遗传标记在植物遗传育种中的应用

遗传标记在植物遗传育种中的应用遗传标记（geneticmarker）:指可追踪染色体、染色体某一片段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。遗传标记的类型1.形态学标记（morphologicalmarker）2.细胞学标记(cytologicalmarker)3.生化标记(biochemicalmarker)4.分子标记(molecularmarker)：DNA标记。即植物的外部形态特征。主要包括肉眼可见的外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。

优点：形态标记简单直观、经济方便。

缺点:(1)数量在多数植物中是很有限的。(2)

表现易受环境影响。(3)有一些标记与不良性状连锁。(4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。形态标记在作物遗传育种中的作用是有限的。一、形态标记（亚洲棉×陆地棉）杂种F1与其亲本的形态特征比较

器

官A2G1A2A2G1G1(AD)1(无)(AD)1×(A2G1)遗传表现主茎粗

细较粗细较粗粗较粗近似[AD]1,A2茸

毛少而短多而长多而长少而长多而长偏向G1腺

体(个／cm2)272.590.0110.0066.4A2,G1叶片形

状5裂卵圆3-5裂5裂卵圆裂叶[AD]1,A2,G1大

小较大小较大大较大近似[AD]1,A2色

泽深绿灰绿灰绿绿灰绿偏向G1茸

毛少而短多而长多而长少而短较多而长偏向G1叶

柄长短较短长长近似[AD]1,A2托

叶披针型剑状披针型披针型披针型近似[AD]1,A2腺

体(个／cm2)44.7205.064.00131.0G1苞叶形

状心脏型剑状披针型宽心脏型心脏型近似[AD]1,A2大

小大小较大大较大近似[AD]1,A2苞外蜜腺无有有或无有有近似[AD]1,G1围铃状态紧抱张开张开紧抱张开偏向G1腺

体(个／cm2)75.3182.095.3053.4A2,G1萼片大

小小较大较大大较大近似[AD]1,G1色

泽浅绿浅绿红色黄绿绿超亲上缘形状微波状线状齿长宽齿长宽有齿宽齿长[AD]1,G1互补腺

体(个／cm2)261.7157.5181.80128.0A2，G1花花冠颜色黄色,基部有红斑浅粉红,基部有红斑粉红色,基部有红斑乳白色,基部无红斑深粉红色,基部有红斑超亲型大

小较大小小较大大超亲型花药颜色黄色白色黄色乳白色黄色偏向A2花

药

数较多少较少多较少偏向G1二、细胞学标记即植物细胞染色体的变异。1.染色体数目（单体、缺体、三体、四体）

2.染色体结构（缺失、重复、倒位、易位）

核型、带型（1）核型和核型分析

核型体细胞染色体在光学显微镜下所有可以测定的表型特征的总称。

主要包括染色体的数目与形态结构特征两大方面的内容。染色体的数目包括染色体的基数、多倍体、非整倍体、超数染色体(B染色体,是存在于许多有机体中的额外染色体及染色体断片)。染色体的形态主要包括染色体的绝对大小和相对大小、着丝点和次缢痕以及随体的数目和位置等特征。

核型分析：核型分析就是指对核型的各种特征进行定量和定性的表述。核型分析是分析染色体数目和结构变异的基本手段之一。它在杂种细胞的染色体研究和基因定位，单个染色体的识别等方面具有重要意义。蚕豆的核型分析2n=12，染色体长度：大小臂比：大小

核型分析内容:

1.染色体的数目

2.染色体的形态核型分析的应用:1.

植物的分类研究2.

探讨物种的起源3.

