蛋白质工程制药EPO1课件

蛋白质工程制药

：EPO的改造生物技术制药上游主讲人：Dr.张杰蛋白质工程制药

：EPO的改造生物技术制药上游主讲人：Dr.1蛋白质工程简介

(PROTEINENGINEERING)蛋白质工程简介

(PROTEINENGINEERING)2序论：蛋白质工程简介

蛋白质工程的含义

蛋白质工程的诞生

蛋白质工程的主要内容和基本目的

蛋白质工程与基因工程的区别

主要参考书序论：蛋白质工程简介蛋白质工程的含义3一蛋白质工程的含义

蛋白质工程根据蛋白质的精细结构和生物活力的作用机制之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质或设计制造新的蛋白质。

一蛋白质工程的含义蛋白质工程4二蛋白质工程的诞生

一张蓝图上世纪70年代，特别是80年代初结构生物学揭示了大量蛋白质分子的精确立体结构及其与复杂生物学功能的关系，为设计改造天然蛋白质提供了蓝图一项工具分子遗传学发展了以定点诱变为中心的基因操作技术，为通过基因修饰改造蛋白质提供了工具。二蛋白质工程的诞生一张蓝图51983年，Ulmer在“Science”上发表以“ProteinEngineering‘’(蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为蛋白质工程诞生的标志。蛋白质工程的主要内容和基本目的可以概括为：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。蛋白质工程的诞生的标志1983年，Ulmer在“Science”上发表以“Prot61983年，美国GENE公司的Ulmer在“Science”上发表以“ProteinEngineering‘’(蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为蛋白质工程诞生的标志。(KevinM.Ulmer(Science219:666-671).).ABSTRCTTheprospectsforproteinengineering,includingtherolesofx-raycrystallography,chemicalsynthesisofDNA,andcomputermodellingofproteinstructureandfolding,arediscussed.Itisnowpossibletoattempttomodifymanydifferentpropertiesofproteinsbycombininginformationoncrystalstructureandproteinchemistrywithartificialgenesynthesis.Suchtechniquesofferthepotentialforalteringproteinstructureandfunctioninwaysnotpossiblebyanyothermethod

1983年，美国GENE公司的Ulmer在“Science”7三

蛋白质工程的主要内容和基本目的

以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能关系为基础，通过有控制的基因修饰和基因合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计，构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良，更符合人类需要的新型蛋白质。

三蛋白质工程的主要内容和基本目的以蛋白质分子的结构规律8四

蛋白质工程与基因工程的区别

基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品还是该基因编码的天然存在的蛋白质（第一代）。蛋白质工程则更进一步根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有了人类所需要的优点的蛋白质。天然蛋白质都是通过漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，好比是在实验室里加快了的进化过程，期望能更快、更有效地为人类的需要服务。四蛋白质工程与基因工程的区别9思路不同：基因工程是遵循中心法则，从DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。思路不同：基因工程是遵循中心法则，从DNA→mRNA→蛋白质10五

主要参考书

两本书，一个人1《蛋白质的结构预测与分子设计》

来鲁华著

北京大学出版社,19932《PROTEINSTRUCTURE》Section1.Primarystructure,secondarymotifs,tertiaryarchitecture,andquaternaryorganizationJannetteCareyandVanessaHanleyPrincetonUniversityPrinceton,NJ08544-1009五主要参考书两本书，一个人11蛋白质工程制药--EPO1课件123来鲁华教授，女，博士，北京大学化学学院长江特聘教授，北京大学理论生物学中心常务副主任，分子动态与稳态国家重点实验室主任，国家重点基础研究发展规划项目首席科学家，国家杰出青年基金获得者。1984年本科毕业于北京大学化学系，1989年在北京大学化学系获博士学位。1998-1999年期间为美国加州大学伯克莱分校伯克莱学者。承担过国家自然科学青年基金，国家杰出青年基金，攀登计划项目，八六三项目等。获得过国家自然科学三等奖1次，求是基金会青年科学家奖励，中国科协青年科技奖等。发表论文近百篇，其中SCI收录论文80余篇。来鲁华教授从1987年开始从事化学与生物学的交叉研究，特别是生物信息学研究，在蛋白质结构预测及分子设计方面做过大量工作，近年的主要工作方向为蛋白质-蛋白质相互作用研究，发展了用于蛋白质-蛋白质相互作用定量研究的平均势方法。

