享廷顿蛋白结合蛋白1对胰岛β细胞胰岛素分泌和L型钙通道Cav12胞内运输的影响

享廷顿蛋白结合蛋白1对胰岛p细胞胰岛素分泌和L型钙通道Cav1.2胞内运输的影响亨廷顿蛋白结合蛋白1(huntingtin-associatedprotein1,HAP1) 是最早发现的能与亨廷顿病(Huntington'sdisease,HD)基因产物亨廷顿蛋白(huntingtin,Htt)相互结合的蛋白质。HAP1具有HAP1A和HAP1B两种剪接体，既在神经元中表达，也在分泌含氮激素激内分泌细胞中表达。在神经元内,HAP1参与细胞器和分子的运输、膜受体转运与再循环。 HAP1可通过与驱动蛋白(kinesin)轻链(KLC)和重链(KHC)、驱动蛋白家族运动蛋白5(KIF5)、动力蛋白激活蛋白复合物的亚单位P150Glued等微管相关运动蛋白相互作用，参与或调控神经元内囊泡、神经营养因子、受体等基于微管的运输。HAP1的胞内运输功能受自身磷酸化程度的影响，HAP1A羧基末端PKA磷酸化位点(T598)的磷酸化能显著减少其与P150Glued和KLC的结合，抑制其参与的胞内运输活动，去磷酸化后则相反。HAP何能通过神经元内物质运输对神经元的生长发育、存活、递质释放起调节作用。在大鼠、小鼠胰岛内，HAP1选择性表达于分泌胰岛素的P细胞内：MIN6.NIT-1、INS-1等胰岛P细胞瘤细胞系也表达HAP1抑制MIN6和NIT-1细胞的HAP俵达能显著抑制其胰岛素的分泌；胰岛P细胞HAP1选择性敲除的小鼠，其糖耐量能力下降，葡萄糖刺激后的胰岛素分泌减少。由此表明，HAP1与胰岛P细胞胰岛素的分泌有关。电位门控钙通道(voltagegatedcalciumchennel,Cav)参与调控葡萄糖刺激引起的胰岛P细胞胰岛素的分泌，葡萄糖浓度的升高可促进P细胞对葡萄糖的摄入和代谢，增加ATP-ADM转化和抑制K+1道活性，使细胞膜去极化并由此使Cav开放，大量钙离子内流最终引发胰岛素的分泌。P细胞主要表达 Cav1.2和Cav1.3两种亚型的L型钙通道，其中Cav1.2在P细胞胰岛素的分泌中发挥重要作用。Cav与多种离子通道一样，在粗面内质网上进行合成组装后，以膜小泡的形式进入高尔基复合体进一步修饰加工形成囊泡，然后转运至细胞膜，表达在细胞膜的特定区域。Cav的细胞膜表达量决定.Ca2+内流的大小与动力学。HAP1是否通过影响钙通道的胞内运输、细胞膜表达而影响胰岛素的分泌，日前未见报道。有关调节钙通道膜表达的机制研究表明，肿瘤抑制因子eIF3e（eukaryotictranslationinitiationfactor3subunitE）通过与Cav1.2的结合，调控神经细胞和胰岛P细胞内Cavl.2的双向运输，即从胞质向细胞膜的转运（膜表达）和从细胞膜向胞质内的转运（内在化’internalization），从而维持胞内钙离子的稳态。elF3e对Cav1.2通道蛋白的转运和膜表达的调节作用提示HAP1可能通过与elF3e蛋白相互作用，调节胰岛P细胞内钙通道的运输，进而影响胰岛素的分泌。本研究在进一步证实HAP1影响胰岛p细胞胰岛素分泌的基础上，观察了HAP1表达水平对？细胞Cav1.2活性、外钙内流、Cav1.2膜表达的影响，并分析了P细胞内HAP1和eIF3e之间的相互作用。、HAP1促进胰岛p细胞胰岛素的分泌为了进一步证明HAP1对胰岛p细胞胰岛素分泌的调节作用，对HAP1基因敲除小鼠血浆胰岛素含量和沉默HAP1对大鼠胰岛p细胞瘤细胞INS-1细胞胰岛素分泌能力的影响进行了检测。