外源染色体的检测与验证杂种的真实性（2）带型

特殊的染料、染色方法，使同一染色体的不同区段呈现不同的染色效果－带型，各种分带技术C、G、Q、R、N的出现，为染色体的精确鉴别提供了一条崭新的途径。人类染色体核型分析（Q带）女男与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。因此到目前为止，真正应用于作物遗传育种研究中的细胞学标记还很少。

利用电泳技术对蛋白质、酶等生物大分子进行鉴定。主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶：具有功能相同而结构和理化性质不同的一类酶。等位酶：同一基因座上的不同等位基因编码的同工酶。种子贮藏蛋白的电泳分析已广泛用于作物品种鉴别和种子纯度鉴定。三、生化标记

生化标记的优点：1.表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响。2.直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。但目前可使用的生化标记数量还相当有限，且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。生化标记的应用1.生化标记在品种纯度和真实性鉴定上的应用2.生化标记在品种的亲缘关系和分类研究上的应用3.生化标记在杂种优势的预测上的应用4.生化标记在抗性鉴定上的应用5.生化标记在品种鉴定上的应用四、分子标记以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记的特点

1.直接以DNA的形式表现，表现稳定。

2.数量多。

3.多态性高。

4.表现为中性，不影响目标性状的表达。

5.许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。

6.成本不太高。分子标记的类型及原理1.以分子杂交为基础的DNA标记技术。限制性片段长度多态性（Restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP），可变数目串联重复序列（Variablenumberoftandemrepeats，VNTR），原位杂交（insituhybridization，ISH）2.以PCR为核心的分子标记技术。RAPD、SSR、STS。3.新型的分子标记。SNP、Indel等。原位杂交PCRMelting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x5’3’3’5’3’5’5’5’3’5’3’5’5’5’5’5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’5’PCRMelting94oCTemperature100050Time5’3’3’5’PCRMelting94oCTemperature100050Time3’5’5’3’HeatPCRMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time3’5’5’3’5’5’Melting94oCPCRMelting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x3’5’5’3’HeatHeat5’5’5’PCRMelting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x3’5’5’3’5’5’5’5’5’5’PCRMelting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x3’5’5’3’5’5’5’5’5’5’HeatHeatPCRMelting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x3’5’5’3’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’PCRMelting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x3’5’5’3’5’5’Fragmentsofdefinedlength5’5’5’5’5’5’5’5’DNABetweenThePrimersDoublesWithEachThermalCycle0CyclesNumber1382412416532664

通过PCR扩增染色体组DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物（10个核苷酸）。1.随机扩增多态性DNA

（RandomAmplificationPolymorphismDNA，RAPD）HistoryShortlyafterKaryMullisinventedthePolymeraseChainReaction(PCR)itwasrealizedthatshortprimerswouldbindtoseverallocationsinagenomeandthuscouldproducemultiplefragments。Williamsetal.(1990)developedRandomAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD)atechniqueusingveryshort10baseprimerstogeneraterandomfragmentsfromtemplateDNAs。RAPDfragmentscanbeseparatedandusedasgeneticmarkersorakindofDNAfingerprint。TechniquesrelatedtoRAPDinclude:DNAAmplificationFingerprinting(DAF)-Caetano-Anolles

etal.(1991)usesveryshort(eightnucleotidelong)primers。ArbitraryPrimedPCR(AP-PCR)-WelshandMcClelland(1990)useslongerprimers,butlowersprimerannealingstringencytogetprimingatmanysites。ComponentsofaPCRandRAPDReactionsRAPDBuffer(containingMg++)-usuallyhighMg++concentrationsareusedloweringannealingstringencyTemplateDNA1shortprimer(10bases)notknowntoannealtoanyspecificpartofthetemplateDNAdNTPsTaqDNAPolymerase(oranotherthermallystableDNApolymerase)PCRBuffer(containingMg++)TemplateDNA2PrimersthatflankthefragmentofDNAtobeamplifieddNTPsTaqDNAPolymerase(oranotherthermallystableDNApolymerase)ModifyingThermalCyclingTwomodificationsmadetotypicalthermalcyclingwhenRAPDisbeingdone:Annealingtemperaturesaregenerallyverylow,around36oC-ThisallowsveryshortprimerstoannealtotemplateDNA。Morethermalcyclesareused,typically45-Thiscompensatesfortheinefficiencywhichresultsfromusingsuchshortprimers.RAPDTemplateDNAPrimerbindstomanylocationsonthetemplateDNAOnlywhenprimerbindingsitesarecloseandorientedinoppositedirectionsotheprimerspointtowardeachotherwillamplificationtakeplaceRAPDTemplateDNAPrimerspointawayfromeachother,soamplificationwon’thappenRAPDTemplateDNAPrimerspointinthesamedirection,soamplificationwon’thappenRAPDTemplateDNAPrimerstoofarapart,soamplificationwon’thappen>2,000basesTemplateDNAPrimersarejusttherightdistanceapart,sofragmentisamplified100-1,500basesRAPDMM23