4该领域的其他著名学者：北大的顾孝诚,北方基因中心于军、杨焕明;清华的李衍达、饶子和;军科院贺福初、黄培堂、;协和的沈岩;瑞金医院的陈竺、

生化所的丁达夫、

上海生物信息中心的赵国屏等3来鲁华教授，女，博士，13六

小结

蛋白质工程的主要内涵及基本目的；

蛋白质工程与基因工程的主要区别。六小结14思考题：酶工程与蛋白质工程有什么区别？

提示：酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。

思考题：酶工程与蛋白质工程有什么区别？提示：15蛋白质工程的主要内容和基本目的可以概括为：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。蛋白质工程的主要内容和基本目的可以概括为：162．两个主要的哺乳动物细胞表达系统在哺乳动物细胞中有两个基因表达系统可供选择，一是瞬时表达系统，一是稳定表达系统。瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h到7天。稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要1～2个月的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中，这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统在哺乳动物细胞中有两个基17噬菌体显示(Phagedisplay)对EPO分子片段的筛选关于噬菌体显示的表达载体噬菌体显示技术的操作EPO-EPOREMP-EBP

噬菌体显示(Phagedisplay)对EPO分子片段的筛18GeorgeP.SmithValeryA.PetrenkoGeorgeP.SmithValeryA.Petre19GeorgeP.Smithb.in1941.Bsc.degreeinbiologyin1963,aPh.D.inbacteriologyandimmunologyfromHarvardUniversityin1970.AfterapostdoctoralfellowshipwithOliverSmithiesattheUniversityofWisconsin,hejoinedthefacultyoftheDivisionofBiologicalSciencesattheUniversityofMissouriinColumbiain1975asAssistantProfessorandsincehasbeenpromotedtoAssociateandFullProfessor.Hehaspublished35papersinareasincludingantibodystructureandevolution,theevolutionofrepeatedDNAsequences,genomics,andthebiologyofthefilamentousphage.Itisfromhisinterestinthefilamentousphagethattheideaofphagedisplayevolved.ValeryA.Petrenkob.In1949,haspublishedover70papersandhas13inventionsandpatents.GeorgeP.Smith20OverviewThepast10yearshasseenremarkableprogressinourunderstandingofthereplicationcycleoftheM13phageThelifecycleisverysophisticatedInitialinfectiontransfersgeneticmaterialintohostwithlittlemembranedisruption.LateinfectionstagesperturbhostmembraneforreleaseofvirionsM13isnon-lyticOverviewThepast10yearshas21M13StructureDimensions:6.5nmindiameterLengthdependantongenomebutwildtypeapproximately930nmMass16.3MDofwhich87%comprisedofproteinGenome:SinglestrandedcircularDNAmolecule,covalentlyclosedHousedinaflexibleproteincylinderM13StructureDimensions:22M13StructureGenomeorientation78NucleotidehairpinregioncalledthepackagingsignallocatedatpVII/pIXterminusM13StructureGenomeorientatio23