：分离组织和分散细胞用胰蛋白酶EDTA(二乙胺四乙酸二钠二、pH值调整液HEPES液NaHCO3液三、抗生素液

青霉素100单位/ml培养液链霉素100g

/ml培养液以预防由于操作不慎而产生的微生物污染161第四节

与第一节一、玻璃器皿的二、胶塞的三、塑料器皿的四、包装第二节一、物理

法二、化学

法三、抗生素

液（灭菌）162第一节

的主要目的为清除杂质和微生物，使在器皿内不残留任何影响细胞生长的成分。一、玻璃器皿的浸泡：清水浸泡→附着物软化或被溶掉新瓶：自来水刷洗→5%稀盐酸溶液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。使用后的：立即进入清水中2.

刷洗：用毛刷沾洗涤剂吸底，以除去器皿表面的附着较牢的杂质。1633.浸酸：洗刷不掉的极微量杂质经过硫酸和重铬酸钾清洁液浸泡剂的强氧化作用后，可被除掉。≥6h或过夜。三种不同强度的清洁液重铬酸钾浓硫酸蒸馏水弱液63g1000ml