4

5

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910SeparatedRAPDFragments4mMMgCl21.2UTaq5pMOPA-164mMMgCl20.6UTaq10pMOPA-162mMMgCl21.2UTaq10pMOPA-16Normalconcentrationsareshowninyellowtext.M=AsizestandardLoweringMagnesiumionconcentrationresultsinlossofthelargestfragmentvisibleinlanes2-7RAPDreactionswereruningroupsof3usingthesametemplateandprimer,butvaryingMagnesium,polymeraseandprimerconcentrationsWhichvariablehasthegreatestimpactonfragmentpatterns?单个引物可产生几个多态位点RAPD的优点：1.无需杂交，设计引物也无须知道序列息。2.DNA需要量少，引物便宜，成本较低。3.技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术。4.不同物种间引物通用。缺点：1.大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合子；2.实验重复性较差，结果可靠性较低。2.简单重复序列（SimpleSequenceRepeat，SSR；alsoknownasmicrosatellitesorsimplesequencelengthpolymorphisms，SSLP）一类由1—6个碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，根据核心序列碱基数的不同,可分为单碱基、2碱基、3碱基、4碱基等多种重复型。真核生物基因组普遍存在，呈随机分布,大约每隔10-50kb就存在一个SSR。如（CA）n、（AT）n、（CC）n、（GATA）n不同物种其重复序列及重复单位频率不同。通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNASSR(1-4bp)的搜索，发现：(AT)ｎ最丰富，然后依次是:(A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。同一类内碱基种类不同的SSR，丰度差别很大。DNA复制或修复过程中的分子滑动（slippagereplication）或不等交换所致。微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列（1）SSR标记的原理

根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。⑥凝胶电泳检测建立SSR标记的一般程序①建立基因组DNA的质粒文库②设计并合成探针，筛选重组克隆③阳性克隆DNA插入序列测序④根据SSR两侧序列设计并合成引物⑤PCR扩增2）检测一个单一的多等位基因位点（2）SSR标记的特点1）数量几乎无限，检测出多态性的频率极高3）多数为共显性标记4）重复性高，稳定可靠5）需DNA样品量少，对DNA质量要求亦不苛刻不足：相对的物种专一性；由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用较高，耗时长；实际分析时一般每次只分析单个位点；不同引物退火温度不同，需要探索。*使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列。3.单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms

，SNP）等位基因遗传密码的单碱基差异。基因组中每隔1000个碱基就存在一单碱基差异。一般通过对PCR产物、基因组文库、表达序列标签（EST）文库测序而获得。特点：数量大AChromosomeMapofTomato分子标记的应用1.遗传图谱的构建作图群体的建立1.亲本的选配（1）亲本间的DNA多态性丰富；（2）亲本纯度高；（3）杂交后代可育；2.群体的大小构建分子标记骨架连锁图可用小群体150单株或家系。1903年，Sutton&Boveri分别提出遗传因子位于染色体上（二）图谱构建的理论基础1.染色体遗传理论染色体理论的基本要点①体细胞的染色体成对存在②每条染色体能保持结构恒定性和遗传连续性；③减数分裂同源染色体相互配对，随后发生分离。连锁图谱构建的理论是染色体的交换和重组。AABB×abababABABabABba重组率可用来表示遗传图距，2.基因重组和连锁理论重组型配子的最大比例为50%，变化0-50%。图距单位用厘摩（centi-Mergan,cM）表示，1cM的大小大致符合1%的重组率。成恢448抗稻瘟病基因的连锁遗传分