M13StructureProteinsLengthofphagecylindercomprises2700copiesofthe50-amino-acidmajorcoatproteinpVIIIAtoneterminus:5copiesof33AAresiduepVII5copiesof32AAresiduepIXAtoneterminus:5copiesof406AAresiduepIII5copiesof112AAresiduepVIM13StructureProteins24M13GeneFunctionsM13GeneFunctions25PhageLifeCycleInfectionprocessMultistepRequiresbacterialFconjugativepilusandbacterialTolQ,R&Acytoplasmicmembraneproteins.InitiatedbybindingofFpilustophagepIIIN2domain.Pilusretracts(triggeredbyphage???)bringingpIIIterminustotheperiplasm.N2bindingreleasesN1forinteractionwithbacterialTolAPhageFPilusOMCMTolQTolATolRPeriplasmN1N2PhageLifeCycleInfectionproc26PhageLifeCycleInfectionprocesscontSubsequentstepsunclearpVIII,pVII&pIXdisassembleintocytoplasmicmembraneasphageDNAistranslocatedintocytoplasm?OnceinthemembranepVIIIjoinspoolofnewlysynthesisedpVIIIfornewparticleformation.PhageLifeCycleInfectionproc27PhageLifeCycleReplicationComplementary(-)DNAstrandtoviral(+)DNAsynthesisedbybacterialenzymesGyrase,atopoisomerase,catalysesformationofdsDNAsupercoilscalledthereplicativeform(RF)The(-)strandoftheRFistranscribedandtranslatedintothephageproteinsThepIIproteinnicksthe(+)strandRFintheintergenicregiontoproduceaprimerforsynthesisofanewviralstrandpIIcircularisesthedisplaced(+)strandandconvertsittoasupercoileddsDNA;apoolofprogenydsDNAisthusformedAtacriticalconcentrationofpV,dimersofpVbindtothedsDNApreventingfurtherdsDNAproductionbutallowingsynthesisof(+)DNAPhageLifeCycleReplication28PhageLifeCycleReplicationpVdimersbindtothe(+)strandandwrapsitupA78nucleotidehairpinregionoftheDNAremainspVfreeandactsasapackagingsignalinitiatingthephageassemblyreactionpXisalsocytoplasmicallylocatedandisrequiredforreplicationbutitsroleisunclearAlloftheotherphageproteinsaresynthesisedandinsertedintothebacterialmembranePhageLifeCycleReplication29PhageLifeCycleAssemblyOccursatbacterialadhesionzonelikesitespVdimersareremovedandthecapsidproteinsareassembledaroundtheDNAasitisextruded.TheprocessisinitiatedbyinteractionofpVII,pIXandpVIIIwiththeDNApackagingsignalUnknownhowpVIandpIIIareaddedatendofvirionPhageLifeCycleAssembly30PhageReplicationSchematicDNAReplicationProteinsCapsid&Assembly