放射免疫分析显示，HAP1基因敲除小鼠血浆中胰岛素含量明显降低； 全细胞膜片钳膜电容检测显示，与野生型和转染表达对照质粒的INS-1细胞比较，在转染表达HAP1-SiRNA勺INS-1细胞中，无论是即刻释放库（immediatelyreleasablepool,IRP)分泌还是快速释放库(rapidiyreleasablepool,RRP)分泌均明显降低；pHluorin是一种pH敏感荧光蛋白，将囊泡标记蛋白VAMP2-pHluorin的表达质粒与HAP1-SiRNA质粒或对照质粒共转染INS-1细胞后，利用共聚焦活细胞动态成像技术检测发现，沉默HAP1表达后,INS-1细胞胰岛素的囊泡分泌事件次数、分泌持续时间和分泌事件强度等均明显减少。以上结果进一步证实了HAP1对胰岛P细胞的胰岛素分泌具有促进作用，抑制HAP1的表达可抑制胰岛素的分泌。二、沉默HAP1导致P细胞L型钙电流减小和外钙内流减少钙离子内流可引发和调控胰岛素的分泌。为了探讨HAP1是否通过影响胰岛P细胞L型钙通道和钙离子内流而影响胰岛素的分泌，继而检测了沉默HAP1对INS-1细胞L型钙电流和钙离子内流的影响。采用膜片钳全细胞电压钳检测技术，利用钡离子替代钙离子，记录INS-1细胞L型钙电流。INS-1细胞分别瞬转HAP1沉默质粒和对照质粒，48h后分别记录两实验组细胞L型钙电流的变化。结果显示,HAP1低表达后,INS-1细胞L型钙电流明显减小。进一步应用Fura-2定量测定胞内钙技术检测INS-1细胞胞内钙离子浓度显示，高K+刺激条件下，野生型或转染对照质粒的INS-1细胞内钙离子浓度迅速出现大幅度的上升，而转染表达HAP1-SiRNA勺INS-1细胞在高K+刺激后只表现出一个小幅度的钙离子浓度的提高。由此证明,HAP1可通过调节胰岛P细胞L型钙通道而影响其介导的钙离子内流，从而影响胰岛素的分泌。三、沉默HAP1减少Cavl.2通道的膜表达钙通道膜表达量是影响钙电流和钙离子浓度大小的因素之一。沉默HAP1后INS-1细胞的L型钙电流和外钙内流都明显下降提示，HAP1可能影响胰岛P细胞L型钙通道的膜表达。离子通道膜表达的多少一方面与其总的表达水平有关，另一方面与其从胞质向膜上转运有关。我们首先观察了沉默HAP1对INS-1细胞Cav1.2的mRNA表达水平的影响。两组INS-1细胞分别转染HAP1沉默质粒和对照质粒，48h后用RT-PCF方法进行检测,发现对照组和沉默组Cavl.2的mRN表达水平没有明显差异，由此证明HAP1对P细胞Cav1.2的表达无影响。为了探讨HAP1是否通过影响钙通道从胞质向细胞膜的转运而影响其膜表达，应用免疫荧光技术分析了HAP1对INS-1细胞Cavl.2通道囊泡膜转运和膜表达的影响。将胞内N末端连接有YFR胞外n区的S5和H5环处连接一个HA肽段的L型钙通道融合蛋白YFP-Cav1.2-HA表达质粒及其辅助亚基（P1b+a2S表达质粒与HAP1-SiRNA£粒或对照质粒共转染INS-1细胞后，在不用TritonX-100处理条件下用HA抗体进行免疫荧光标记显示，沉默HAP1可显著降低INS-1细胞膜上HA免疫荧光强度，表明HAP1参与了Cav1.2钙通道蛋白的从胞质向细胞膜的运输。四、HAP1和elF3e两个蛋白之间的相互作用为了探讨HAP1通过对P细胞内Cav1.2胞内运输具有调控作用的eIF3e影响p细胞内Cav1.2膜表达的可能性，对HAP1与eIF3e之间的相互作用进行了分析。对INS-1细胞内源性HAP1和eIF3e的免疫荧光双标检测显示,两种蛋白在胞质内的定位分布完全相同。在HEK293细胞和INS-1细胞中，共转染表达的eIF3e-CFP和HAP1A-YF除少量呈弥散分布外，大多呈现颗粒状分布，并在颗粒中共定