Proteins(+)+++/-pVPhageAssemblySiteFPilusPhageDNAPhageReplicationSchematicDNA31PhageDisplayLibrariesPhagedisplayisapowerfultoolthatextendstherangeofmoderncombinatorialscreeningtechniques,allowingthediscoveryandcharacterisationofproteinsthatinteractwithadesiredtarget.Phagedisplayisasysteminwhichaproteinisdisplayedonthesurfaceofaphageasafusionwithoneofthecoatproteinsofthevirus.TheDNAthatencodesthisproteinishousedwithinthevirion.BycloninglargenumbersofDNAsequencesintothephage,displaylibrariesareproducedwitharepertoireofmanybillionsofuniquedisplayedproteins.PhageDisplayLibrariesPhaged32PhageDisplayLibrariesUsingaprocessofbiopanning,onecanrescuephagethatdisplayaproteinthatspecificallybindstoatargetofinterest.Briefly,asimplemethodforbiopanninginvolvescoatingaplatewiththetargetandincubatingthelibraryontheplatetoallowphagedisplayingacomplementaryproteintothetargettobind.Non-bindingphagearethenwashedawayandthosethatareboundareeluted.Infectionofbacteriawiththebindingphageresultsinphageamplification.Successiveroundsofbiopanningenrichthepoolofphage,withclonesthatspecificallybindthetarget.PhageDisplayLibrariesUsinga33PeptidePhageDisplaypVIIIPeptideDisplayDisplayoneverycopyofpVIIIlimitedto6-8aminoacidsbutarepotentiallyimmunogenicandsusceptibletoproteasesHybridvirionsinwhich80%ofpVIIIarewild-typeallowlargepeptidesandproteinstobedisplayedpIIIPeptideDisplayOnlyfivemoleculescanbedisplayedperphageLargeinsertspackagewellbutreduceinfectivityOvercomebydisplayingpeptideononlyonepIIImolecule=phagemidsystem;pIIIwildtypeencodedbyhelperphage,displayedpeptideencodedbyphagemidPeptidePhageDisplaypVIIIPep34Phagedisplaymethod(1)M13(afilamentousphagecontainingss-DNAencasedinaproteincoat):containsfivecoatproteins,twoofwhicharegVIIIp(geneVIIIprotein)andgIIIp(geneIIIprotein).Phagedisplaymethod(1)M13(a35Phagedisplaymethod(2)Phagedisplaymethod(2)36Phagedisplaymethod(2):(contd.)Phagedisplaymethod(2):(con37Phagedisplaymethod(2):(contd.)Phagedisplaymethod(2):(con38PhagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptorAgonists:whichmimicthefunctionofahormonebybindingtoitsreceptorandcausingthenormalresponse.Antagonists:whichbindtothereceptorbutdonotactivatehormone-inducedeffectsPhagedisplayofrandompeptid39Phagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptor(contd.)Toidentifypeptidesorsmallmoleculeswhicheitherinhibitorstimulatehormonefunction.Thehot-spotprinciple:asmallnumberofresiduesatabindinginterfacecontributemostofthebindingenergy.Erythropoietin(EPO):acytokinehormonewhichstimulatesformationofredbloodcells.EPOR:erythropoietinreceptorEBP:extra-cellulardomainofEPORPhagedisplayofrandompeptid40Phagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptor(contd.)NicholasWrightonandcoworkersusedthephagedisplaymethodstoisolatea20residuepeptide,calledEMP1,whichmimicstheactivityofEPObypromotingdimerizationandactivationofEPOR.EMPIwasselectedbytwocyclesofphagedisplay.Phagedisplayofrandompeptid41Phagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptor(contd.)First,randompeptidelibrariesofthesequenceCX8CweredisplayedasgVIIIpfusions.MultivalentgVIIIproteinfusiondisplaypermittedselectionofweakbindersbyavidity(multiple)bindingtoimmobilizeddimersofEBP.TheseweaklybindingpeptideswereexpandedtotheformofX5CX8CX3andparticularlyrandomizedintheX8residues.FusionofthisnewlibrarytogIIIpyieldedalowervalency化合价ofdisplayandallowedselectionoftightbinders.Phagedisplayofrandompeptid42EMP1,isolatedfromthislibrary,boundtoEBPwithaKdof0.2MandstimulatedEPORactivityinvivoEachpeptidemonomerformsahairpin,stabilizedbyanintramoleculardisulfidebondEMP1,isolatedfromthislibra43蛋白质工程制药--EPO1课件44ConclusionPhagedisplayisarapidandeffectivetoolforthediscoveryofbiologicalmoleculesthatmayprovideopportunitiesfortherapeutics,diagnosticsandtargetingagents.Currentlyweareexploitingtheuseofphagedisplaylibrariestotargetthemicrovasculatureoftheblood-brainbarrierandthelungepitheliumusingarangeofprimaryandimmortalisedcelllinestodiscovernoveltargetingagents.Toaccomplishthisweareutilising: ApeptidestrategywiththeNEBPhD-C7Cpeptidekit AmonoclonalantibodystrategywiththeMRCTomlinson scFVLibraryConclusionPhagedisplayisar45蛋白质工程制药

：EPO的改造生物技术制药上游主讲人：Dr.张杰蛋白质工程制药

：EPO的改造生物技术制药上游主讲人：Dr.46蛋白质工程简介

(PROTEINENGINEERING)蛋白质工程简介

(PROTEINENGINEERING)47序论：蛋白质工程简介

蛋白质工程的含义

蛋白质工程的诞生

蛋白质工程的主要内容和基本目的

蛋白质工程与基因工程的区别

主要参考书序论：蛋白质工程简介蛋白质工程的含义48一蛋白质工程的含义

蛋白质工程根据蛋白质的精细结构和生物活力的作用机制之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质或设计制造新的蛋白质。

一蛋白质工程的含义蛋白质工程49二蛋白质工程的诞生

一张蓝图上世纪70年代，特别是80年代初结构生物学揭示了大量蛋白质分子的精确立体结构及其与复杂生物学功能的关系，为设计改造天然蛋白质提供了蓝图一项工具分子遗传学发展了以定点诱变为中心的基因操作技术，为通过基因修饰改造蛋白质提供了工具。二蛋白质工程的诞生一张蓝图501983年，Ulmer在“Science”上发表以“ProteinEngineering‘’(蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为蛋白质工程诞生的标志。蛋白质工程的主要内容和基本目的可以概括为：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。蛋白质工程的诞生的标志1983年，Ulmer在“Science”上发表以“Prot511983年，美国GENE公司的Ulmer在“Science”上发表以“ProteinEngineering‘’(蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为蛋白质工程诞生的标志。(KevinM.Ulmer(Science219:666-671).).ABSTRCTTheprospectsforproteinengineering,includingtherolesofx-raycrystallography,chemicalsynthesisofDNA,andcomputermodellingofproteinstructureandfolding,arediscussed.Itisnowpossibletoattempttomodifymanydifferentpropertiesofproteinsbycombininginformationoncrystalstructureandproteinchemistrywithartificialgenesynthesis.Suchtechniquesofferthepotentialforalteringproteinstructureandfunctioninwaysnotpossiblebyanyothermethod

1983年，美国GENE公司的Ulmer在“Science”52三

蛋白质工程的主要内容和基本目的

以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能关系为基础，通过有控制的基因修饰和基因合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计，构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良，更符合人类需要的新型蛋白质。

三蛋白质工程的主要内容和基本目的以蛋白质分子的结构规律53四

蛋白质工程与基因工程的区别

基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品还是该基因编码的天然存在的蛋白质（第一代）。蛋白质工程则更进一步根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有了人类所需要的优点的蛋白质。天然蛋白质都是通过漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，好比是在实验室里加快了的进化过程，期望能更快、更有效地为人类的需要服务。四蛋白质工程与基因工程的区别54思路不同：基因工程是遵循中心法则，从DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。思路不同：基因工程是遵循中心法则，从DNA→mRNA→蛋白质55五

主要参考书

两本书，一个人1《蛋白质的结构预测与分子设计》

来鲁华著

北京大学出版社,19932《PROTEINSTRUCTURE》Section1.Primarystructure,secondarymotifs,tertiaryarchitecture,andquaternaryorganizationJannetteCareyandVanessaHanleyPrincetonUniversityPrinceton,NJ08544-1009五主要参考书两本书，一个人56蛋白质工程制药--EPO1课件573来鲁华教授，女，博士，北京大学化学学院长江特聘教授，北京大学理论生物学中心常务副主任，分子动态与稳态国家重点实验室主任，国家重点基础研究发展规划项目首席科学家，国家杰出青年基金获得者。1984年本科毕业于北京大学化学系，1989年在北京大学化学系获博士学位。1998-1999年期间为美国加州大学伯克莱分校伯克莱学者。承担过国家自然科学青年基金，国家杰出青年基金，攀登计划项目，八六三项目等。获得过国家自然科学三等奖1次，求是基金会青年科学家奖励，中国科协青年科技奖等。发表论文近百篇，其中SCI收录论文80余篇。来鲁华教授从1987年开始从事化学与生物学的交叉研究，特别是生物信息学研究，在蛋白质结构预测及分子设计方面做过大量工作，近年的主要工作方向为蛋白质-蛋白质相互作用研究，发展了用于蛋白质-蛋白质相互作用定量研究的平均势方法。

4该领域的其他著名学者：北大的顾孝诚,北方基因中心于军、杨焕明;清华的李衍达、饶子和;军科院贺福初、黄培堂、;协和的沈岩;瑞金医院的陈竺、

生化所的丁达夫、

上海生物信息中心的赵国屏等3来鲁华教授，女，博士，58六

小结

蛋白质工程的主要内涵及基本目的；

蛋白质工程与基因工程的主要区别。六小结59思考题：酶工程与蛋白质工程有什么区别？

提示：酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。

思考题：酶工程与蛋白质工程有什么区别？提示：60蛋白质工程的主要内容和基本目的可以概括为：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。蛋白质工程的主要内容和基本目的可以概括为：612．两个主要的哺乳动物细胞表达系统在哺乳动物细胞中有两个基因表达系统可供选择，一是瞬时表达系统，一是稳定表达系统。瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h到7天。稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要1～2个月的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中，这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统在哺乳动物细胞中有两个基62噬菌体显示(Phagedisplay)对EPO分子片段的筛选关于噬菌体显示的表达载体噬菌体显示技术的操作EPO-EPOREMP-EBP

噬菌体显示(Phagedisplay)对EPO分子片段的筛63GeorgeP.SmithValeryA.PetrenkoGeorgeP.SmithValeryA.Petre64GeorgeP.Smithb.in1941.Bsc.degreeinbiologyin1963,aPh.D.inbacteriologyandimmunologyfromHarvardUniversityin1970.AfterapostdoctoralfellowshipwithOliverSmithiesattheUniversityofWisconsin,hejoinedthefacultyoftheDivisionofBiologicalSciencesattheUniversityofMissouriinColumbiain1975asAssistantProfessorandsincehasbeenpromotedtoAssociateandFullProfessor.Hehaspublished35papersinareasincludingantibodystructureandevolution,theevolutionofrepeatedDNAsequences,genomics,andthebiologyofthefilamentousphage.Itisfromhisinterestinthefilamentousphagethattheideaofphagedisplayevolved.ValeryA.Petrenkob.In1949,haspublishedover70papersandhas13inventionsandpatents.GeorgeP.Smith65OverviewThepast10yearshasseenremarkableprogressinourunderstandingofthereplicationcycleoftheM13phageThelifecycleisverysophisticatedInitialinfectiontransfersgeneticmaterialintohostwithlittlemembranedisruption.LateinfectionstagesperturbhostmembraneforreleaseofvirionsM13isnon-lyticOverviewThepast10yearshas66M13StructureDimensions:6.5nmindiameterLengthdependantongenomebutwildtypeapproximately930nmMass16.3MDofwhich87%comprisedofproteinGenome:SinglestrandedcircularDNAmolecule,covalentlyclosedHousedinaflexibleproteincylinderM13StructureDimensions:67M13StructureGenomeorientation78NucleotidehairpinregioncalledthepackagingsignallocatedatpVII/pIXterminusM13StructureGenomeorientatio68M13StructureProteinsLengthofphagecylindercomprises2700copiesofthe50-amino-acidmajorcoatproteinpVIIIAtoneterminus:5copiesof33AAresiduepVII5copiesof32AAresiduepIXAtoneterminus:5copiesof406AAresiduepIII5copiesof112AAresiduepVIM13StructureProteins69M13GeneFunctionsM13GeneFunctions70PhageLifeCycleInfectionprocessMultistepRequiresbacterialFconjugativepilusandbacterialTolQ,R&Acytoplasmicmembraneproteins.InitiatedbybindingofFpilustophagepIIIN2domain.Pilusretracts(triggeredbyphage???)bringingpIIIterminustotheperiplasm.N2bindingreleasesN1forinteractionwithbacterialTolAPhageFPilusOMCMTolQTolATolRPeriplasmN1N2PhageLifeCycleInfectionproc71PhageLifeCycleInfectionprocesscontSubsequentstepsunclearpVIII,pVII&pIXdisassembleintocytoplasmicmembraneasphageDNAistranslocatedintocytoplasm?OnceinthemembranepVIIIjoinspoolofnewlysynthesisedpVIIIfornewparticleformation.PhageLifeCycleInfectionproc72PhageLifeCycleReplicationComplementary(-)DNAstrandtoviral(+)DNAsynthesisedbybacterialenzymesGyrase,atopoisomerase,catalysesformationofdsDNAsupercoilscalledthereplicativeform(RF)The(-)strandoftheRFistranscribedandtranslatedintothephageproteinsThepIIproteinnicksthe(+)strandRFintheintergenicregiontoproduceaprimerforsynthesisofanewviralstrandpIIcircularisesthedisplaced(+)strandandconvertsittoasupercoileddsDNA;apoolofprogenydsDNAisthusformedAtacriticalconcentrationofpV,dimersofpVbindtothedsDNApreventingfurtherdsDNAproductionbutallowingsynthesisof(+)DNAPhageLifeCycleReplication73PhageLifeCycleReplicationpVdimersbindtothe(+)strandandwrapsitupA78nucleotidehairpinregionoftheDNAremainspVfreeandactsasapackagingsignalinitiatingthephageassemblyreactionpXisalsocytoplasmicallylocatedandisrequiredforreplicationbutitsroleisunclearAlloftheotherphageproteinsaresynthesisedandinsertedintothebacterialmembranePhageLifeCycleReplication74PhageLifeCycleAssemblyOccursatbacterialadhesionzonelikesitespVdimersareremovedandthecapsidproteinsareassembledaroundtheDNAasitisextruded.TheprocessisinitiatedbyinteractionofpVII,pIXandpVIIIwiththeDNApackagingsignalUnknownhowpVIandpIIIareaddedatendofvirionPhageLifeCycleAssembly75PhageReplicationSchematicDNAReplicationProteinsCapsid&Assembly

Proteins(+)+++/-pVPhageAssemblySiteFPilusPhageDNAPhageReplicationSchematicDNA76PhageDisplayLibrariesPhagedisplayisapowerfultoolthatextendstherangeofmoderncombinatorialscreeningtechniques,allowingthediscoveryandcharacterisationofproteinsthatinteractwithadesiredtarget.Phagedisplayisasysteminwhichaproteinisdisplayedonthesurfaceofaphageasafusionwithoneofthecoatproteinsofthevirus.TheDNAthatencodesthisproteinishousedwithinthevirion.BycloninglargenumbersofDNAsequencesintothephage,displaylibrariesareproducedwitharepertoireofmanybillionsofuniquedisplayedproteins.PhageDisplayLibrariesPhaged77PhageDisplayLibrariesUsingaprocessofbiopanning,onecanrescuephagethatdisplayaproteinthatspecificallybindstoatargetofinterest.Briefly,asimplemethodforbiopanninginvolvescoatingaplatewiththetargetandincubatingthelibraryontheplatetoallowphagedisplayingacomplementaryproteintothetargettobind.Non-bindingphagearethenwashedawayandthosethatareboundareeluted.Infectionofbacteriawiththebindingphageresultsinphageamplification.Successiveroundsofbiopanningenrichthepoolofphage,withclonesthatspecificallybindthetarget.PhageDisplayLibrariesUsinga78PeptidePhageDisplaypVIIIPeptideDisplayDisplayoneverycopyofpVIIIlimitedto6-8aminoacidsbutarepotentiallyimmunogenicandsusceptibletoproteasesHybridvirionsinwhich80%ofpVIIIarewild-typeallowlargepeptidesandproteinstobedisplayedpIIIPeptideDisplayOnlyfivemoleculescanbedisplayedperphageLargeinsertspackagewellbutreduceinfectivityOvercomebydisplayingpeptideononlyonepIIImolecule=phagemidsystem;pIIIwildtypeencodedbyhelperphage,displayedpeptideencodedbyphagemidPeptidePhageDisplaypVIIIPep79Phagedisplaymethod(1)M13(afilamentousphagecontainingss-DNAencasedinaproteincoat):containsfivecoatproteins,twoofwhicharegVIIIp(geneVIIIprotein)andgIIIp(geneIIIprotein).Phagedisplaymethod(1)M13(a80Phagedisplaymethod(2)Phagedisplaymethod(2)81Phagedisplaymethod(2):(contd.)Phagedisplaymethod(2):(con82Phagedisplaymethod(2):(contd.)Phagedisplaymethod(2):(con83Phagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedag